Nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào của Gossypol và Plumbagin trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy In Vitro

Nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào của Gossypol và Plumbagin trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy In Vitro Nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào của Gossypol và Plumbagin trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy In Vitro Nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào của Gossypol và Plumbagin trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy In Vitro Nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào của Gossypol và Plumbagin trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy In Vitro

Trang 1

DAI HOC QUOC GIA TP HO CHI MINH

DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN

DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC CAP TRUONG 2002-2003 BAO CAO NGHIEM THU

Tén dé tai:

NGHIEM CUU HOAT TINH KHANG PHAN BAO CUA GOSSYPOL VA PLUMBAGIN TREN CAC DONG TE BAO UNG THU NUOI CAY JIN VITRO

Cán bộ thực hiện:

CN Nguyễn Đăng Quân (Chủ nhiệm đề tài)

TS Hồ Huỳnh Thùy Dương (Cố vấn chuyên mơn)

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 2 năm 2003

Trang 2

MUC LUC

Phan i DAT VANDE 000 nh 1

Phan Ul: TONG QUAN TAILIBU | ccc cece cece co 2

I Những khái niệm cơ ban vé bénh ung thu ee 2

HH Đại cương về cơ chế sinh bệnh ung thử 5 HH Đại cương về thuốc chữa ung thứ eee 9

1V„ Đại cương về nuơi cấy tế bào động VẬU, cu co, 11

Phan I: VAT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP l§

m7 cece cece cece cee ec teceeeeevertvrveserees "

Du cáo BAỆNỤMẠỌIaaaaaaRạARAA 19

Phần TY: KẾT QUÁ ~ BIỆN LUẬN 22

1 Tác động của goosypol lên tế bào RD và HEp2 22

1I Tác động của plumbagin lên tế bào RD và HEp2 24

Phan Vi KET LUAN 000.0000 cee 28

Trang 3

Phan I: DAT VAN DE

Ủng thư là một trong những bệnh phổ biến và cĩ tý l€ gây tử vong cao trên

thế giới cũng như ở Việt Nam Đây là đạng bệnh lý cĩ liên quan đến hiện tượng rối loạn trong quá trình điều hịa sự phân chia tế bào ở các mơ trong cơ thể Khối u hình thành do những tế bào ung thư phân chia liên tục khơng được kiểm sốt, ban đầu

khối u định vị tại l mơ nhưng sau đĩ tế bào ung thư cĩ thể di căn khắp cơ thể, làm cơ thể suy kiệt và dẫn đến tử vong Ung thư hiện vẫn là vấn để nan giải của Y học, người ta vẫn chưa tìm ra hoạt chất bay phương phấp nào điều trị hữu hiệu tất cả các

dang ung thu

Nghiên cứu về bệnh ung thư và cách chữa trị ung thư là lĩnh vực rất được quan tầm trên thế giới Đã cĩ nhiều tổ chức, viện nghiên cứu ung thư được thành lập ở nhiều quốc giá trên thế giới như: American Association Cancer Research,

Australian Cancer Society, British Association for Cancer Research, National

Cancer Institute of Canada, European Association for Cancer Research Nhiéu nghiên cứu về bệnh ung thư và cách chữa trị ung thư được thực hiện trên thế BIỚI và

đã đạt được nhiều hiểu biết về cơ chế phân tử của sự phân bào, cơ chế phần tử của

bệnh ung thư, các phương thức hữu hiệu để tiêu diệt hay ngăn cần sự phát triển của

tế bào ung thư và gần đầy nhất là giải Nobel Sinh lý và Y học năm 2001 cũng là

những phát hiện liên quan đến các protein tham gia vào quá trình phân bảo và ung

thư

2

Việt Nam là một nước nhiệt đới với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú, trong đĩ cĩ thể sẽ cĩ nhiều cây thuốc với những hoạt chất kháng ung thư mạnh cĩ thể ứng dụng vào điều trị Tuy nhiên, những nghiên cứu về hoạt chất kháng ung thư

ở nước ta khơng nhiều

Trước tình hình đĩ, việc phát triển những phương pháp thử nghiệm nhằm xác

định hoạt tính kháng ung thư của các chất chiết xuất từ thực vật là cần thiết, từ đĩ

nâng cao hiệu quả sử dụng của nguồn tài nguyên cây thuốc Việt Nam và làm cơ sở

cho các nghiên cứu sâu hơn, Để bước đầu thực hiện mục tiều trên, chúng tồi tiến

hành khão sát hoạt tính kháng phân bào của 2 hoạt chất gossypol và plumbagin cĩ

nguồn gốc từ cây thuếc dân gian được biết là cĩ khả năng kháng ung thư trên hai

Trang 4

r?

Phan I: TONG QUAN TAI LIEU I NHŨNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VE BENH UNG THU

1 Bản chất của bệnh ung thư

Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào Khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh ung thư, tế bào tăng sinh vơ hạn độ, vơ tổ chức khơng tuân theo các cơ chế ki sốt và phát triển của cơ thể

Đa số người bị ung thư hình thành các khối u Khác với khối u lành tính (chỉ phát triển tại chổ thường rất chậm, cĩ vỏ bọc chung quanh), các khối u ác tính (ung

thư) xâm lấn vào các tổ chức lành xung quanh giống như hình "con cua" với các càng cua bám vào các tổ chức lành trong cơ thể hoặc giống như rễ cây lan trong đất

Các tế bào của khối u ác tính cĩ khả năng di căn tới các hạch bạch huyết hay các tạng ở xa hình thành các khối u mới và cuối cùng dẫn đến tử vong

Đa số ung thư cĩ biểu hiện mãn tính, cĩ quá trình phát sinh và phát triển lâu

dài qua nhiều giai đoạn Trừ một số nhỏ ung thư ở trẻ em cĩ lẽ do đột biến gen ở giai đoạn bào thai, cịn phân lớn ung thư đều cĩ giai đoạn tiểm tàng lâu dài, cĩ khi hàng chục năm khơng cĩ dấu hiệu gì trước khi phát hiện thấy dưới dạng các khối u

Khi các khối u phát triển nhanh mới cĩ triệu chứng ung thư Triệu chứng đau chỉ

xuất hiện khi ung thư ở vào giai đoạn cuối 2 Sự khác nhau của mỗi loại ung thư:

Người ta biết được cĩ đến 200 loại ung thư khác nhau trên cơ thể người Những loại ung thư này tuy cĩ những điểm giống nhau về bản chất nhưng chúng cĩ

nhiều điểm khác nhau như sau:

3.1 Khác nhau về nguyên nhân

Qua các nghiên cứu dịch tế học của R.Doll và Petro trên 80% tác nhân sinh

ung thư là bắt nguồn từ mơi trường sống, trong đĩ cĩ 2 tác nhân lớn nhất là: 35% do chế độ ăn uống gây nhiều loại ung thư đường tiêu hĩa và khoảng 30% ung thư do thuốc lá (gây ung thư phổi, ung thư đường hộ hấp trên )

Các tác nhân khác gồm:

- Tia phĩng xạ: cĩ thể gây ung thư mấu, ung thư tuyến giáp

- Bức xạ tử ngoại: cĩ thể gây ung thư da

- Virus Epstein - Bar: gây ung thư vịm hong, u lympho ác tính

Trang 5

- Virus viém gan B (HBV), viém gan C (HCV) dan dén ung thu gan

- Các loại hĩa chất được sử dụng trong cơng nghiệp, trong thực phẩm, trong chiến tranh, các chất thải ra mơi trường nước và khơng khí là tác nhân của nhiều loại ung thư khác nhau 3.2 Khác nhau về Hến triển Tidươ thư thường xế Ủng thư thường xuất phát từ 2 tố chức chính của cơ thể: Lente 148 ahve alvin ad 2 ` z at ` 2 ^ ˆ - z 22 ˆ - Từ các tế bào biểu mơ của các tạng, các cơ quan (ung thư biểu mơ; carcinoma)

- Từ các tế bào của tổ chức liên kết của cơ thé (sarcoma) Ung thu cia ed

quan tạo huyết (mán, hạch lympho) là một dạng đặc biệt của ung thư tổ chức liên két (Hematosarcoma)

x ‘ 4 x -2 ‘ z ` : #: ,

Mỗi loại ung thư cĩ hướng tiên triển khác nhau Trong từng loại, mỗi loại ung

thư của mỗi cá thể khác nhau, xu hướng tiến triển cũng rất khác nhau

- Cĩ loại ung thư tiến triển rất nhanh (ung thư máu, hạch, ung thư hắc tế, các

ung thư liên kết )

- Cĩ nhiều loại ung thư tiến triển chậm: ung thư đa tế bảo đấy, ung thư giáp

trạng, ung thư cổ tử cung

- Loại ung thư biểu mơ thường đi căn theo đường bạch huyết đến các hạch khu vực oO Đà oO c ® xã gq os oO ~ 2 pom —¬ & ~<

- x = = đa = ey a — > a a S $ ra oa t2 ¬ go a là os Nea et or m a m og Đa ° Đọc = œ ta œ G = a Kì Ot 3 2 Dy c a a

Thơng thường ung thư cằng ở giải đoạn muộn, càng hay cĩ di căn ra hạch khu VỰc và dị cã ì xa nhưng đổi khi cĩ di cần rất sớm, thậm chí từ lúc chưa phát hiện thấy u nguyên phất,

ếc độ phát triển của ung thư cũng tùy thuộc vào rừng giai đoạn của từng

loạt Ở những giai đoạn sdm (insitu, gia đoạn L) ung thư thường tiến triển lầu đài,

ạp, nhưng ở các giai đoạn muộn (giai đoạn 3,4) ung thư tiến triển thường rất

nhanh và gây tử vong

châm ch

Ủng thư ở người càng trẻ, thường tiến triển nhanh hơn người gia

2.3 Khác nhau về phương pháp điều trị

Trang 6

Trong y văn cĩ nĩi đến một tý lệ rất nhỏ ung thư tự khối (1/10.000) Cĩ thể ở những cơ thể cá biệt, cĩ hệ thống miễn dịch tự điều chỉnh, tiêu diệt được các tế bào

ng thư sau khi đã phát sinh Nhưng trên căn bản nếu khơng điều trị thì chắc chấn bệnh nhân sẽ sớm dẫn đến tử vong Càng điều trị ung thư ở giai đoạn sớm, bệnh

nhân càng cĩ cơ may trị khỏi bệnh ung thư Ở những giai đoạn muộn hơn cũng cần

điều trị để tạm thời ổn định hoặc kếo dài thời gian sống hoặc giấm các triệu chứng

của ung thư

Mỗi loại ung thư, mỗi giai đoạn bệnh cĩ phương pháp điều trị khác nhau, - Điều trị phẫu thuật: thường áp đụng cho ung thư ở giai đoạn sớm chưa cĩ đi - Điều trị ta xạ: thường ấp dụng cho những ung thư ở giai đoạn tượng đối muộn hơn Thường phối hợp với phẫu thuật làm thu nhỏ bớt khối a để dễ mổ hoặc

diệt những tế bào u tại chỗ và hạch khu vực mã khi mổ nghị ngờ chưa lấy hết hạch

hoặc áp dụng tia xạ cho ung thư ở các vị trí khơng thể mổ được

- Điều trị hĩa chất: trước đây áp dụng cho những loại ung thư cĩ tính chất

tồn thân bay ở giai đoạn muộn, cĩ đi căn, nhưng ngày nay số ung thư ở giai đoạn

sớm (trên lâm sàng) nhưng tính chất ác tính cao, dễ di căn hoặc nghi cĩ vì đi căn

(ung thư vú, tỉnh hồn, buơng trứng, ung thư rau ) người ta cũng sử dụng hĩa trị để phịng ngừa và nâng cao hiệu quả điều trị

- Điều trị miễn dịch: là L trong 2 phương pháp điểu trị tồn thân, cịn đang được nghiên cứu và cĩ nhiều hy vọng Cĩ nhiều thử nghiệm đã áp dụng như điều trị kích thích miễn địch khơng đặc hiệu, điểu trị bằng interferon, các Iymphokin và gần đây là các nghiên cứu đùng kháng thể đơn địng đã điều trị một số bệnh ung thư cĩ

kết quả tốt

2.4 Khác nhau về tiên lượng bệnh

Tiên lượng ung thư phụ thuộc rất nhiều yếu tố trên từng bệnh nhân Những yếu tố chính là:

- Giai đoạn ung thư: càng sớm tiên lượng càng tốt và ngược lại

- Loại ung thư: những ung thư ở bể mật cĩ tiên lượng tốt hơn (dễ phát hiện, để điều trị) như ang thư đa, ung thư cỗ tử cung, ung thư vú, ung thư giấp wang, ung

thư khoang miệng, ung thư đại trực trang

Cĩ những ung thự ở các rạng quan trọng khĩ phát hiện sớm, khĩ điểu trị, tiên

Trang 7

- Tính ác tính của tế bào ung thư: cùng 1 loại ung thư, cùng giai đoạn lâm sàng nhưng độ ác tính của chúng khác nhau Độ ác tính càng cao tiên lượng càng

xấu

- Thể trạng của người bị ung thư: ở người già ung thư thường tiến triển chậm

nhưng thể trạng yếu nên khĩ thực hiện được phác đồ điều trị ¡ cách triệt để nên càng già yếu tiên lượng càng xấu

3 Cĩ thể phịng ngừa được nhiều loại ung thư

Như trên đã để cập đến tác nhân sinh ung thư chủ yếu là từ mơi trường bên

ngồi (trên §0%) Tác nhân nội sinh rất ít (chỉ khoảng 1%) Vì vậy, phịng bệnh ung

thư cĩ hiệu quả khi ngăn chặn tốt các tác nhân do mơi trường tác động vào đời sống con người như: ngừng hút thuốc lá, chế độ định đưỡng vệ sinh an tồn hợp lý, chống lạm dụng các hĩa chất cơng nghiệp, chống ơ nhiễm mơi trường, phịng bệnh nghề nghiệp sẽ làm giảm tỷ lệ mắc ung thư

Một số loại bệnh ung thư cĩ liên quan đến virus đã được người ta ấp dụng vaccin để phịng ung thư như vaccin phịng viêm gan B, và người ta đang nghiên cứu vaccin phịng Esptein-Barr gây ung thư vịm họng và u lympho

Ngồi ra các biên pháp điều trị tổn thương tiền ung thự, các biện pháp sàng

lọc phát hiện sớm một số ung thư hay gặp (vú, cổ tử cung, khoang miệng, đại trực

tràng ) đã thiết thực làm giảm tỷ lê mắc bệnh, làm giảm tỷ lệ tử vong do ung thư

(1]

Il BAI CUONG VE CO CHE SINH BENH UNG THU

1 Đại cương về khối u và lịch sử nghiên cứu

Nghiên cứu cơ chế sinh bệnh ung thư cần phải đi sầu tìm hiểu về quá trình

sinh học của tế bào ung thư và sinh học phần tử của ung thư

1.1 Phân biệt u lành và t ác tính theo đặc tính sinh hoc | U lành tính ị U ác tính , |

Té bào biệt hĩa cao | Ít biệt hĩa |

Hiếm cĩ phân bào Luơn cĩ phân bào

Phát triển chậm Phát triển nhanh |

Khơng xâm lấn | Xam lấn lan rộng

|

Khơng cĩ hoại tử Hay cĩ hoại tử trung tâm

Cĩ vỗ bọc Khơng cĩ võ hoặc ranh giới

Trang 8

Í Rấtíttái phát Luơn tái phát

| Khơng di căn Dị căn

Ít ảnh hưởng đến cơ thể Ị Ảnh hưởng nặng tới cơ thể

1.2 Một số mốc lịch sử nghiên cứu về ung thư

- Xương hĩa thạch của loại khủng long cách đây 60 triệu năm cĩ thương tốn

ung thư

- Xác ướp người Ai cập ở Gaza cách đây 5000 năm thấy cĩ ung thư xương và ung thư bàng quang

- Thời Hypocrates đã để lại một số bản viết tay mơ tả 2 loại ung thư: loại sùi ra ngồi nhiều chân như lồi tơm cua gọi là carcinoma và loại phát triển sầu trong

thịt gọt là sarcoma

- 1846 R.Virchop (người Đức) mơ tả tế bào ung thư máu và đưa ra giả thuyết về nguồn gốc ung thư tế bào

- 1962 Watson và Cns dưa ra mơ hình chuỗi xoắn kếp phân tử DNA mơ

phỏng các loại gen của tế bào Cơng trình nhận giải Nobel Y học

- 1979 Richard Doll lãnh đạo nhĩm nghiền cứu nguyên nhân gây ung thư trên người từ mơi trường sống Trong đĩ ơng và Petro nhấn mạnh vai trị quan trọng của

hút thuốc, dinh dưỡng và các ung thư nghề nghiệp

- 1981 Cesar Milstein da phat triển kỹ thuật sắn xuất kháng thể đơn dịng

(nhận giải Nobel 1987)

- 1881 S.D.Thomas đã thành cơng ghép tủy xương trên người ứng dụng xạ trị tồn thân và điều trị hĩa chất mạnh trong bệnh bạch huyết cấp (nhận giải Nobel

năm 1990)

2 Tế bào ung thư

2.1 Nguồn gốc tế bào ung thư

Cĩ một số giả thuyết khác nhau nhằm giải thích các quan sát về quần thể tế

bào ung thư

2.1.1 Thuyết đơn dịng tế bào

Trang 9

Ví dụ: từ bệnh bạch cầu thể tủy trên phụ nữ da đen thấy tế bào đồng nhất

thương tổn nhiễm sắc thé 10 Các tế bào ung thư đều tiết men Glucose-6-phosphate

dehydrogenase

2.1.2 Thuyết đa dịng tế bào

Khi quan sát về hình thái và chức năng người ta thấy:

- Tổ chức ung thư cĩ nhiều loại tế bào nên chẩn đốn hình thái học đễ nhầm

- Về chức năng: nhiều chất chỉ điểm sinh học

2.1.3 Thuyết về kém ổn định gen của tế bào ung thư

Cĩ thể ban đầu là một dịng, do gen tế bào ung thư khơng ổn định nên cĩ các

tế bào biến dị tạo nên hàng loạt các tế bào hỗn hợp

Ví dụ: U lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ Các loại ung thư phổi thể hỗn hợp, ung thư liên kết hỗn hợp

1.2 Các đặc tính tế bào ung thư

- Hình thái học: tăng kích thước nhân, tăng tỷ lệ nhân so với bào tương,

khơng cịn ức chế tiếp xúc

- Chức năng:

+ Hai đặc tính tại chỗ: xầm lấn lan rộng, tế bào thốt mạch di chuyển và di căn do hiện tượng phân bào mạnh

+ Tế bào biệt hĩa thấp, khơng làm được chức năng bình thường, nếu bị thiếu

dưỡng chất để bị hoại tử nhất là vùng trung tâm u

+ Đơi khi tiết ra những hoạt chất lạ mà qua đĩ ta cĩ thể gián tiếp thấy được sự hiện diện của tế bào ung thư khá đặc hiệu:

œFP: trong ung thư gan

CA 125: trong ung thư buồng trứng CA25; trong ung thư vú

CEA: trong ung thư đại trực tràng

Trang 10

ByMicroglobulin, Belcezol: trong đa u tủy xương,

3 Sơ lược về cơ sở sinh học phân tử của ung thư

3.1 Phần quy định sinh sản tế bào là DNA của nhân tế bào

Trong ung thư việc thay đổi DNA dẫn đến sinh sản vơ tổ chức là hậu quả của

quá trình đột biến gen, chứng cớ mạnh mẽ nhất là:

- Những chất gây đột biến gen tế bào chính là những tác động hố lý gây ung

thư

- Những tác động sây ung thư cũng sây nền đột biến gen 3.2 Các gen gây ung thu (Oncogen)

Cho đến nay đã tìm ra trên 40 loại Cĩ 3 giả thuyết cho việc hình thành

Oncogen

- Oncogen là những sen để phát triển tế bào, hoạt hĩa nhờ yếu tố tăng trưởng

growth factor) Do rối loạn cơ chế điều hành, yếu tế tăng trưởng hoạt hĩa mạnh

kích thích Ơncogen sinh ung thư

- Oncogen là những đoạn DNA bị thương tổn bởi các tác nhân gây bệnh như hĩa học, sinh học, vật lý Cơ thể đã sửa chữa những đoạn DNA này nhưng khơng hồn chỉnh, nên cùng tác nhân gây ung thư, cĩ người bị ung thư cĩ người khơng bị

ung thư

- Oncogen là do các genome của virus đưa vào cơ thể vì thấy các Oncogen này giống với DNA của virus vi du: HPV (cổ tử cung, dương vậu, EBV (Burkit) và

HBV (ung thư gan)

Một số gen gây ung thư

|

| Gen | Vi tri | Sai lac | Loai ung thu |

| Ape | 5q | | Hội chứng Gadner, ung thư trực tràng |

IMcc | 5q | Khuyétdoan | Da polip tric trang

Raa | \p | Ung thy dai trang, hoi chifng lynch |

| P53 | | Ung thy dai trang |

Abl | 9q +(9; 22) Bạch cầu kinh thể tủy |

(MyL 6q | +(6; 14) Bạch cầu cấp Iyrnpho, ung thư buồng trứng Myc | 8q | +(8; 14 | U lympho Burkitt, ung thư nguyên bào thần |

| kinh bạch cầu cấp

Trang 11

Fms | 5q | Nhiều loại ung thư

|

p: Nhánh ngắn nhiễm sắc thể q: Nhánh dài nhiễm sắcthể +:Nối đoạn [1]

1H ĐẠI CƯƠNG VỆ THUỐC CHỮA UNG THƯ

1 Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thư

Các thuốc chữa ung thư cĩ tác động đến các giai đoạn khác nhau trong quá trình tổng hợp acid nucleic (đặc biệt là DNA) cũng như quá trình tổng hợp protein ở

các tế bảo ung thư vào các thời kỳ khác nhau của chu trình phân chia tế bào

Ở các mơ ung thư của người cĩ khoảng 50% tế bào ở giai đoạn nghỉ khơng

phan chia (Gg) Sự phần chia của tế bào cĩ thể phần thành 4 giai đoạn:

- Giai đoạn G¡ là thời kỳ sau gián phân Thời gian của giai đoạn này rất khác

nhau tùy theo loại tế bào Trong thời kỳ này tế bào sinh ra các protein cần cho tổng

hop DNA

- Giai đoạn S là giai đoạn tổng hợp DNA

- Giai đoạn G; là giai đoạn tiền gián phân Trong thời kỳ này xảy ra tổng hợp RNA và các protein đặc hiệu của ung thư

- Giai đoạn MI là thời kỳ gián phân (thời kỳ phân chia tế bào) Giai đoạn này lại chia thành prophase, metaphase, anaphase và telophase

Các thuốc chữa ung thư khơng ảnh hưởng đến giai đoạn nghỉ, mà chỉ tác động

lên các giai đoạn Š, G; và Mí, thậm chí cĩ thuốc chỉ tác động lên một kỳ nào đĩ của giai đoạn MÍ mà thơi

2 Sự kháng thuốc của tế bào ung thư

Các tế bào ung thư cĩ thể kháng lại các thuốc chữa ung thư cũng như vì

khuẩn kháng kháng sinh

Cơ chế tế bào ung thư kháng thuốc cĩ thể là:

- Lầm giẩm khả năng xâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thư

- Làm giảm hoạt tính của thuốc do làm thay đối các phân tử thuốc

Trang 12

- Lầm tăng khả năng tổng hợp protein để vẫn đảm bảo phân chia tế bào mặc đù bị thuốc tác động

Sự kháng thuốc cĩ thể đặc hiệu đo một loại thuốc nhất định, nhưng cũng như

kháng kháng sinh, các tế bào ung thư cũng cĩ hiện tượng kháng chéo thuốc Ví dụ:

một địng tế bảo ung thư đã kháng alcaloid của đừa cạn, cũng kháng cả

anthracyclin Hiện tượng này gọi là kháng đa thuốc (multidrug resistance)

3 Độc tính của các thuốc chữa ung thư

Các thuốc chữa ung thư cĩ tác dụng độc, ngăn cẩn sự phân chia các tế bào

ung thu, những đồng thời cũng gây độc cả tế bào lành, do đĩ chúng thường khá độc

Tác dụng của thuốc chữa ung thư khơng đặc hiệu như các hĩa trị liệu kháng khuẩn Vì vậy trong điều trị ung thu bằng hĩa trị liệu thường cĩ nhiều tác dụng phụ cĩ hại nhiều khi khá nặng, đặc biệt là tác hai lên tủy xương, trên các tế bào sinh sản, trên các niêm mạc, da, sự phát triển của tĩc, bào thai, trên khá nắng sinh miễn dịch

Một trong những cách hiện đại lầm tăng tính đặc hiệu của thuốc chữa ung thư là gắn chúng lên các kháng thể đơn dịng

Các biểu hiện độc thường là:

- Rối loạn tiêu hố, buồn nơn và nơn mửa

- Rung tĩc

- Trén tly xuong: [am yéu chic nang thy, han ch€ tao buyét cau - Ảnh hưởng xấu đến buồng trứng và tỉnh hồn, dẫn đến vơ sinh

- Làm chậm tăng trưởng và phát triển 6 tré em

- Gây ung thư thứ phát do dùng thuốc,

- Gây tổn thương mạch máu và đau khi ruyền thuốc tĩnh mạch hay sau khi điều trị một thời gian

- Rối loạn tính cách, hành v1

- Sút cân, người yếu, khơng cịn khả năng lầm việc,

- Đã thấy thuốc gây quái thai rên động vật thí nghiêra Vì vậy người đã dùng thuốc chữa ung thư thì khơng nên cĩ con nữa [2]

Trang 13

IV DAI CUONG VE NUOI CAY TE BAO DONG VAT

1, Đặc điểm của tế bào động vật LIL Tinh cơ học yếu

Tế bào động vật khơng vách nhưng kích thước tế bào khá lớn (khoảng 10 um) nên tính bền cơ học yếu Do đĩ khi nuơi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi khuấy trộn để tách tế bào, thao tác v.v Trong trường hợp việc

nuơi cấy tế bào động vật cần khuấy hay quay thì tốc độ khơng được quá 100rpm

(vịng/phún)

Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào động vật cũng cố gắng sao cho ngắn nhất, thời gian càng kéo dài, tế bào càng lổng lẻo dễ vỡ Trong bảo quản, đi chuyển

các mẫu tế bào cũng cố gắng thật nhẹ nhàng

1.2 Tăng trưởng và phân chia chậm

Thời gian tăng gấp đơi số lượng của tế bào động vật trong điều kiện sinh lý là 20-40 giờ Hiệu suất sản sinh các chất cĩ hoạt tính sinh học của tế bào động vật rất thấp và chậm Do đĩ cần cĩ thời gian dài và khối lượng tế bào lớn khi chúng ta

muốn sản xuất chất cĩ hoạt tính từ tế bào động vật

1.3 Cơ chế kìm hãm ngược (negative ƒeed-back)

Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngồi mơi trường của một chất bởi sự gia tăng nỗng độ chất này trong mơi trường Do đĩ, việc thay mới mơi trường sau một thời gian nuơi cấy nhất định là rất cần thiết, nhằm tránh sự hoạt động của cơ chế kìm hãm ngược này Trong phơng thí nghiệm, cơ chế ức chế ngược cịn cĩ thể

sây tốn thương tế bào, thậm chí làm chết hàng loạt 1.4 Tính chất cần giá đỡ

Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mơ và

tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để cĩ thể sống và phân chia Thơng thường tế

bao tang trưởng tốt khi gắn vào bể mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phần chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên bể mặt của dụng cụ nuơi Tuy vậy, một số dịng tế bào như tế bào ung thư hoặc dịng tế bào liên tục từ mơ bình thường, sau khi được thuần hĩa, cĩ thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ tửng, khơng cần bám vào nền,

1.5 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Các tế bào động vật cĩ thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thơng qua quá tình

dung hợp 2 tế bào cĩ nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma) Hoặc quá

ll

Trang 14

trình biến nạp, ví dụ: chủng tế bào bình thường cĩ thể được cảm ứng thành tế bào cĩ các tính chất của tế bào ung thư thơng qua quá trình biến nạp được thực hiện bởi một virus cảm ứng ung thư hoặc bằng hĩa chất

1.6 Cĩ thể được bảo quần lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

z x nx ` ˆ a Z Z2 3 2 a ~ a

Các đồng tế bào động vật cĩ thể được bảo quản lạnh sâu -70C trong một thời gian võ định Khi được giải đơng và hoạt hĩa, tế bào phục hếi lại khả năng tăng

trưởng và phân chia như ban đầu 1.7 Các đặc tính khác

Ngồi các đặc únh trên, tế bào động vật cịn cĩ các đặc điểm khác như kém

thích nghị với mơi trường, nhạy cảm với ion kirn loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormon để tăng trưởng và phân chia

2 Mơi trường nuơi cấy tế bào động vật

Thành phần mơi trường nuơi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với mơi trường nuơi cấy vị sinh vật và tế bào thực vật Trong các cơng trình đầu tiên về nuội cấy tế bào động vật người ta dùng hỗn hợp dung địch muối sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phơi gà làm mơi trường nuơi cấy Do thành phần huyết thanh và chiết phẩm phối gà rất rất phức tạp, khĩ ổn định nên người ta đân dẫn quan tâm

đến v

ra 2 x z ne ` £ 2 6 iw 2? an 2 >

> nghiéa cu ché tao cac moi trudng tổng hợp để cĩ thế chủ động báo quản,

sử dụng, điều chỉnh thành phẩn mơi trường và ổn định mơi trường trong những lần nuồi cấy khác nhau

Hiện nay, trừ những địng tế bào đã thiết lập được thuần hĩa với mơi trường

tổng hợp hồn tồn, đa số e ác dịng tế bào được nuơi cấy trong mơi trường tổng hợp

cĩ bổ sung 5 - 10% huyết thanh (cĩ dịng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh),

Thơng thường huyết thanh bê được sử dụng phổ biến hơn cả, nhưng cĩ một số loại

tế bào cần phải sử dụng huyết thanh bào thai bd (Fetal bovine serum: FBS)

Một vài loại mơi trường thường được sử dụng trong nuơi cấy tế bào và mơ động vật:

- Mơi trường BMI (Basal Mediiun): đây là mơi trường cơ bản do H Easle thiết lập, khi dùng phải bổ sung 5-10% huyết thanh và amino acid, vitamin vdi chẳng loại

và số lượng tùy loại tế bào Thường sử dụng nuơi cấy tế bào Hela, tế bào L

nà

- lơi trud

trường tối

tý E`MEM( (Eagle Mubumum Essential Medium): cịn gọi là mơi

4 éu do H.Eagle thiết lập Đây là mơi trường BM cd chifa néng độ cao hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5-10% huyết thanh khi nuơi cấy tế bào

Trang 15

- Méi truong D'MEM (Dulbecco — Modified Eagle Medium) \a mơi trường

EMEM do Dulbecco cdi tiến với thành phần một số armino acid cao gấp 2 lần và một số vitamin cao gấp 4 lần so với mơi trường khác để nuơi được nhiều loại tế bào

hơn

- Mơi trường F10, F12: do R.G Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong

mơi trường này huyết thanh thường được thay bằng 20ug/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3.10” M acid linoleic

- Mơi trường Iscove: do N.N Iscove thiét lp trên cơ số tiếp tục cải biến mơi

trường DMEM

- Mơi trường SA: do T.A Mc.Coy thiết lập, thường được dùng cho tế bào

bệnh bạch huyết

- Mơi trường RPMI-I640: được G.E Moore thiết lập tại viện nghiên cứu

Roswell Part Memorial Institute, được dùng để nuơi tế bào và mơ bạch huyết

- Mơi trường 199: do R.C Parker thiết lập đùng để nuơi tế bào mơ cơ phơi gà

trong sản xuất vaccin phịng bệnh bại liệt

Trong hầu hết các loại mơi trường nuơi cấy tế bào động vật đều cĩ mặt

huyết thanh vì nĩ cĩ những vai trị quan trọng như sau:

- Cụng cấp chất định dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiển chất của nucleic acid, các nguyên tố vị lượng

- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân

chia,

- Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyển và các

protein trong huyết thanh lầm bất hoạt trypsin tránh các enzym gây tổn thương tế bào

- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

- Cải thiện tính đính của tế bào lên bề mặt bình nuơi nhờ các yếu tổ lầm tăng độ dính của tế bào lên giá đồ

- Chống oxy hĩa: huyết thanh cĩ tính kháng oxy hĩa mạnh và ức chế độc tính

của Oxy

Huyết thanh rất cần cho việc nuơi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuơi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của mơi trường

v xử a x x x % 2 :

nuơi cấy) Ngồi ra huyết thanh cịn dé bi nhiém virus, mycoplasr va khé 6n dinh

Trang 16

chất lượng của những lơ mơi trường khác nhau cũng như cịn chứa những thành phẫn

gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (đo đĩ cần chọn loại huyết thanh phù hợp khơng chứa yếu tố ức chế đối với dịng tế bào nuơi cấy) Vì các lý do đĩ mà nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng mơi trường nuơi cấy tế bào động vật khơng dùng huyết thanh hay dùng với lượng thấp

Cĩ 2 phương pháp điều chế mơi trường khơng cĩ huyết thanh là phương pháp của G Sato và phương pháp của R.G Ham Ca 2 phương pháp này đều thay huyết thanh bằng những yếu tố khác như: kích thích tố, nhân tổ tăng trưởng, protein vận

chuyển, nhần tế kết dính và kếo dài, các chất dinh dưỡng, khống [3]

Trang 17

Phần IH: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

L VAT LIEU

1 Gossypol

Gossypol là một sắc tố vàng loại poliphenol trích từ hột của cây bồng

Gossypium hirsutum, ho Malvaceae, cé nhiét dé néng chảy là 182°C Hầm lương

gossypol trong hat béng bién déi từ 0.1 - 6,64% tùy theo giống

Trong kỹ nghệ cây bơng, gossypol được xem như là phế phẩm cĩ độc tính và thường được khử từ đầu; hột sau khi loại dầu và khử gossypol thường dùng làm thức ăn gia sÚC

Nhưng hiện nay, gossypol cĩ tầm quan trọng đặc biệt Vào năm 1950, một bác sĩ Trung Hoa đã phát hiện cĩ sự gia tăng bất thường các cặp vợ chồng khơng cĩ

con trong vùng dùng nhiều dầu bơng cịn chứa gossypol

Những thí nghiệm trên động vật và sau đĩ trên con người cho thấy gossypol cĩ tính diệt tình trùng,

Trang 18

Tác dụng sinh học của gossypol:

Năm 1950, người ta phát hiện tác dụng lên tinh trùng của gossypol, Nhiều thử nghiệm trên động vật sau đĩ cho thấy gossypol gầy nên:

- Sự giảm bớt tính đi động và số lượng của tỉnh trùng cùng với sự xuất hiện nhiều tinh trồng di dang

me 2 yg - Ciăm thiểu sự sinh sản

- Lầm ngưng trệ testosteron (kích khích tố nam)

Năm 1970, những thử nghiệm lâm sảng đã được thực hiện trên con người tại

Trung Quốc cũng cho thấy kết quả tương tự Tuy nhiên, sau khi ngưng dùng thuốc 3

tháng thì tỉnh địch của người trở lại bình thường về mặt định tính và định lượng Ngồi ra gossypol cịn cĩ nhiều tác dụng khác như :

- Gây co rút ở các lồi găšm nhấm - Kháng khuẩn

- Tác dụng gây độc cho cơ thể: LDậo heo: 550 mg/Kg, LDsg chudt: 2200 Hiện tượng ngộ độc gossvpol là sự uễ ỗi, nơn mửa, tiêu chấy và khĩ thổ dẫn đến chết vì ngạt thở [5]

mg/Kg

Gossypol được thứ nghiệm trên bệnh nhân bị ung thy than (adrenocortical

cancer) di căn kết quả là cĩ 15% trường hợp cĩ đáp ứng Nghiên cứu tác động của

sossypol lên tế bào ung thư vú của người nuơi cấy cho thấy gossypol cĩ thể ức chế sự phân bào và thay đổi sự biểu hiện của nhiều protein điều hịa chu trình tế bào

(ceil cycle) Một thử nghiệm trên bệnh nhân hĩa trị liệu chống ung thư vú di căn cho

thấy gossypol, ở liều lượng phù hợp, cĩ tác động lên những protein điều hịa chủ trình tế bào và tác dụng cĩ lợi lên một số bệnh nhân [13]

2 Plumbagin

Plumbagin 1A tink thé mau vang cam, hình kim, nhiệt độ nĩng chẩy 77 ~

78°C, được chiết xuất từ rể cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica, ho Plumbaginaceae ,

Céng thite phan ut :C,,HgO5 Trọng lượng phân tử : 188.18

Trang 19

Cây bạch hoa xà (Phưnbago zeylanica) Plumbagin Tính chất hĩa học của plumbasin:

- Khơng tan trong nước

- Tan tốt trong CHCls, C¿Hạ, AcOH, (CH;);CO

- Cho màu đồ máu với FeCl;

- Kết tủa xanh lục với Cu(AcO)› trong alcol

Tác dụng sinh học của plumbagin:

- Tại Ấn Độ và Châu Phi plumbagin được sử dụng để trị các bệnh đường tiểu hĩa, phong ghẻ

- Plumbagin cĩ tác dụng điệt khuẩn, nấm

Plumbagin được sử dụng làm chất bảo quản đối với thức ăn và hoa quả

- Plumbagin cĩ tác dụng mạnh với nhiều lồi vi khuẩn Gram (+), vi khuẩn

Gram (-), nam, vi khuẩn kháng acid Vi du nhu: Staphylococcus aureus,

Mycobacterium tubercuosis, Escherichia coli (4}

- Một số tài liệu cho thấy plumbagin cĩ hoạt tính kháng ung thư [11,12]

3 Các địng tế bào ung thư

3.1 Dong tế bào RD (Rhabdomyosarcoma)

Trang 20

Ky hiéu: ATCC CCL 136 RD (tt Catalogue of American Type Culture

Collecton, ATCC)

Dịng tế bào RD được thiết lập bởi R.M MecAllister từ khối u cơ ở vùng chậu

của một bé gái 7 tuổi người Cap-ca (Caucasian) vào tháng 2 năm 1968 Các tế bào mọc thành những lớp đơn trong mơi trường lồng và tạo thành cụm tế bào (coloni)

trên mơi trường E'MEM Agar (Eagle'Minimum Essential Medium) bể sung 10% huyết thanh bào thai bị (Fetal Bovine Serum) Tế bào nuơi cấy cĩ 2 dạng, dạng tế

bào gần giống tế bào mơ ung thư ban đầu, và đạng tế bào trãi rộng cĩ nhiều nhân Tế bào cĩ myoglobin và hoạt tính myosin-ATPase Dịng tế bào RD là dịng tế bào

ung thư cơ đầu tiên của người được xác định đặc tính và nghiên cứu chỉ tiết

3.2 Dịng tế bào HEp2 (Epidermoid careinoma)

Ký hiệu: ATCC CCU HEp2 (từ Catalogue of American Type Culture

Coilecton, ATCC)

Dịng tế bào HEp2 đã được thiết lập bởi A.E Moore, L Sabachewsky, và H.W Toolan vào năm 1952, từ những khối u tạo ra ở chuột vừa đứt sữa sau khi được

tiêm mơ ung thu biểu bì thanh quần của I người đàn ơng người Cap-ca (Caucasian)

56 tuổi Việc phân lập ín viiro đã được thực hiện ở nhiều phức hợp của nước ối thai

bị, dịch chiết phơi, huyết thanh người và ngựa, và dung dịch muối cân bằng, những

tế bào giếng biểu mơ này phát triển tốt trong nhiều dạng mơi trường nuơi cấy Đây

là một dịng tế bào khỏe mạnh cĩ thể chống lại nhiệt độ thiếu hụt dinh dưỡng, và

những thay đổi mơi trường mà khơng mất khả năng sống

~~

Tế bào RD Colony tế bào Hep2

Trang 21

II PHƯƠNG PHÁP

1 Phương pháp nuơi cấy tế bào:

Tế bào được nuơi cấy trong mơi trường E'MEM (Eagle' Minimum Essential

Medium) cĩ thành phần như sau: Bột E'MEM 472g L-Glutamine 200mM 5 ml NaHCO, 15% 7,5 ml HEPES 1M 10 ml Amphotericin B 0.1% 125 wl Penicillin 50.000 UL Streptomycin 50 mig Phenol dé 0.4% I ml - Huyét thanh (Fetal bovine serum) 50 ml Nước cất đủ 500 ml pH 72

Diéu kién nudi cdy: 37.5°C, 5% CO

2 Phương phdp dém té bao véi trypan blue (Trypan blue exclusion assay) :

Sau một thời gian nuơi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào được tách rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và dược cấy vào các giếng của đĩa 24 giếng: mỗi giếng gồm IŨOul dịch huyền phù tế bào (khoảng 100.000 tế bào) và

400ul mơi trường

Tế bào được ủ ở 37.5°C trong 24 giờ Sau đĩ mơi trường cũ được thay bằng mồi trường chứa øossypol ở nồng độ 0.1uz/ml - 20ug/ml với cả 2 dịng tế bào hoặc plumbagin ở nồng độ 0.1ug/ml - 2ug/ml đối với dịng tế bào RD và O.lug/ml - 10ug/ml đối với dịng tế bào HEp2 Lơ đối chứng được xử lý với mơi trường chứa

dung mơi hịa tan hoạt chất là DMSO Các lơ được ủ 72 giờ ở 37.5 °C

Trang 22

Sau thời gian ủ, tách rời tế bào trong mỗi giếng bằng dung địch trypsin/EDTA, hịa tế bào vào 500 bÌ mơi trường và nhuộm bằng trypan blue 0,4% theo ty lé 1:1 (dịch huyền phù tế bào: thuốc nhuộm) Số lượng tế bào sống (tế bào khơng bắt mầu xanh) được xác định bằng buơng đếm hồng cầu Khả năng ức chế sự

phát triển các dịng tế bào ung thư của hoạt chất được tính theo cơng thức:

Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí

¬ we — œ Lan oO ° a <b», —~ SQ ot x t x 100%

Mật độ tế bào đối chứng

3, Phitong phap MTT (MTT assay) :

Phuong phap MTT dua trén su chuyén chat MTT G-(4,5 3-dimethylthiazol~2~

yl-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thanh MTT-formazan

enzyme hO hap ở ti thé cla tế bào Số lượng tế bào sống t tỉ lệ cĩ mầu xanh tím bởi

Pitan 4 : ˆ ^

formazan, Sn qua gid tri mat dé quang OD 575 cha dung dich

formazan, thé hién qua gia tr mật độ quang OD s;¿ củ

thuận với néng dé

Sau một thời gian nuơi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào được tách rời bằng dung dịch urypsivEDTA và được cấy vào các giếng của đĩa 96

giếng; mỗi giếng gồm 100_1 dịch huyền phù tế bào (khoảng 10.000 tế bào)

Tế bảo được ủ ở 37.5°C trong 24 giờ Sau đĩ mơi trường cũ được thay bằng

mơi trường chứa gossypol ở nềng độ 0 Litg/m) - 20ug/ml với cả 2 đồng tế bào hoặc

plumbagin ở nống độ 0.1ù/ml - 2ug/ml đối với dịng tế bào RD và O.iug/ml - l0ug/ml đối với đồng tế bào HEp2 Lơ đối chứng được xử lý với mơi trường chứa dung mơi hịa tan hoạt chất là DMSO Các lơ được ủ 72 giờ ở 7,5 °C

Sau thời gian ủ, mơi trường xử lý được thay bằng mơi trường chứa Ơ.5 mg/ml MTT Sau 4 giờ ở 37.5 °C mơi trường chứa MTT được thay bằng hỗn hợp isopropanol-HCl (0.04M) Do OD¿;o của các lơ thí nghiệm và đối chứng Khả năng ức chế sự phát triển các dịng tế bào ung thư của hoạt chất được tính theo cơng thức:

(7,8,9,10]

„ ODs10 đối chứng — ODs70 thi _

Tỷ lệ ức chế (%) = x 100%

ODz¡; đối chứng

4 Phương pháp clonogenie (clonogenie asSay) :

Phương pháp clonogenic dùng để xác định tý lệ tế bào ung thư bị ức chế phần bào dưới tác động của hoạt chất

Trang 23

5000 tế bào RD, hoặc 500 tế bào HEp2, được cấy vào mỗi giếng của đĩa 24

giếng

Tế bào được ủ ở 37.5 trong 24 giờ Sau đĩ mơi trường cũ được thay bằng mơi trường chứa gossypol ở nồng độ 0.1us/ml - 20ug/ml với cả 2 dịng tế bào hoặc

plumbagin ở nếng độ 0.lug/ml - 2ug/ml đối với dịng tế bào RD và 0.lug/ml - 10ug/ml đối với dịng tế bào HEp2 Lơ đối chứng được xử lý với mơi trường chứa dung mdi hoa tan hoat chat 1A DMSO Các lơ được ủ 72 giờ ở 37.5 °C

Sau thời gian ủ, sế cạm (colony) tế bào hình thành trong mỗi giếng được đếm

dưới kính hiển vi Khả năng ức chế phân bào của hoạt chất được tính theo cơng

thức:

Số colony đối chứng ~ Số colony thí nghiệm Số colony đối chứng

5 Phuong pháp xử lý thống kê

Sế liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý thếng kê bằng phần mễm

Trang 24

Phan IV: KET QUA - BIEN LUAN

I TAC DONG CUA GOSSYPOL LEN TE BAO RD VA HEp2 Bang 1: Tac động của gossypol lên địng tế bào RD | Néng do Tỷ lệ ức chế phân bào (%) | (ug/ml) | Trypan blue MTT | Clonogenc 01 | 1872È1218° | 45641052 © | 21984231 8 m ¡ 2868‡2376° | 352‡506 C | 2478+23.67P 5 | 7289+1198% | 7147+1686P | 9572+193 ^ 10 865641035128) 786841917 | 100400 4 20 | 99.774068 * | 9720427 *| 100+00 ^ LSD | | | | | <=0.01_ | 1773 | 1374 | 18.89 | Biểu đồ 1: Tác động của Gossypol lên RD 100 - @ Trypan blue OMIT B Clonogenic 'Tỷ lệ ức chế (%}) 01 1 5 10 20 Néng d6 Gossypol (ug/ml)

Két qua 6 bang 1 va biéu dé | cho thấy gossypol cĩ tác động lên sự phất triển của tế bào RD

G néng d6 trén 20 ug/ml, sossypoi giết chết hồn tồn tế bào RD (khơng cịn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần như ¡00% ở cả 3 thử nghiệm

irypan blue, MTT va clonogenic

Ở nồng độ 10 - 5 ug/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bao RD

thể hiện qua tỷ lệ ức chế được xác định bởi thử nghiệm clonogenic gần như 100%,

Trang 25

các tế bào đều khơng cĩ khả nang phan chia 6 néng dé gossypol nay Tuy nhién, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bao RD thấp hơn 100% (khoảng 70-80%), như vậy chứng tổ các tế bào RD vẫn cịn sống dược ở nồng độ gossypol 5-10 nø/ml

Ở nồng độ thấp hơn Sug/ml (1, 0.lug/ml), øossypol cũng làm giảm số tế bào RD cĩ khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic la khoang trén 20% Bang 2: Tác động của gossypol lên hai dịng tế bào HEp2

Í Nơng độ ` Í FC Tỷ lệ ức chế phân bào (%) T 7 | 1

Trang 26

2 ye cổ + 1 x “ a £ aa x 7

Bang 2 va bi€u d6 2 cho thấy tác động của sossypol lên tế bào HEp2

Ở nống đệ trên 20 hg/ml, gossypol giết chết hồn tồn tế bào HIEp2 (khơng cịn tế bảo sống trong giếng) thể biện qua tỷ lệ ức chế gần như 100% ở cả 3 thử

nghiém trypan blue, MTT va clonogenic

Ở néng d6 10 ug/ml, gossypol tte chế khả năng phân bào của tế bào HEp2

thể hiện qua tý lệ ức chế được xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay

gan như khơng cĩ colony nào được hình thành trong giếng nuơi, như vậy tất cả các

tế bào đều khơng cĩ khả năng phần chia ở nổng độ sossypol này Tuy nhiên, kết

quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tý lệ ức chế tế bào HEp2 thấp

hơn 100% (khoảng 70-80%), như vậy chứng tổ các tế bào HEp2 vẫn cịn sống được

6 néng dé gossypol 10 ug/ml

2 > - me ` v> wax Le TY “ 2 ~

Ở nồng d6 5-Lug/ml, gossypol cting lam giảm số tế bào HEp2 cĩ kha nang phân chia, thể hiện qua tý lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng

80 - 20%

G ndng 46 O.lug/ml, gossypol khang c6 tac động đáng kể lên tế bào HEp?

i TAC DONG CUA PLUMBAGIN LEN TE BAO RD VA HEp2

Bang 3: Tac động của plumbagin lên đồng tế bào RD

Nong 46 Tỷ lệ ức chế phân bào (%)

Trang 27

Biểu đồ 3: Tác động của Plumbagin lên RD Wi Trypan blue LIMTT Clonogenic Tỷ lệ ức chế (%)

RD (khơng cịn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần như 100% g

ca 3 thd nghiém trypan blue, MTT va clonogenic

2

Ở nồng độ 0.5 ug/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào RD

thể hiện qua tỷ lệ ức chế được xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay

gần như khơng cĩ colony nào được hình thành trong giếng nuơi như vậy tất cả các

tế bào đều khơng cĩ khả năng phân chia ở nồng độ plumbagin này Tuy nhiên, kết

quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 80-90%), như vậy chứng tỏ một phần tế bào RD vẫn cịn sống

được ở nỗng độ pÌumbagin 0.5 ug/ml

Ở nồng độ 0.1ug/ml, plumbagin vẫn cĩ khả năng ức chế mạnh sự phân chia

của tế bào RD, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là

Trang 28

Bảng 4: Tác động của plumbagin lên dịng tế bào HEp 2 Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%) (pg/ml) Trypan blue MTT Clonogenic 01 14.29+14.14°) 43641455 °) 4916+767° 0.5 23.59 +13.42°] 17.81+19.49°] 99.91+0.19% 1 56.4148.23 ®| 65.07+9.64 ®| 99.95+0.224 5 99.1040.98 “| 8538+634 ^| 9982+021^ 10 100+0.0 3| 9459+3.94 ^| 100+00 4 LSD a= 0.01 12.08 12.53 4.38 Biểu đề 4: Tác động của Plumbagin lên HEp2 100 ¬ 90 ~ wm 80 - S70 - — xe 60 - Wl Trypan blue 8 50 ~ LIMTT 5, Bl Clonogenic - 87 BClenogsenic- 30- =~ 20 - 10 - 9 — Néng d6 Plumbagin (ug/ml) Bang 4 và biểu đồ 4 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào HEp2

Ở nồng độ trên 5 ug/ml, plambagin giết chết hồn tồn tế bào HEp2 (khơng cịn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần như 100% ở cả 3 thử

nghiém trypan blue, MTT va clonogenic

Ở nồng độ trong khoảng 1-0.5 ug/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào HEp2 thể hiện qua tỷ lệ ức chế được xác định bởi thử nghiệm clonogenic

là 100%, hay gần như khơng cĩ colony nào được hình thành trong giếng nuơi, như

vậy tất cả các tế bào đều khơng cĩ khả năng phân chia ở nồng độ plumbagin này

Trang 29

Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MITT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào ee thấp hơn 100% (khoảng 20-60), như vậy chứng tỏ các tế bào HEp2 vẫn

cịn sống được ở nỗng d6 gossypol 1 - 0.5 ug/ml

Ở nỗng độ 0.1ig/ml, pumbagin cũng làm giảm số tế bào HEp2 cĩ khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử aghiệm clonogenic là khoảng

50%

Như vậy:

Ở cả hai hoạt chất, chúng tơi đều dm thấy một nồng độ mà ở đĩ tác động ức

chế phân bảo rất mạnh, gần tương đương với những nồng độ cao gấp 2, 3 lần nhưng

tính gây độc (khơng làm chết tế bào) lại thấp hơn Nẵng độ đĩ là 5 tg/ml đối với gossy pol và 0.5 pg/ral déi voi plumbagin trên cd hai đồng tế bào thử nghiệm Điều

này thể hiện rõ nhất trên tế bào dịng TIEp2 khi xử lý với phumbagin (biểu đồ 4)

Các kết quá thu nhận từ cả ba phương pháp thử nghiệm đều phù hợp với

nhau Phương pháp nhuộm với trypan blue và MỨTT cho phép đánh giá t lệ sống œ tế bào sau khi xử lý với hoạt chất, cịn khả năng phần bào thì được đánh giá bằng phucng phap clonogenic Viée sử dụng phối hợp cả ba phương pháp cho phép khả ẳng định xết quả, đồng thời đánh giá một cách tương đối tồn diện tác động của hoạt

chất lên dịng tế bào ung thư

Trang 30

Phần V: KẾT LUẬN

1 Gossypol va plumbagin đều cĩ tác động lên sự phát triển của 2 đồng tế bảo ung thư RD và HEp2 ở điều kiện khảo sát Tùy theo nỗng độ tác động, gossypol

và plumbagin cĩ thể giết chết bồn tồn, ức chế phân bào hồn tồn hay ức chế

phần bào một phần tế bào ung thư

2 Plumbagin cĩ tính kháng phân bào mạnh hơn Am trên 2 dịng tế bào khảo sát Nẵng độ plumbagin g giết chết 100% tế bào RD là 2 ug/ml, HEp2 là 5 pg/ml

trong khi với gossypol nồng độ phải là 20 g/ml,

3 Tế bào HEp2 ít nhạy cầm với hoạt chất hơn so với tế bào RD Điều này:

ũng phù hợp với đặc tính củ bao HEp2 (phan Ul, rauc 1)

4 Ba phương pháp thử nghiệm sử dụng trong bài này cho phép đánh giá chính xác các mức độ tác động của hoại chất lên sự phát triển của tế bào,

Chúng tơi chân thành cẩm on:

1 Phịng thí nghiệm Virns đường ruột ~ Viện Pasteur TP.HCM đã cung cấp 2

đồng tế bào ung thu và hồ trợ chúng tơi về kỹ thuật nuơi cấy / tế bảo

n sỹ Nguyễn Kim Phi Phụng và cộng sự - Khoa Hĩa học - ĐH Khoa học Tự

nhiên TP.HCM đã cung cấp cho chúng tơi các hoạt chất sử dụng trong để tài

Trang 31

TAI LIEU THAM KHAO

1 Nguyễn Bá Đức, Bộ mơn Ung thư - Đại học Y Hà Nội Bài giáng Ung thư học Nhà xuất bản Y học, 2001

2, Đỗ Trung Đàm Thuốc chữa ung thư Nhà xuất bản Y học, 1995

3 Phan Kim Ngọc, Nguyễn Đăng Quân, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Nguyễn Kim

Thiên Nga, Đỗ Minh S1, Trần Nguyễn Bích Châu Giáo trình thực tập Cơng nghệ

Sinh học Động vật cơ sở Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên

4 Võ Hưng Sơn 1995 Cơ lập plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica Linn, họ Piumbaginaceae Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hố học ĐH

Khoa học Tự nhiên TP.HCM

5 Trần Đệ Thăng 1995 Khảo sát chất gossypol cơ lập từ hột cây bơng Gossypium hirsutum, ho Malvaceae Ludn vdn tot nghiép Cử nhân Hố học ĐH

Khoa học Tự nhiên TP.HCM

6.World Health Organization 1997 Manual for the virological investigation of polio, Global programme for vaccines and immunization 35-37

7 Xin Lin, Wen Kui Li, Pei gen Xiao 1999 Effects of Icariside IL from Epimedium koreanum on tumour cell lines in vitro - Pharm Pharmacol Commun 5:701-703

8 K.V.Anis G.Kutian R.Kutian 1999 Role of Berberine as an adjuvant response modifier during tumour therapy in mice Pharm Pharmacol Commun 5:697 -— 700

9 Keyong Ho Lee, Hee Sun Hong, Chi Ho Lee, Chang Han Kim 2000 Induction of apoptosis in human leukaemic cell lines K562, HL 60 and U 937 by Diethylhexylphthalate isolated from Aloe vera Linne J Pharm.Pharmacol 52: 1037

- 1041

10 Ana M Pintao M Salomé S Pais, Helen Coley, Lloyd R Kelland, Ian R Judson 1995 In viero and in vivo antitumor activity of Benzyl Isothiocyanate: A natural product from Tropaeolum majus Planta Med 61: 233-236

Ll Uma Devi, F.E Solomon A.C Sharada 1999 Plumbagin, a plant

naphthoquinon with anutumor and radiomodifying properties Pharmaceutical