bài báo NGHIÊN cứu bán TỔNG hợp và xác ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ của LUTEOLIN và dẫn XUẤT

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ CỦA LUTEOLIN VÀ DẪN XUẤT THE STUDY OF SEMI−SYNTHESIS OF LUTEOLIN AND DERIVATIVES AND DETERMINATION OF THEIR ANTIOXIDANT ACTIVITY Abstract From abundant rutin material, which is a type of flavonoid, using as medications for blood vessel protection, and ingredients of numerous multivitamin preparations and herbal remedies. Synthesis of flavonoid by hydrolyzing rutin to luteolin is a new method which attracts a lot of attention to research recently. In this research, luteolin was synthesized employing the hydrolysis reaction with two methods, the traditional reflux and reflux in microwave. The reflux has assistant of microwave obtained higher yield (67.15%) and shorter time than traditional reflux. A series of novel luteolin derivatives was synthesized by using esterification reaction, Williamson reaction, and halogenated reaction, then determined antioxidant activity by DPPH method. The structures of synthesis compounds were confirmed by IR, HRMS, HPLC, 1 H-NMR, 13 C-NMR. Their activity were determined by oxidation activity against DPPH showed in that luteolin and LTB had active good oxidation resistance, and third derivatives LAT, LMT, LAB very weak oxidation resistance. These indicated that luteolin’s hydroxyl group (-OH) played a significant role in antioxidant activity. I ĐẶT VẤN ĐỀ Luteolin, một trong những hợp chất flovone phổ biến, tồn tại chủ yếu trong các loại thảo mộc Lonicera japonica, Chrysanthemum morifolium, Nepeta cateria L., và Ajuga decumbens Thunb. Luteolin đã được nghiên cứu rộng rãi vì nó có tác dụng dược lý quan trọng: kháng virus, kháng khuẩn, kháng oxy hoá, Và đã có một vài nghiên cứu mới về hoạt tính của một số dẫn chất của luteolin: chúng còn là tác nhân chống ung thư, kháng oxy hoá, chống viêm, Để tiếp tục và phát triển hướng nghiên cứu về các dẫn xuất của luteolin, đề tài ″Nghiên cứu bán tổng hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hoá của luteolin và dẫn xuất ″ được nghiên cứu nhằm mục tiêu: tổng hợp một số dẫn xuất ester, ether, halogen của luteolin và thử hoạt tính kháng oxy hoá của các dẫn xuất tổng hợp được với hy vọng tìm được các chất có hoạt tính sinh học cao hướng tới nghiên cứu sâu hơn về khả năng ứng dụng trong thực tế. II PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM II.1 Nguyên liệu - Rutin được chiết từ hoa hoè và được làm sạch đạt được độ tinh khiết tổng hợp. - Luteolin được thuỷ phân từ rutin và được làm sạch đạt được độ tinh khiết tổng hợp. - Na 2 S 2 O 4 , (CH 3 ) 2 SO 4 , allyl bromide, KBr, oxon. - NaOH, acetone, acetic anhydride, K 2 CO 3 , CHCl 3 và các hoá chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích. II.2 Phương pháp tổng hợp luteolin và các dẫn xuất của luteolin. 1. Tổng hợp luteolin Rutin 6,015 g (9,86 mmol) được thuỷ phân trong môi trường kiềm bởi natri dithionite 60 g, (0,34 mol) với xúc tác sodium hydroxide (21 mL, 32% ), cho vào cùng với hỗn hợp 600mL H 2 O, hỗn hợp được đun hồi lưu 12h. Dung dịch được lọc qua phễu lọc buchner, và trung hoà bằng acid HCl đến pH=4. Hỗn hợp được làm lạnh và để cho chất bột màu vàng lơ lửng lắng xuống, Lọc và rửa kết tủa thật sạch với nước lạnh trên phễu lọc buchner đến trung tính. Sản phẩn thu được sấy khô đến khối lượng không đổi, thu được sản phẩm thô 1,5905 hiệu suất 56,57% sau đó kết tinh nhiều trong acetone thu được sản phẩm sạch, độ sạch đạt 93,52 %. Quy trình cũng tương tự như trên nhưng dùng bình cầu một cổ đặt bên trong lò vi sóng. Chỉnh công suất 300W, trong vòng 1h (20 phút x 3), có kết hợp với đun hồi lưu, theo dõi phản ứng bằng chấm sắc ký bản mỏng. Dừng phản ứng và xử lý dung dịch tương tự như trên. Lượng chất sử dụng: rutin 3,005 g (4,93 mmol thu được sản phẩm thô 0,9445 hiệu suất 67,15% sau đó kết tinh nhiều trong acetone thu được sản phẩm sạch, độ sạch đạt 97 %. 1. Tổng hợp 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetraacetoxyflavone (LAT) Luteolin 0,5 g (1,75 mmol) được ester hoá bằng acetic anhydride 1,19 g (8,75 mmol) với xúc tác là sodium actate 0,8 g (9,76 mmol), hỗn hợp được đun hồi lưu và theo dõi phản ứng bằng sắc ký bảng mỏng. Sau đó đem đổ dung dịch vào nước đá có khuấy đều, để yên cho các chất bột màu trắng lơ lửng lắng xuống. Lọc và rửa kết tủa thật sạch với nước lạnh trên phễu lọc buchner đến trung tính. Sản phẩm thu được đem sấy khô đến khối lượng không đổi, được làm sạch bằng kết tinh nhiều lần trong acetone, thu được sản phẩm sạch 0,423 g, hiệu suất 53,24%, độ sạch đạt >90%. 2. Tổng hợp 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetrametoxyflavone (LMT) Luteolin 0,5 g (1,75 mmol) được ether hoá bằng tác nhân dimethyl sulfat 1 g (7,9 mmol), với xúc tác K 2 CO 3 5 g trong acetone 50 ml, hỗn hợp được đun hồi lưu và theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Loại bỏ K 2 CO 3 , cô loại dung môi, rửa hỗn hợp bằng nước lạnh trên phễu lọc buchner đến trung tính. Sản phẩm thu được sấy khô, được làm sạch bằng sắc ký cột thu được sản phẩm sạch 0,5428 g, hiệu suất 90,69%, độ sạch đạt >99%. 3. Tổng hợp 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetraallyloxyflavone (LAB) Thực hiện phản ứng tổng hợp tương tự LMT với các tác nhân luteolin (0,5 g, 1,75 mmol) và allyl bromide (2,796 g, 0,0231mol), sau khi làm sạch qua sắc ký cột dung môi CHCl 3 thu được sản phẩm sạch 0,5278 g, hiệu suất 67,62%, độ sạch đạt >94%. 4. Tổng hợp 6,8−dibromo−3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetrahydroxyflavone (LTB) Luteolin 0.46 g (1,61 mmol) được hoà tan trong bình cầu bằng 15 mL aceton. Hỗn hợp sau đó được làm lạnh bằng nước đá ở nhiệt độ 20°C và cho tiếp hỗn hợp gồm oxon (2KHSO 5 .KHSO 4 .K 2 SO 4 ) (2,48 g, 4,039 mmol) và KBr (0,48 g, 4,034mmol). Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Khi phản ứng kết thúc, lọc và cô loại dung môi, sau đó rửa bằng nước lạnh, thu được sản phẩm thô. Xử lý sản phẩm thô qua chạy cột với hệ dung môi CHCl 3 :CH 3 OH (95:5) thu được sản phẩm phẩm sạch dạng bột màu vàng cam 0.3005g, hiệu suất 42,04%, độ sạch đạt >91%. II.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hoá Hoạt tính chống oxy hoá của một chất được xác định bằng phương pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH (Q%) được tính theo: Q%=((A 0 −A c )/A 0 )x100% Trong đó: A 0 là độ hấp thu DPPH khi không có mẫu (mẫu trắng). A c là độ hấp thu của dung dịch phản ứng. Từ đó xác định giá trị IC 50 (giá trị tại đó mẫu ức chế 50% DPPH). Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu khảo sát, sử dụng rutin, quercetin làm chất đối chứng để so sánh. Mẫu đối chứng pha ở 5 nồng độ 5 µg/mL, 20 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, mẫu khảo sát pha ở 4 nồng độ 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL và dung dịch DPPH pha ở nồng độ 200 µg/mL. Lấy 0,25 mL dung dịch mẫu phản ứng với 4,75 mL dung dịch thuốc thử DPPH 200 µg/mL. Để trong bóng tối khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đo UV ở bước sóng 517 nm trên máy đo quang phổ DR−2000 (Viện Công nghệ Hóa học). Ghi nhận giá trị độ hấp thu. Ở mỗi nồng độ được tiến hành đo 2 lần. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1 Nhận dạng cấu trúc 1. Nhận dạng 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetrahydroxyflavone (luteolin) Từ các kết quả đo phổ, sản phẩm được tổng hợp bằng phương pháp vi sóng cho sản phẩm như phương pháp tổng hợp cổ điển. Từ đó thấy ưu việt khi sử dụng lò vi sóng là hiệu suất cao, rút ngắn thời gian. - Sản phẩm thu được có dạng bột màu vàng nhạt, t nc >300 ° C, độ sạch > 97%. - Phổ UV−Vis có ba mũi cực đại tại λ = 347 nm, λ = 267 nm và λ = 253 nm. - Phổ IR (cm -1 ): 3505 cm − 1 (−OH), 3100−3000 cm − 1 (CH , vòng thơm), 1655 cm − 1 (C=O liên kết hidro nội phân tử), 1611 cm − 1 (giãn −C=C− vòng thơm), 1267 cm − 1 (giãn nhóm −C−OH). - Khối phổ HRMS cho pick [M+Na] + = 309,0365 tương ứng với trọng lượng phân tử 286, công thức phân tử C 15 H 10 O 6 . - Phổ 1 H-NMR (DMSO, δ ppm): 6,66 (1H; s; H−2); 6,19 (1H; d; J 6 − 8 = 2Hz; H−6); 6,44 (1H; d; J 8 − 6 = 2Hz; H−8); 7,39 (1H; d; J 2 ′− 6 ′ = 2,2 Hz; H−2 ′ ); 6,89 (1H; d; J 5 ′− 6 ′ = 8,25 Hz; H−5 ′ ); 7,41 (1H; dd; J 6 ′− 2 ′ = 2,2 Hz; và J 6 ′− 5 ′ = 8,25 Hz; H−6 ′ ); 12,96; 10,79; 9,89; 9,38 ( OH −5,7,3 ′ ,4 ′ ). - Phổ 13 C-NMR (DMSO, δ ppm): 163,89 (C-2); 102,87 (C-3); 181,62 (C-4); 161,47 (C-5); 98,81 (C-6); 164,09 (C-7); 93,81 (C-8); 157,28 (C-9); 103,69 (C-10); 121,53 (C-1 ′ ); 116,01 (C-2 ′ ); 145,72 (C-3 ′ ); 149,67 (C-4 ′ ); 116,01 (C-5 ′ ); 118,95 (C-6 ′ ). Theo kết quả phân tích phổ cho thấy đã tổng hợp được sản phẩm luteolin theo đúng lý thuyết và nó đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp các dẫn xuất tiếp theo. 2. Nhận dạng 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetraacetoxyflavone (LAT) - Sản phẩm thu được có dạng dạng hình kim màu trắng, t nc ( ° C) = 223−225 ° C , độ sạch >90%. - Phổ IR (cm -1 ): 2938 (−CH3), 3069 (=CH−, vòng benzene), 1772 (C=O este), 1639 (C=O), 1373 (O−CO−CH 3 ), 1205 (−C−O−), 1772 (C=O ester). - Khối phổ MS cho pick [M+H + ]= 455,0999 tương ứng với trọng lượng phân tử 454, công thức phân tử C 23 H 18 O 10 . - Phổ 1 H-NMR (DMSO, δ ppm): 6,95 (1H; s; H−3); 7,09 (1H; d; J 6 − 8 = 2,5Hz; H−6); 7,64 (1H; d; J 8 − 6 = 2,5Hz ; H−8); 8,04 (1H; d; J 2 ′− 6 ′ = 2 Hz ; H−2 ′ ); 7,50 (1H; d; J 5 ′− 6 ′ = 9 Hz ; H−5 ′ ); 8,05 (1H; dd; J 6 ′− 2 ′ = 2 Hz, và J 6 ′− 5 ′ = 9 Hz; H−6 ′ ); 2,32−2,51 (12H; s; 4×CH 3 ). - Phổ 13 C-NMR (DMSO, δ ppm): 156,99 (C-2); 114,23 (C-3); 175,33 (C-4); 153,91 (C-5); 109,79 (C-6); 160,15 (C-7); 108,30 (C-8); 149,37 (C-9); 114,36 (C-10); 129,09 (C-1 ′ ); 121,87 (C-2 ′ ); 142,50 (C-3 ′ ); 144,77 (C-4 ′ ); 124,48 (C-5 ′ ); 124,89 (C- 6 ′ ); 20,25−20,81 (4×CH 3 ), 167,90−168,72 (4×C=O, ester). 3. Nhận dạng 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetramethoxyflavone (LMT) - Sản phẩm thu được có dạng bột vàng ánh xanh, t nc ( ° C) = 192−194 ° C, độ sạch >99%. - Phổ IR (cm -1 ): 3085 (=CH−, vòng benzene), 2840−2943 (−CH 3 ), 1605 (C=C thơm), 1163 (−C−O−C−). - Khối phổ HRMS cho pick [M+H + ]= 343,1135 tương ứng với trọng lượng phân tử 342, công thức phân tử C 19 H 18 O 6 . - Phổ 1 H-NMR (DMSO, δ ppm): 6,76 (1H; s; H−3); 6,49 (1H; d; J 6 − 8 = 2,5Hz; H−6); 6,86 (1H; d; J 8 − 6 = 2,5Hz; H−8); 7,52 (1H; d; J 2 ′− 6 ′ = 2 Hz; H−2 ′ ); 7,09 (1H; d; J 5 ′− 6 ′ = 8,5 Hz; H−5 ′ ); 7,63 (1H; dd; J 6 ′− 2 ′ = 2 Hz, và J 6 ′− 5 ′ = 8,5 Hz; H−6 ′ ); 3,83−3,90 (12H; s; 4×OCH 3 ). - Phổ 13 C-NMR (DMSO, δ ppm): 160,20 (C-2); 107,03 (C-3); 175,64 (C-4); 159,65 (C-5); 96,16 (C-6); 163,59 (C-7); 93,38 (C-8); 159,11 (C-9); 108,26 (C-10); 123,11 (C-1 ′ ); 109,11 (C-2 ′ ); 148,99 (C-3 ′ ); 151,55 (C-4 ′ ); 111,64 (C-5 ′ ); 119,27 (C-6 ′ ); 55,65−55,99(4×OCH 3 ). 4. Nhận dạng 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetraallyloxyflavone (LAB) - Sản phẩm thu được có dạng vàng nhạt, t nc ( ° C) = 100−107 ° C, độ sạch >94%. - Phổ IR (cm -1 ): 3068 (=CH−, vòng benzene), 2982−2920−2863 (−CH 2 −),1599 (C=C thơm), 1179 (−C−O−C−). - Khối phổ MS cho pick [M+H] + = 447,1821 tương ứng với trọng lượng phân tử 446, công thức phân tử C 27 H 26 O 6 . - Phổ 1 H-NMR (DMSO, δ ppm): 6,71 (1H; s; H−3); 6,53 (1H; d; J 6 − 8 = 2,5Hz; H−6); 6,87 (1H; d; J 8 − 6 = 2,5Hz; H−8); 7,57 (1H; d; J 2 ′− 6 ′ = 2 Hz; H−2 ′ ); 7,13 (1H; d; J 5 ′− 6 ′ = 8,5 Hz; H−5 ′ ); 7,61 (1H; dd; J 6 ′− 2 ′ = 2 Hz, và J 6 ′− 5 ′ = 8,5 Hz; H−6 ′ ); 4,64−4,72 (8H; 4×−CH 2 −); 6,02−6,12 (4H; 4×−CH=); 5,28−5,69 (8H; 4×=CH 2 ). - Phổ 13 C-NMR (DMSO, δ ppm): 159,48 (C-2); 107,09 (C-3); 175,53 (C-4); 158,97 (C-5); 97,59 (C-6); 162,28 (C-7); 94,31 (C-8); 158,94 (C-9); 108,54 (C-10); 123,31 (C-1 ′ ); 111,19 (C-2 ′ ); 147,97 (C-3 ′ ); 150,67 (C-4 ′ ); 113,46 (C-5 ′ ); 119,48 (C-6 ′ ); 68,84−69,19 (4×−CH 2 −); 132,81−133,68 (4×−CH=); 116,94−118,09 (4×=CH 2 ). - Phổ DEPT (DMSO): Phổ DEPT 90 cho 10 mũi dương 107,09; 97,59; 94,31; 111,19; 113,46; 119,48; 132,81−133,68 của nhóm =CH−, DEPT 135 10 mũi dương 107,09; 97,59; 94,31; 111,19; 113,46; 119,48; 132,81−133,68 của nhóm =CH− và 8 mũi âm 68,84−69,19 (4×−CH 2 −); 116,94−118,09 (4×=CH 2 ). 5. Nhận dạng 6,8−dibromo−3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetrahydroxyflavone (LTB) - Sản phẩm thu được có dạng bột màu vàng cam, t nc (°C) 285−287 °C, độ sạch >91%. - Phổ IR (cm -1 ): 3480 (−OH), 3063 (=CH−, vòng benzene), 1645 (C=O liên kết hydro nội phân tử), 1256 (C−O−), 694 (C−Br). - Khối phổ MS cho pick [M+H] − = 442,8599 tương ứng với trọng lượng phân tử 444, công thức phân tử C 15 H 8 O 6 Br 2. - Phổ 1 H-NMR (DMSO, δ ppm): 6,88 (1H; s; H−3); 7,51 (1H; d; J 2 ′− 6 ′ = 2 Hz; H−2 ′ ); 6,92 (1H; d; J 5 ′− 6 ′ = 8 Hz; H−5 ′ ); 7,53 (1H; dd; J 6 ′− 2 ′ = 2 Hz, và J 6 ′− 5 ′ = 8 Hz; H−6 ′ ); 13,95; 10,06; 9,47; 8,31 (OH−5, 7, 3 ′ ,4 ′ ) - Phổ 13 C-NMR (DMSO, δ ppm): 164,27 (C-2); 102,63 (C-3); 181,10 (C-4); 157,01 (C-5); 94,37 (C-6); 164,27 (C-7); 88,24 (C-8); 152,12 (C-9); 104,61 (C-10); 121,01 (C-1 ′ ); 113,67 (C-2 ′ ); 145,79 (C-3 ′ ); 150,19 (C-4 ′ ); 116,05 (C-5 ′ ); 119,28 (C-6 ′ ). III.2 Kết quả xác định hoạt tính kháng oxy hoá bằng phương pháp DPPH Giá trị SC 50 (µg/mL) của các mẫu: Rutin 6 (µg/mL), quercetin 2,8 (µg/mL), luteolin 3 (µg/mL), LAT>100 (µg/mL), LMT >100 (µg/mL), LAB >100 (µg/mL), LTB 4,2 (µg/mL) Các kết quả so với mẫu chứng cho thấy trong 4 mẫu khảo sát có 2 mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do mạnh là luteolin và LTB giá trị (IC 50 <25 µg/mL), hoạt tính ức chế của luteolin gần tương đương với quercetin, cao hơn rutin; hoạt tính của LTB giảm xuống so với quercetin và luteolin, nhưng vẫn cao hơn so với rutin. Điều này cho thấy khả năng đóng góp quan trọng của các nhóm −OH trên khung flavone vào khả năng bắt gốc tự do của chất. IV KẾT LUẬN 1. Tổng hợp luteolin từ nguồn nguyên liệu rutin, thu được sản phẩm có độ tinh khiết >97%, và phương pháp có sử dụng lò vi sóng đạt hiệu quả cao hơn. 2. Từ luteolin thu được, đã tổng hợp được bốn dẫn xuất 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetraacetoxyflavone, 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetramethoxyflavone, 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetraallyloxyflavone, 6,8−dibromo−3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetrahydroxyflavone có độ tinh khiết cao. 3. Bằng các phương pháp phân tích hoá lý hiện đại như đo nhiệt độ nóng chảy, UV, IR, HPLC, HRMS, 1 H−NMR, 13 C−NMR đã xác định được cấu trúc sản phẩm tổng hợp. 4. Các chất tinh khiết trên được thử hoạt tính kháng oxy hoá bằng phương pháp DPPH. Kết quả cho thấy luteolin và LTB có hoạt tính kháng oxy hoá mạnh, cụ thể SC 50 ( luteolin ) =3 µg/mL, SC 50 ( LTB ) =4,2 µg/mL, ba dẫn xuất còn lại LAT, LMT, LAB có khả năng kháng oxy hoá rất yếu. V TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Trọng Đạt, Phùng Văn Trung, Phan Nhật Minh, Hoàng Thị Ngọc Dung, Phạm Cao Thanh Tùng, Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học − công nghệ năm 2003, trang 150−154, (2003). 2. Hoàng Thị Kim Dung , Tổng hợp dẫn xuất của flavonoid ( rutin, quercetin, hesperidin, hesperretin ) và xác định hoạt tính sinh học của chúng, Luận án Tiến sĩ Hoá học, Viện Công nghệ Hoá học, Thành phố Hồ Chí Minh, 2010. 3. Nguyễn Trung Nhân, Phạm Thị Minh Hiền, Tạp chí Hoá Học, T.49, số 6A, tr. 159 – 164 (2011). 4. Pier-Giorgio Pietta, J. Nat. Prod, 63 1035-1042 (2000). 5. Herwig Buchholz, Frankfurt (DE), Raft Rosskpf, Munster (DE), Alice Lichtenberg, Darmstadt (DE), Christine Kraus, Schwarzheide (DE), Method for producing luteolin and luteolin derivatives, United States Patent, 2003. . hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hoá của luteolin và dẫn xuất ″ được nghiên cứu nhằm mục tiêu: tổng hợp một số dẫn xuất ester, ether, halogen của luteolin và thử hoạt tính kháng oxy hoá của. NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ CỦA LUTEOLIN VÀ DẪN XUẤT THE STUDY OF SEMI−SYNTHESIS OF LUTEOLIN AND DERIVATIVES AND DETERMINATION. số dẫn chất của luteolin: chúng còn là tác nhân chống ung thư, kháng oxy hoá, chống viêm, Để tiếp tục và phát triển hướng nghiên cứu về các dẫn xuất của luteolin, đề tài Nghiên cứu bán tổng hợp