Nghiên cứu bán tổng hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hóa của diosmin và dẫn xuất

Diosmin được đem đi thủy phân trong môi trường acid sulfuric/acidacetic/nước tạo thành aglycone của nó là diosmetin H=87%, từ diosmetin đã tổnghợp được 3 dẫn xuất: 3,5,7triacetoxy4m

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới người hướng dẫn khoa học tận tâm của

em – TS Hoàng Thị Kim Dung – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Hóa học  ViệnKhoa học Công nghệ Việt Nam Cô đã hướng dẫn rất nhiệt tình, động viên tinh thầntrong những thời khắc khó khăn, là một tấm gương trong công việc cũng như đờithường

Xin thể hiện sự biết ơn đến tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa  Trường Đại học CầnThơ, quý Thầy Cô Viện Công nghệ Hóa học  Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, vì

đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tập

Vì sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo điều kiện tốt nhất trong việc hoàn thành luận văn,

em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Trần Ngọc Quyển, Th.s Trịnh Thị Thanh Huyền,

KS Lý Tú Uyên, KS Nguyễn Hoàng cùng các anh chị Phòng Hoá Hữu Cơ & Polymer

 Viện Công nghệ Hóa học  Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

Ngoài ra, em không thể thể hiện sự biết ơn của em đến những người anh, ngườichị, người bạn khóa 16 và 17 lớp cao học hóa Hữu cơ – Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ

em trong suốt quá trình học vừa qua

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các quý Thầy Cô trong hội đồng bảo vệ đãđọc và đưa ra những nhận xét quý báu giúp em hoàn chỉnh cuốn luận văn này

Cuối cùng, sẽ là thiếu sót to lớn nếu không nhắc đến gia đình em Đặc biệt là ba

mẹ - người đã luôn theo sát, hỗ trợ em từng phút từng giây trong suốt thời gian qua và

cả sau này!

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2012

Huỳnh Thị Kim Chi

TÓM TẮT

Diosmin là một loại flavone tự nhiên có tác dụng làm bền thành mạch máu,chữa suy tĩnh mạch, bệnh trĩ, tiểu đường, ung thư Trong nghiên cứu này, diosminđược bán tổng hợp từ hesperidin – là một loại flavanone phổ biến trong họ citrus –bằng tác nhân iodine, sodium hydroxide trong dung môi pyridine cho hiệu suất cao(76%) Diosmin được đem đi thủy phân trong môi trường acid sulfuric/acidacetic/nước tạo thành aglycone của nó là diosmetin (H=87%), từ diosmetin đã tổnghợp được 3 dẫn xuất: 3,5,7triacetoxy4methoxyflavone (DTA),

3,4,5,7tetramethoxyflavone (DTM), 3,5,7triallyloxy4methoxyflavone (DTAl).Các phổ IR, HRMS, HPLC, 1HNMR, 13CNMR được dùng để xác định cấu trúc củasản phẩm, khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp đo độ hấp thu DPPH

1,1  diphenyl  2  picryl  hydrazyl và gây độc tế bào theo phương pháp SRB(Sulforhodamin B) trên các dòng tế bào ung thư như MCF-7, NCI-H460 và Hep G2.Kết quả khảo sát cho thấy khả năng kháng oxy hóa của diosmetin là mạnh nhất(SC50=291µg/mL) , các mẫu diosmin, DTA, DTM và DTAl đều có hoạt tính thấp Khảnăng gây độc tế bào của DTA trên hai dòng MCF-7 và Hep G2 là mạnh nhất (IC50 lầnlượt là 85.34 và 73.89 µg/mL), các mẫu khác đều có hoạt tính yếu

ABSTRACT

Diosmin is a natural flavone having durable effect on blood vessels, varicoseveins, hemorrhoids, diabetes, and cancer In this study, diosmin was semi synthesized

from hesperidin - a popular flavanone in the citrus family - with iodine and sodium

hydroxide agents in pyridine solvent for high efficiency, yield: 76% Diosmin washydrolysed in H2SO4/CH3COOH/H2O mixture forming its aglycone that was diosmetin(H=87%) Three diosmetin derivatives were semi synthesized, including

3,5,7triacetoxy4methoxyflavone (DTA), 3,4,5,7tetramethoxyflavone (DTM),

3,5,7triallyloxy4methoxyflavone (DTAl) The IR, HRMS, HPLC, 1H-NMR, 13NMR spectra were used to determine the structures The antioxidant activity wasmeasured by the absorption of DPPH 1,1diphenyl2picrylhydrazyl and the SRB(Sulforhodamin B) method was used to estimate antiproliferation activity on thecancer cell lines: MCF-7, NCI-H460, Hep G2 The results showed that antioxidant

C-capacity of diosmetin was the best The antiproliferation ability of DTA was the mostpowerful on two lines MCF-7 and Hep G2.

MỞ ĐẦU

Từ xưa, con người đã biết sử dụng các dược thảo để chữa bệnh rất hiệu quả.Cho đến nay, các nhà khoa học đã xác định được phần lớn cấu trúc hóa học của cáchợp chất có trong cây cỏ có hoạt tính sinh dược học, giải thích được cơ chế chữa bệnhtrong dân gian của các hợp chất Từ đó, có thể làm giàu và tăng tác dụng sinh dược củachúng Không chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu các hợp chất có cấu trúc từ cây cỏ, conngười còn nghiên cứu tổng hợp ra các dẫn xuất có hoạt tính sinh dược học mạnh hơn,góp phần vào lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người ngày một nâng cao

Trên cơ sở hesperidin, một loại flavonoid có trong nhiều cây thuộc họ camquýt, chiếm hàm lượng 2–3% trong vỏ quýt, một loại cây có sẵn và trồng nhiều ở ViệtNam, chúng tôi bán tổng hợp diosmin Diosmin đã được sử dụng trong hơn 30 nămnhư là một tác nhân bảo vệ thành mạch, và gần đây đã bắt đầu được nghiên cứu chocác mục đích trị liệu khác bao gồm cả ung thư, hội chứng tiền kinh nguyệt, viêm đạitràng và bệnh tiểu đường(63) Tuy nhiên, giá thành các biệt dược chứa diosmin còncao, phải nhập khẩu từ nước ngoài, ngăn cản người dân sử dụng rộng rãi để phòngngừa và chữa trị các bệnh suy tĩnh mạch – tiêu biểu là bệnh trĩ

Bước đầu chúng tôi thủy phân ra diosmetin để tiến hành tổng hợp một vài dẫnxuất của diosmin sau này, xét nghiệm tính kháng oxy hóa, gây độc trên tế bào của cáchợp chất tìm được Từ đó làm nền tảng để thực hiện những bước tổng hợp các dẫnxuất khác tiếp theo trong những nghiên cứu sâu hơn

Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

bán tổng hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hóa của diosmin và dẫn xuất”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Flavonoid

1.1.1 Phân bố

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Hơn một nửarau quả thường dùng có chứa flavonoid Cho đến nay đã có khoảng 4000 chất đã đượcxác định cấu trúc Chỉ riêng 2 nhóm flavone và flavonol với nhóm thế là OH hoặcOCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38627 chất Phần lớn các chất flavonoid có màuvàng Tuy nhiên, một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác không có màu

Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoidnhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon

1.1.2 Cấu trúc hóa học

Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropane nghĩa là 2 vòng benzene A và B nối với nhau qua một dây có 3 carbon, haynói cách khác là cấu tạo khung kiểu C6 – C3 –C6 Cấu trúc là một vòng kín hoặc hở

Cách đánh số tuỳ theo dây C3 đóng hay hở, nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu

từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng Bđánh số phụ Nếu dây C3 hở thì đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.[2,3,4]

OH

4

3 2

O

B A





2' 3' 4'

5'

6 5

8

2 O 1

O

2'

3' 4'

Thường flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân

A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặcdạng glycoside Các đường thường gặp nhất là đường D- glucose, kế đó là D-galactose, L- rhamnose, L-arabinose, D-apipse và acid uronic.[4]

Trong đa số trường hợp thì mạch 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dịvòng C có chứa oxy Dị vòng C có thể là dihyroxypyrane, γ- pyrone, dihyro γ- pyrone

O O O

Dihydropyran -pyrone Dihydro -pyroneTại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc đã thay thế mộtphần vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính acid.[3,4]

Các polyphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxyl để tạo thànhcác phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như cácoza (dạng glycoside), hoặc protein.[5]

1.1.3 Phân loại flavonoid

Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl vòng B và các mức độ oxyhóa của mạch 3 carbon Gồm có flavone, flavanone, flavonol, dihydroflavonone,chalcone dihydrochalcone, aurone, anthoxyanidin 2phenylbenzo pyrilium,leucoanthoxyanidin, isoflavone, rotenoid, neoflavonoid, biflavonoid

1.1.4 Vai trò của flavonoid

a)

Vai trò đối với các phản ứng sinh hoá [6,7 ]

Các nhóm phenol có vai trò trong sự hoà tan các chất vì di chuyển dễ dàng quacác màng sinh học, một số có tác dụng như chất kháng oxy hoá, bảo vệ như acidascorbic, một số có tác dụng ức chế enzyme và các chất độc của cây

b)

Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng [ 8,9,10]

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nhóm chức hydroxyl có vai trò quyếtđịnh về tính kích thích cũng như ức chế khả năng sinh trưởng

Ví dụ: trong ổi flavonoid có nhóm hydroxyl ở 4’ làm tăng hoạt tính sinh trưởng,còn flavonoid có nhóm hydroxyl ở cả 3’ và 4’ thì lại có tính ức chế

c)

Vai trò tạo màu [11,12,13 ]

Flavonoid có khả năng tạo màu cho thực vật để trông hấp dẫn hơn Các flavone,flavonol, aurone, chalcone thì có màu vàng Còn các anthocyanin thì có thể có màuhồng, đỏ, tím, xanh

Vai trò bảo vệ cây [ 14]

Một số flavonoid không màu trong lá có khả năng bảo vệ cây, ngăn động vật ăn

tự do như OH●, ROO● gây ra các bệnh như ung thư, lão hoá…

Flavonoid tạo phức với các ion kim loại mà những kim loại này là xúc tác chocác phản ứng oxy hoá Thành phần màng tế bào có các lipid dễ bị peroxide hoá sinh rasản phẩm làm rối loạn trao đổi chất và huỷ hoại tế bào

Flavonoid cùng với các acid ascorbic tham gia quá trình hoạt động của enzymeoxy hoá- khử Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase (enzyme này làm tăngtính thấm của mao mạch) Khi hyaluronidase thừa sẽ gây hiện tượng xuất huyết dưới

da hay còn gọi thiếu vitamin P Thí nghiệm cho thấy flavonoid có nhóm OH ở 3 , 4 thìꞌ, 4ꞌ thì ꞌ, 4ꞌ thìnâng cao tính bền vững thành mạch

f)

Vai trò kháng ox y hoá [ 19,20]

Flavonoid có đặc tính sinh học mạnh: kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng

viêm…Trong các nghiên cứu in vitro, hoạt tính của flavonoid được khảo sát bằng cách

cho phản ứng với các chất tương ứng, thường là các gốc tự do như ABTS, DPPH,AAPH, O●, ●OOH, ●OH….trong các môi trường khác nhau

Tác dụng kháng oxy hoá của flavonoid là ngăn sự hình thành gốc tự do, làmsạch gốc tự do và điều chỉnh khả năng kháng oxy hoá của cơ thể Flavonoid ngăn cảncác enzyme tạo thành gốc tự do phản ứng Trong môi trường có ion kim loại đồng, sắt

có thể phản ứng oxy hoá khử với H2O2 và protein tạo thành gốc tự do, flavonoid sẽ tạophức với ion kim loại ở nhóm catechol của vòng B, vị trí 3,4 của vòng C, vị trí 4,5 củavòng A

1.2 Diosmin

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

a)

Các nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 2011, Nguyễn Thị Mỹ Duyên (58) đã nghiên cứu quy trình bán tổng hợp

diosmin từ hesperidn dựa theo nghiên cứu của Lorette et al(30) và sử dụng tác nhân

phản ứng oxone®/sodium bromide Quy trình bán tổng hợp của Lorette được tiếp tụckhảo sát điều kiện tối ưu, hiệu suất toàn phần là 45.8%

g)

Các nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu về kĩ thuật chuyển đổi hesperidinthành diosmin bằng các tác nhân phản ứng khác nhau như tác nhân NBS kết hợpbenzoyl peroxide, tác nhân selen dioxide, tác nhân iodine, tác nhân bromo lỏng, tácnhân postassium iodide…

Qua trung gian hesperidin octaacetate và tác nhân NBS(30)

Hesperidin được acetate hóa bằng tác nhân natri acetate trong dung môi anhydrideacetic Sản phẩm acetate được đem phản ứng với NBS và benzoyl peroxide trong dungmôi chloroform Sản phẩm sau phản ứng được xử lý với ethanol, NaOH và H2SO4

OH HO

O

HO

O

OH HO HO

O OCCH 3

O

O O O

CH 3 COONa (CH 3 CO) 2 O O

OH

O

O

OH OCH 3 O

OH HO

O

Qua trung gian hesperidin octaacetate và tác nhân selen dioxide(31)

Octaacetate hesperidin được đem phản ứng với SeO2 trong dung môi isoamylalcohol Hỗn hợp sau phản ứng được lọc nóng để loại Se, sau đó hỗn hợp được xử lývới NaOH, HCl và ethyl acetate.

OH HO

O

HO

O

OH HO HO

O

O O O

CH 3 COONa (CH 3 CO) 2 O O

OH

O

O

OH OCH 3 O

OH HO

Hesperidin được đem phản ứng với iodine trong dung môi pyridine trong 9 –

10 giờ Hỗn hợp sau phản ứng được đem xử lý lần lượt với alcohol, natrithiosulfate và NaOH Diosmin thô được kết tinh trong dung dịch DMF

OH HO

O OH HO

O

HO

O

OH HO HO

H 3 C

Pyridine

I 2

Quy trình bán tổng hợp diosmin của Zemplen và Bogner 59

Zemplen và Bogner đã mono bromo hóa acetyl flavanone bằng dung dịchbromo lỏng trong chloroform với sự có mặt tia cực tím để có được dẫn xuất flavone.Bằng cách lấy đi hydrogen bromide và khử acetyl hóa với cồn kiềm Hiệu suất của quátrình chuyển đổi được ghi nhận là 37%

Theo sáng chế ES459076 (59)

Diosmin được tổng hợp bằng phản ứng bromo hóa và khử bromo hóahesperidin acetate trong tetrahydrofuran với 2-carboxy ethyl triphenyl phosphoniumbromide theo sau đó là sự xà phòng hóa với kali butoxide Sáng chế không nêu rõ hiệusuất toàn phần cũng như độ sạch của diosmin

Theo sáng chế FR2760015 (59)

Khử hydrogen của hesperidin với postassium iodide trong DMSO với sự có mặt

H2SO4 đặc để tạo ra sản phẩm diosmin với hiệu suất 73%

Bán tổng hợp Linarin, Acacetin, dẫn xuất 6-Iodoapigenin từ diosmin[22]

Linarin là hoạt chất chính của một số cây thuốc như Buddleia cordata của

Mexico và Chrysanthemum zawadskii var latilobum của Hàn Quốc Gần đây, linarin đã được nhận ra có trong thảo dược Valeriana officinalis, và lần đầu tiên

được mô tả là có hoạt tính an thần và gây ngủ Dẫn xuất 6-Iodoapigenin được biếtđến là trung gian quan trọng cho việc dẫn đến một số biflavonoids với hai đơn vịapigenin kết nối thông qua ít nhất một vị trí thứ 6 chẳng hạn như robustaflavone,một chất ức chế virus viêm gan B (HBV) Tổng hợp linarin hoặc dẫn xuất 6-Iodoapigenin từ diosmin yêu cầu loại bỏ các nhóm 3-hydroxyl trong một chuỗihai bước khử loại oxy deoxygenation

Các acid và ester của diosmetin[24]

7-carboxymethoxy-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxy-2-propylphenyl)-4H-1-be

nzo-pyran-4-one Nghiên cứu dược tính cho thấy các hợp chất acid và ester củadiosmetin có thể được sử dụng như thuốc chữa bệnh trong điều trị suy tĩnh mạchmãn tính và các rối loạn khác liên quan đến sự tăng tính thẩm thấu và chứng viêm

1.2.2 Các loại cây có chứa diosmin(25-27)

Diosmin được tìm thấy nhiều ở các bộ phận thuộc chi citrus nhất là ở vỏ quả

ngoài, vỏ quả giữa, dịch quả

Diosmin được phân lập lần đầu tiên vào năm 1925 từ họ mõm chó

(Scrophularia nodos) Nó cũng được tìm thấy trong quả cây phật thủ Trong cây tề thái

có chứa diosmin và cả hesperidin Tuy nhiên vẫn chưa thấy tài liệu công bố về hàmlượng cụ thể của diosmin trong các loại cây này

Ngoài ra, diosmin còn được phân lập từ chi đậu (Vicia) và cây hương bài (Hyssopus officinalis) bởi M.N.Ivashev và cộng sự Cây hương bài được trồng và mọc

nhiều nơi trong nước ta: Nghệ An, Hà Tĩnh… Rễ cây có mùi thơm nhẹ đặc biệt, ngườidân vùng Tiền Hải tỉnh Thái Bình trồng để lấy rễ làm hương thắp

1.2.3 Cấu tạo của diosmin

Tên thường gọi: diosmin, diosmetin-7-rhamnoglucoside,

5-Hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[ [(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxychro

men-4-one

Công thức phân tử: C28H32O15

Khối lượng phân tử: 608

Công thức cấu tạo

7

6

9 8

2 O 1

OH

O

O

1' 6' 5'

4' 3' 2'

OH OCH 3

1'' O 5'' 4'' 3'' 2'' OH HO

6'' O 1'''

HO

2''' 3''' 4''' 5''' O

OH HO HO

H 3 C 6'''

1.2.4 Tính chất vật lý(28)

Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, không mùi Tan tốt trong dung dịch kiềm,DMSO, tan ít trong dung dịch DMF Độ tan (ở 25C) của diosmin trong các dung môi

đó lần lượt tương ứng là 20.4, 11.9, 1.7 g/100ml

Khối lượng riêng: 1.68 g/cm3

mg hesperidin hàng ngày trong sáu tháng Các triệu chứng lâm sàng liên tục được cảithiện trong suốt quá trình nghiên cứu, và đã nâng cao chất lượng cuộc sống cho nhữngngười tham gia Hỗn hợp flavonoid này cũng có hiệu quả trong giai đoạn điều trị suytĩnh mạch mạn tính nghiêm trọng, bao gồm cả loét tĩnh mạch và làm chậm đi quá trìnhsuy tĩnh mạch Trong một thí nghiệm ngẫu nhiên để so sánh khả năng điều trị loét tĩnhmạch bằng hỗn hợp 900 mg diosmin cộng với 100 mg hesperidin so với việc điều trịkhông dùng hỗn hợp flavonoid trên đã được tiến hành Kết quả có 47% bệnh nhântrong nhóm điều trị bằng bằng hỗn hợp diosmin và hesperidin đã được chữa khỏi hoàntoàn vết loét so với nhóm không dùng hỗn hợp là 28% ở các vết loét có đường kínhdưới 10 cm

h)

Chữa b ệnh t rĩ(36-38 )

Một số nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh diosmin có hiệu quả trong điều trịcác triệu chứng cấp tính và mãn tính của bệnh trĩ Một nghiên cứu trong đó 120 bệnhnhân được kiểm soát bằng giả dược (hỗn hợp 90% diosmin và 10% hesperidin) vớiliều 500 mg mỗi ngày trong vòng hai tháng, đã kiểm soát tốt cũng như cải thiện đượccác triệu chứng ngứa, đau đớn, chảy nước, phù, ban đỏ và xuất huyết Đối với nhữngngười đang mang thai, việc sử dụng diosmin trong điều trị bệnh trĩ không ảnh hưởngxấu đến thai kỳ, sự phát triển đến thai nhi, cân nặng cũng như sự phát triển của trẻ saunày Với những người bị bệnh trĩ cấp tính đang cho con bú cũng như đang mang thai,việc điều trị được thực hiện tám tuần trước khi sinh và bốn tuần sau khi sinh Hơn mộtnửa số phụ nữ tham gia nghiên cứu đã giảm các triệu chứng từ ngày thứ tư Diosmin

không gây đột biến cũng như không có bất kỳ ảnh hưởng đáng kể nào đến chức năngsinh sản.

i)

Chữa sưng phù do rối loạn hệ bạch huyết (39-41 )

Diosmin hoạt động trên hệ thống bạch huyết bằng cách tăng lưu lượng bạchhuyết Hỗn hợp flavonoid có chứa diosmin đã được sử dụng để điều trị chứng phù chitrên thứ cấp do rối loạn hệ bạch huyết Kết quả cho thấy đã cải thiện được các triệuchứng và khối lượng chi, khối lượng của chân tay bị sưng giảm trung bình 6.8%.Ngoài ra, các thông số đánh giá chức năng bạch huyết được cải thiện đáng kể Diosmincòn cải thiện đáng kể các vết bỏng và sưng giập phổi

j)

Chữa bệnh tiểu đường(42-45 )

Diosmin được chứng minh là cải thiện các yếu tố liên quan với các biến chứngtiểu đường Lượng đường trong máu và áp lực oxy hóa được theo dõi ở các bệnh nhântiểu đường tuýp 1 trước và sau khi can thiệp bằng một hỗn hợp flavonoid có chứadiosmin: lượng hemoglobin A1c giảm đi kèm với sự gia tăng của enzyme thúc đẩy quátrình oxy hóa glucose, chứng tỏ lượng đường trong máu đã giảm và hoạt động chốngoxy hóa được gia tăng

Diosmin có thể bình thường hóa tốc độ lọc của mao mạch và ngăn ngừa thiếumáu cục bộ ở bệnh nhân tiểu đường Nghiên cứu lưu biến của bệnh nhân tiểu đườngtuýp 1 cho thấy diosmin tạo điều kiện thuận lợi cho việc cải tiến các đặc tính dòngchảy của máu do sự giảm tổng hợp hồng cầu, dẫn đến giảm ứ đọng máu và thiếu máucục bộ

k)

U ng thư (46,47 )

Những ảnh hưởng của diosmin đối với các dòng tế bào ung thư của con ngườitrên động vật đã được nghiên cứu và được cho là thuốc phòng ngừa và ức chế sự tăngsinh tế bào ung thư Nhiều nghiên cứu lâm sàng trong lĩnh vực này đã được tiến hành

là để xác định liều lượng có hiệu quả của diosmin đối với các dòng ung thư ở người

Các nghiên cứu về ảnh hưởng của chế độ ăn uống có chứa riêng rẽ hoặc kết hợphai chất flavonoid diosmin và hesperidin (90% diosmin + 10% hesperidin) trong suốtthời gian sau khi được nhận azoxymethane (AOM) – chất gây ung thư đại tràng đã

được nghiên cứu trên những con chuột F344 đực Các chỉ số sinh học chỉ sự phát triểncủa tế bào ung thư đã giảm đáng kể, ngoài ra chế độ ăn còn giảm đáng kể các chỉ số 5 -ꞌ, 4ꞌ thìbromodeoxyuridine và số hạt nhân tổ chức trong các tế bào ung thư Những kết quảnày chỉ ra rằng dùng riêng rẽ hoặc kết hợp diosmin và hesperidin có tác dụng như mộttác nhân chống lại ung thư ruột kết Hiệu quả của tác dụng đó có thể là do ức chế sựtăng sinh tế bào ung thư.

Các tác dụng phòng ngừa của hai flavonoid (diosmin và hesperidin) trên butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) – chất gây ra ung thư bàng quangtiết niệu đã được tiến hành trên những con chuột đực Khi cho chúng ăn chế độ ăn cóchứa riêng rẽ hoặc kết hợp cả hai loại flavonoid nói trên (90% diosmin + 10%hesperidin) đều có hiệu quả trong việc ức chế ung thư bàng quang và ức chế sự tăngsinh của tế bào ung thư

N-1.3 Dẫn xuất của diosmin

a)

Tổng hợp diosmetin (ký hiệu DT)

Cấu tạo

Công thức phân tử: C16H12O6

Khối lượng phân tử: 300.26 gmol

Công thức cấu tạo

Cấu trúc hóa học của DTTính chất vật lý

Diosmetin dạng bột, màu vàng nhạt, tan nhiều trong acetone, methanol

Tnc=258260C

Phản ứng tổng hợp

Diosmetin được tổng hợp bằng phản ứng thủy phân diosmin trong dung

dịch acid sulfuric – acid acetic – nước (2-65-38 theo tỉ lệ % thể tích), ở nhiệt độ

OH HO

Khối lượng phân tử: 426,37 gmol

Công thức cấu tạo

O O

Cấu trúc hóa học của DTATính chất vật lý

3,5,7triacetoxy4methoxyflavone dạng tinh thể hình kim, màu trắng, tan

nhiều trong acetone, Tnc=189191C

Phản ứng tổng hợp

DTA được tổng hợp bằng phản ứng ester hoá nhóm hydroxyl của diosmetin bằngtác nhân acetic anhydride trong môi trường kiềm, ở nhiệt độ 82C (phản ứng thế áinhân trên C của nhóm cacbonyl)

Khối lượng phân tử: 342.34 gmol

Công thức cấu tạo:

Cấu trúc hoá học của DTMTính chất vật lý

3,4,5,7tetramethoxyflavone dạng tinh thể hình kim, màu vàng ánh xanh,tan nhiều trong acetone, Tnc= 192193C

Phản ứng tổng hợp

Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp tổng hợp Williamson.Diosmetin được tiến hành ether hoá trong môi trường K2CO3, acetone với tác nhândimethyl sulfoxide

K 2 CO 3 Acetone,t 0 + (CH 3 O) 2 SO 2

+ 2H 2 SO 4 2

Khối lượng phân tử: 420.45 gmol

Công thức cấu tạo

Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp tổng hợp Williamson

Diosmetin được tiến hành ether hoá trong môi trường K2CO3, acetone vớitác nhân allyl bromide

K 2 CO 3 Acetone, t 0

Trong cơ thể chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ những chất hóa học từnhững phản ứng oxy hóa có hại bằng cách phản ứng với các gốc tự do hay những dạngoxy hoạt động khác, vì vậy ngăn cản tiến trình oxy hóa Tuy nhiên sự cung cấp cácchất chống oxy hóa có giới hạn vì một phân tử chất chống oxy hóa chỉ có thể phản ứngvới một gốc tự do Vì thế cần có nguồn bổ sung chất chống oxy hóa thường xuyên, cóthể từ nguồn nội sinh hay ngoại sinh

Nói chung các chất chống oxy hóa phải:

- Có hiệu thế khử càng thấp càng tốt so với dược chất cần được bảo vệ

- Có cấu trúc đã được xác định và có độ tinh khiết cao

- Hóa hợp với oxy dễ dàng hơn so với thuốc cần được bảo vệ

- Dễ trùng hợp hoặc phản ứng với các gốc tự do do phản ứng oxy hóa sinh ra

Chất chống oxy hóa có khả năng làm chậm tốc độ oxy hóa của những chất tự oxy hóa.

1.4.2 Hệ thống chống oxy hóa 24, 26, 50(67,68,69)

Trong cơ thể có nhiều hệ thống chống oxy hóa nội sinh để chống lại sự sản xuấtcủa các gốc tự do Những hệ thống này có thể chia thành 2 nhóm là enzyme và khôngenzyme Những chất chống oxy hóa enzyme bao gồm: superoxid dismutase xúc tácquá trình chuyển O2 thành H2O2 và H2O; catalase chuyển H2O2 thành H2O và O2;glutathion peroxidase chuyển H2O2 thành H2O Những chất chống oxy hóa khôngenzyme bao gồm: các vitamin tan trong lipid như vitamin E và vitamin A hay tiềnvitamin A (betacaroten), vitamin C tan trong nước và GSH Vitamin E được xem nhưchất chống oxy hóa ngắt mạch chính yếu trong cơ thể

Hệ thống chống oxy hóa enzyme và không enzyme có quan hệ và tương tác mậtthiết với nhau Cả vitamin C và GSH đều liên quan với sự tái tạo của gốc tự doalphatocopherol Hơn nữa sự xuất hiện của các dấu vết kim loại như selen, mangan,đồng, kẽm… cũng đóng vai trò như các yếu tố đồng vận chống oxy hóa Selen là yếu

tố đồng vận của enzyme glutathion peroxidase, và mangan, đồng, kẽm là yếu tố đồngvận của superoxid dismutase… Sự tương tác đa dạng của các hệ thống chống oxy hóakhác nhau là nền tảng cho phương pháp trị liệu dựa trên sự kết hợp của những chấtchống oxy hóa khác nhau, hơn là chỉ sử dụng một chất chống oxy hóa

1.4.3 Các kiểu tác động của các chất chống oxy hóa 24,26,50(67,68,69)

Các chất ngắt mạch, như alphatocopherol tác động trong pha lipid để bắt giữgốc tự do

Làm giảm các loại oxy hoạt động: như glutathion

Thu dọn các gốc tự do khơi mào: như superoxid dismutase tác động trong phanước để bắt giữ các gốc tự do superoxid

Các tác nhân chelat hóa tạo phức với ion kim loại (như Fe3+

, Cu2+, Ni2+, Mn2+),các ion này thường khơi mào cho phản ứng oxy hóa

1.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hoá 48,49,50,51

Trong thực nghiệm, hoạt tính kháng oxy hóa được đo bằng khả năng bắt gốc tự

do của phản ứng giữa phân tử chất kháng oxy hóa với các gốc tự do hoạt động Dựavào cơ chế của phản ứng oxy hóa người ta đã đưa ra nhiều phương pháp đo khác nhau

+ Đối với phản ứng theo cơ chế chuyển proton (Hydrogen Atom Tranfer),người ta thường sử dụng các phương pháp sau:

- ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity): phương pháp dựa vào khả nănghấp thụ các gốc tự do của oxygen

- TRAP (TotalTrapping Antioxidant Parameter): phương pháp đo hoạt tínhkháng oxy hóa tổng cộng

- LDL oxidation (Low Density Lipoprotein oxidation): phương pháp dựa vào sựoxy hóa của lipoprotein tỷ trọng thấp

- TOSC (Total Oxidant Scavenging Capacity): phương pháp đo khả năng làmsạch sự oxy hóa tổng cộng

+ Các phương pháp đối với cơ chế chuyển electron (Single Electron Tranfer):

- FRAC (Ferric Reducing Antioxidant Power): phương pháp khử sắt

- TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity): phương pháp đo hoạt tínhkháng oxy hóa đương lượng Trolox

- DPPH (2,2-diphenyl1picrylhydrazyl): phương pháp đo khả năng bắt gốc tự doDPPH Gốc tự do DPPH (1,1diphenyl2picrylhydrazyl) là gốc tự do bền do cóhiệu ứng liên hợp trong toàn phân tử, cho màu tím trong ethanol và có độ hấpthu cực đại tại 517 nm

Đồ thị 1 biểu diễn màu của phương pháp DPPH

Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng và áp dụng cho từng loại chất oxyhóa Thông thường, người ta thường dựa vào các điều kiện như: khả năng phòng thínghiệm, tính khả thi trong các hệ thống sinh học, mức độ đơn giản của phương pháp,

cơ chế phản ứng, loại chất kháng oxy hóa, thời gian, … để chọn phương pháp nghiêncứu hoạt tính phù hợp

a)

Tìm hiểu về DPPH52,53,54,55

DPPH: 1,1diphenyl2picrylhydrazyl (,diphenylpicrylhydrazyl) là gốc

tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác

Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển vềdạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl) Phản ứng được thực hiện như sau:

1,1diphenyl2picrylhydrazyl 1,1diphenyl2picrylhydrazine

o)

Dung môi và pH của phản ứng52,53,54,55

Trong nghiên cứu ban đầu của Blois, ông dùng hệ dung dịch đệm acetate ở pH5,06,5 trong dung môi nước Tuy nhiên, qua kết quả của nhiều nghiên cứu gần đây,các nhà khoa học nhận thấy rằng methanol và ethanol là 2 dung môi tốt nhất và khôngcần điều chỉnh pH trong dung môi methanol hay ethanol đang dùng

p)

Đo độ hấp thu52,53,54,55

Giá trị các bước sóng hấp thu cực đại khi tiến hành đo mẫu theo mỗi tác giả có

sự khác nhau, nhưng trên thực tế kiểm nghiệm thì đỉnh hấp thu cực đại nằm ở bướcsóng khoảng 515520 nm

Thời gian phản ứng52,53,54,55

Thời gian phản ứng phụ thuộc vào hàm lượng tác chất đem phản ứng Theo kếtquả khảo sát trên nhiều tác chất khác nhau, thời gian tốt nhất là 30 phút sau khi phảnứng đã thực hiện xong

r)

Kết quả tính toán52,53,54,55

Để khảo sát khả năng kháng oxy hóa, người ta thường dùng thuật ngữ: Phầntrăm ức chế Q Q được định nghĩa như sau:

Q=((A0Ac)/A0)100

Trong đó: A0 là độ hấp thu DPPH khi không có mẫu (mẫu trắng)

Ac là độ hấp thu của dung dịch phản ứng

Ngoài ra kết quả thử kháng oxy hoá theo phương pháp DPPH được quy về giá trị IC5050%, EC5050% hoặc SC5050 Thông số này được định nghĩa là nồng độ tác chấtphản ứng làm giảm 50% hàm lượng DPPH Vậy ứng với một giá trị nồng độ DPPHxác định, giá trị IC50, EC50 hoặcSC50 càng nhỏ thì khả năng kháng oxy hoá càng cao

1.4.5 Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp SRB

(Thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử – Bộ môn Di truyền,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP.HCM)

Hình 1 a) Tế bào ung thư vú; b) Tế bào ung thư phổi; c) Tế bào ung thư gan

Nguyên tắc

Sử dụng phương pháp Sulforhodamin B (SRB) là một

phương pháp nhuộm màu đơn giản và nhạy để xác định độc

tính tế bào của một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện

âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương

của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng

protein tổng của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRBliên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độquang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào

Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu đối chứng phản ánh độc tính tế bào của chất thử.s)

Với: - ODtb: giá trị OD của giếng có chứa tế bào

- ODtrắng: giá trị OD của giếng trắng

- ODTN: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)

- ODC: giá trị OD của mẫu chứng (control) tính từ công thức (1) và (2)

Ghi chú: Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Sử dụng hàm STDEV trong phần

mềm tính toán Excel của Microsoft Office để xử lý số liệu, tính toán giá trị trung bình

và độ lệch chuẩn giữa các lần thí nghiệm lặp lại

Kết quả trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

O

S S

N N

O O O

Sulforhodamin B

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

2.1.1 Dụng cụ

- Bình cầu thủy tinh đáy tròn một cổ 100 mL, 250 mL, 500 mL

- Bình cầu cổ nhám 2 cổ đáy tròn 100 mL, 250 mL

- Ống nhỏ giọt, pipep 1 mL, 5 mL, 10 mL, ống đong 100 mL

- Đũa thủy tinh, erlen thủy tinh 250 mL, becher thủy tinh các loại, cá từ

2.1.2 Thiết bị

- Máy khuấy từ có hiệu chỉnh

- Tủ sấy chân không OV01

- Thiết bị đun hoàn lưu

- Máy cô quay Buchi Rotavapor R200, Heating Bath B490 (Đức)

2.1.3 Hóa chất

a)

Các dung môi, hóa chất xuất xứ Trung Quốc

Pyridine, sodium hydroxide, sodium thiosulfate, sulfuric acid, dimethyl

formamide, acetic acid, acetone, sodium acetate, potassium carbonate

t)

Các dung môi, hóa chất xuất xứ Việt Nam

Methanol, cồn 70, chloroform

u)

Các dung môi, hóa chất xuất xứ Châu Âu

Acetic anhydride Tây Ban Nha, dimethyl sulfat Đức, allyl bromide Bỉ.Riêng hesperidin được chiết từ vỏ quýt, được làm sạch và xác định cấu trúc tại phòng Hoá Hữu Cơ  Polymer  Viện Công nghệ Hóa học  Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng thin layer chromatographyTCL

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bảng mỏng tráng sẵn 25 DCAlufolien 60

F254(Merck) Phát hiện chất thử bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm,hoặc có thể hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10 trong ethanol

2.3.2 Phổ hấp thu tử ngoại (UV

Đo trên máy UV/Vis Spectrometer V530 (Shimadzu) tại Viện Công nghệ Hoáhọc, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.4 Phổ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phổ HPLC được ghi trên hệ thống máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLCAgilent technologies 1200 series DAD detector, cột Zorbac SBC18 1504,6 mm,kích thước hạt pha tĩnh 5 m made in USA

2.3.5 Phổ sắc ký khối phổ với độ phân giải cao (HPLCHRMS

Phổ HRMS được ghi trên hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép vớimáy khối phổ với độ phân giải cao: HPLC Agilent 1200, HRMS microOTOFQ,

để yên rồi lọc lấy cặn rắn Sau đó, cho alcohol vào cặn rắn, đun hoàn lưu và lọc ở nhiệt

2.5 Tổng hợp dẫn xuất của diosmin

OH HO

O

HO

O

OH HO HO

Sơ đồ 1 Quy trình tổng hợp DT

2.5.2 Tổng hợp dẫn xuất 3,5,7triacetoxy4methoxyflavone (ký hiệu DTA)

Cho 0.5 g diosmetin, 0.1526 g CH3COONa (tỉ lệ mol 1:1) vào bình cầu 2 cổ.Nạp thêm 10 mL anhydride acetic vào bình, gắn hệ thống đun hồi lưu kết hợp khuấycho hỗn hợp đồng nhất Dùng sắc ký bản mỏng để theo dõi phản ứng Sau khi phảnứng kết thúc, rót hỗn hợp vào cốc nước đá nhuyễn, khuấy đều Hỗn hợp được để yêncho chất rắn lắng xuống Lọc, rửa chất rắn màu trắng nhiều lần với nước, đến pH 6-7.Sản phẩm được kết tinh trong acetone và methanol Hiệu suất phản ứng 83%