- Bình cầu cổ nhám 2 cổ đáy tròn 100 mL, 250 mL.
2.7 Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào
Tiến hành thử nghiệm khả năng gây độc tế bào của DT, DTA, DTM, DTAl trên các dòng tế bào MCF-7 (ung thư vú), NCI-H460 (ung thư phổi) và Hep G2 (ung thư gan). Thử nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử – Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP.HCM
2.7.1 Thiết kế khảo sát
- 1 mẫu chứng dương: tế bào với camptothecin. Giải đông nguồn tế bào ung thư bảo quản trong nitơ lỏng và nuôi cấy tế bào đến thế hệ thứ 4 (P4).
- Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70 - 80%.
- Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào/giếng ban đầu là 104 tế bào/giếng.
- Ủ ở 37oC, 5% CO2, 24 giờ.
- Bổ sung môi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muốn thử (chú ý: không loại bỏ môi trường cũ đã có ở trong giếng).
- Cố định tế bào trong giếng với acid trichloracetic (TCA) :
Đối với những dòng tế bào bám dính: sử dụng dung dịch TCA 50% lạnh vào mỗi giếng (cho vào từ từ không quá nhanh).
Đối với những dòng tế bào lơ lửng: sử dụng dung dịch TCA 80% lạnh vào mỗi giếng. Đặt đĩa trên vào trong tủ lạnh (4oC), 1-3 giờ, sau đó loại bỏ chất lỏng trong mỗi giếng, rửa nhẹ nhàng với nước (200 µl/giếng) 5 lần và để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ.
- Nhuộm SRB:
Cho dung dịch SRB 0,2% vào mỗi giếng. Ủ ở nhiệt độ phòng, 5-20 phút.
Loại bỏ dung dịch SRB.
Rửa nhẹ nhàng bằng dung dịch axit axetic 1% (5 lần) Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 12-24 giờ.
- Đọc kết quả:
Cho 200 µl Tris-base 10mM vào mỗi giếng.
- ở nồng độ 0,01(µg/ml).
- 1 mẫu chứng âm : tế bào với dung môi hòa tan chất thử (DMSO 0,25%)
- Các mẫu cần thử nghiệm hoạt tính gây độc ở nồng độ khảo sát.
- Thiết kế thử nghiệm của 1 mẫu, gồm:
3 giếng tế bào + môi trường nuôi cấy có chứa chất thử ở nồng độ khảo sát. 1 giếng không có tế bào + môi trường nuôi cấy có chứa chất thử ở nồng độ khảo sát (1 giếng trắng).
2.7.2 Kết quả
Kết quả được tính theo công thức như đã nêu ở chương Tổng quan.
Giá trị IC50 được xác định như sau: Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ cho tỉ lệ gây độc tế bào 50%.