Thử nghiệm phương pháp xác định giai đoạn tác động của các hoạt chất thực vật lên chu trình phân bào của tế bào ung thư trong điều kiện In VitroThử nghiệm phương pháp xác định giai đoạn tác động của các hoạt chất thực vật lên chu trình phân bào của tế bào ung thư trong điều kiện In VitroThử nghiệm phương pháp xác định giai đoạn tác động của các hoạt chất thực vật lên chu trình phân bào của tế bào ung thư trong điều kiện In VitroThử nghiệm phương pháp xác định giai đoạn tác động của các hoạt chất thực vật lên chu trình phân bào của tế bào ung thư trong điều kiện In Vitro
Trang 1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG 2003-2004
BÁO CÁO NGHIỆM THU
Tên để tài:
THỬ NGHIỆM PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GIAI
DOAN TÁC ĐỘNG CUA CAC HOAT CHAT THỰC VAT LEN CHU TRINH PHAN BAO CUA TE BAO
UNG THU TRONG DIEU KIEN IN VITRO
Cán bộ thực hiện:
'Th§ Nguyễn Đăng Quân (Chủ nhiệm đề tài)
PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương (Cố vấn chuyên môn)
Thành phố Hồ Chí Minh
Trang 2MỤC LỤC
Trang Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 22.22222222 n2 sốc |
Phần 2: TONG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1 Cơ sở phân tử của sự phân bào ở tế bào động vật 2
2.1.1 Giới thiệu chung Q.02 va 2
2.1.2 Từ Gọ chuyển sa ng Ổi cece eee xa 2
2.1.3 Từ G¡ chuyển sang § 2c cv 4
2.1.4 Từ giai đoạn G; chuyỂn sang M2 ee ee eee 4
2.1.5 Những tín hiệu đưa tế bào vào quá trình sau metaphase
của nguyên phân và làm tế bào trổ về giai đoạn Ớạ 4
2.2 Cơ chế phát sinh ung thư o 2 5
“n9 An san Œaa 6
2.2.2 Các gene ức chế khối u (tumor suppressor genes) 7 2.3 Đại cương về thuốc chữa ung thử 8
2.3.1 Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thư 8
2.3.2 Su khang thuée cla t€ bao ung tht eee 9
2.3.3 Độc tính của các thuốc chữa ung thư 9
Phần 3: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 10
3.1 Vat eu 10
"nh eee 10
3.1.2 Gossypol once cece eens 11
3.1.3 PlumbagIn eee eens 12
3.1.4, Cac dong t€ bao ung tht ce eee 13
3.2 Phuong phap 2 eee eee 14
3.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào động vẬI 14
3.2.2 Phương pháp đếm tế bào với trypan bÌu€ co 14
3.2.3 Phương pháp MTT ¬ 14
3.2.4 Phương pháp clOnOB€nIC eee 15
3.2.5 Phương pháp xác định giai đoạn tác động của hoạt chất
lên chu trình tế bào ung thứ 9 VÓ c2 nu xa 15
3.2.6, Phuong phap xt ly th6ng ké eee 16
Phan 4: KET QUA - THAOLUAN 00 7
4.1 Tác động của vinblastin lên hai dòng tế bào ung thư RD và HEp-2 I7 4.2 Giai đoạn tác động của hoạt chất lên chu trình phân bào
của tế bào ung thư RD_ co 23 4.2.1, Chu trình tế bào bình thường của tế bào RD 23
Trang 4Phan 1: DAT VAN DE
Ủng thư là một trong những bệnh phổ biến và có tỷ lệ gây tử vong cao trên thế giới cũng như ở Việt Nam Đây là dạng bệnh lý có liên quan đến hiện tượng
rối loạn trong quá trình điều hòa sự phân chia tế bào ở các mô trong cơ thể Khối
u hình thành do những tế bào ung thư phân chia liên tục khơng được kiểm sốt,
ban đầu khối u định vị tại một mô nhưng sau đó tế bào ung thư có thể di căn khắp
cơ thể, làm cơ thể suy kiệt và dẫn đến tử vong Ung thư hiện vẫn là vấn để nan
giải của Y học, người ta vẫn chưa tìm ra hoạt chất hay phương pháp nào điều trị hữu hiệu tất cả các dạng ung thư
Nghiên cứu về bệnh ung thư và cách chữa trị ung thư là lĩnh vực rất được
quan tâm trên thế giới Đã có nhiều tổ chức, viện nghiên cứu ung thư được thành
lập ở nhiều quốc gia trên thế giới như: Tổ chức nghiên cứu ung thư Hoa Kỳ
(American Associatlon Cancer Research), Hội ung thư Úc (Australian Cancer Society), Tổ chức nghiên cứu ung thư Anh (Brmish Assoclaton for Cancer Research), Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Canada (National Cancer Institute
of Canada), Tổ chức nghiên cứu ung thư Châu Au (European Association for Cancer Research) Nhiều nghiên cứu về bệnh ung thư và cách chữa trị ung thư được thực hiện trên thế giới và đã cung cấp nhiều hiểu biết về cơ chế phân tử
của sự phân bào, cơ chế phân tử của bệnh ung thư, các phương thức hữu hiệu để
tiêu diệt hay ngăn cần sự phát triển của tế bào ung thư và gần đây nhất là giải
Nobel Sinh lý và Y học năm 2001 đã được trao cho những phát hiện liên quan đến các protein tham gia vào quá trình phân bào và ung thư
Việt Nam là một nước nhiệt đới với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú,
trong đó có thể sẽ có nhiều cây thuốc chứa hoạt chất kháng ung thư mạnh có thể
ứng dụng vào điều trị Tuy nhiên, những nghiên cứu về hoạt chất kháng ung thư ở
nước ta chưa nhiều, đặc biệt là việc xác định hoạt tính kháng ung thư cho đến nay
vấn dựa trên những phương pháp cổ điển
Để tiếp tục xây dựng mô hình xác định hoạt tính kháng phân bào của hoạt
chất thực vật và tiếp cận với việc nghiên cứu cơ chế tác động của chúng lên tế
bào ung thư, chúng tôi tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:
- Khảo sát tác động của vinblastin, một loại thuốc trị ung thư có nguồn gốc
thực vật, lên tế bào RD (Rhabdomyosarcoma) và HEp-2 (Epidermoid carcinoma) - Khẳng định giai đoạn tác động của vinblastin lên chu trình phân bào của tế
bào RD bằng phương pháp khảo sát sự tương quan giữa số lượng tế bào và hàm
lượng DNA theo thời gian
Trang 5Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
` 2 a
2.1 CƠ SỞ PHAN TU CUA SU PHAN BAO O 2.1.1 Giới thiệu chung
Từ một hợp tử ban đầu, quá trình nguyên phân xấy ra liên tục để tạo thành bhôi rồi cơ thể Trong cơ thể trưển ø thành, quá trình phân bào vấn tiếp tục điễn ra
lể tái tạo lại các tổ chức mô v à thay thế tế bào chết Các lần phân bào này được “A IAT = tø oy oO eH <> „2 & - A Oo
kiểm soát nghiềm ngặt,
Một chu trình tế bào động vật dài 20-24 giờ và được chia thành những giai đoạn sau : Ớa, Gy, S, Go, M
- Ốạ: Giai đoạn tế bào chỉ thực hiện chức năng sống bình thường
- Ốy: Giải đoạn tế bào chuẩn bị cơ sở vật chất cho sự nhdn d6i DNA, dai 10- 12 giờ chiếm 50% tổng thời gian chu trình
-$ : Nhân đôi DNA, kéo dài 6-8 giờ chiếm khoảng 30% tổng thời gian
- G¿: Giai đoạn tế bào chuẩn bị cơ sở vật chất cho sự phần bào, đài 3-4 giờ
chiếm khoảng 15% thời gian chu trình
- M: Quá trình bào phân (mitosis), giai đoạn này chỉ mất 30 phút đến I giờ
chiếm 5% tổng thới gian [26]
2.1.2 TY Gp chuyén sang G,
Go là giai đoạn tế bào không gia tăng về số lượng mà chỉ biểu hiện những gene cần cho chức năng bình thườn ns của chúng, Để bắt đầu giai đoạn phát triển đầu trên (G,) của chu trình tế bào, tế bào cần nhận tín hiệu từ mơi trường bên
ngồi thường thông qua một vai yến tố tăng trưởng (srowth factor) như:
- PDGF (Platelet-derived Growth Factor) : yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc
- EGE (Fibroblast Growth Factor): yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi - NGE (Nerve Growth Factor): yếu tế tăng trưởng thần kinh
- TGF-B (Transforming Orowth Factor-B): yếu tố tăng trưởng chuyển dang- 4 2 ứng có thể hoạt hóa om tj - t uh Oo By Xe
Yếu tế tăng trưởng gắn vào thụ thể (receptor) tương
hoạt tinh tyrosine kinase của thụ thể, làm thụ thể tự phosphoryl hóa và phosphoryl hoa kinase khác tạo nên chất truyền tin thứ hai Những chất truyề Sn tin
thu hal thudng hoat hoa caéc serine - threonine kinase Nhtfng serine - threonine
Kinase nay phosphory! héa nhifng yéu t6 hoạt hóa bay ức chế phiên ma, hoạt hóa
hay ức chế nó Điều này en đến sự biểu hiện của một số gene, cụ thể là những
gene cuia cyclin G,, CDPKs (Cell Division Control Kinases), RNA polymerase,
DNA helicase va DNA solymerase dude biểu hiện ở G, Sự tích lãy những
protein này trong suốt giai đoạn G, cần thiết cho sự nhân đôi DNA ở giai đoạn S
Sự bất hoạt những yếu tế ức chế phiên mã cũng rất quan trọng trong giai
oạn G¡ Một yếu tế ức chế phiên mã quan trọng là retinoblastoma protein (Rb;
£
Trang 6khỏi E2f và DrfL làm cho những yếu tố này tách khỏi vùng bắt đầu phiên mã dẫn đến sự phiên mã những gene đặc trưng cho giai đoạn G¡: gene c-ƒos (mã hóa cho yếu tố hoạt hóa phiên mã Fos), sene e-myc ( là yếu tố hoạt hóa phiên mã với
hoạt tính helicase cần cho sự nhân đôi DNA), gene mã hóa TGF-B và gene mã
héa cho dihydrofolate reductase (Dhfr) cow ay cr FR Ỳ ì Y se ——? tac Ser 1 Ber os CD «TOD ea ‘
Ỉ r i Outer' nuclear membrane! i ] £ i Inner: nuclear membraaci + ] , : # i + Rye RKA Tv Thr Rh —t kat See, Creu NEB T 155 ora K ¥ Ý ‡$ ở Fos Fos Cyetins mì Jun dua Mye Myo a Pena’ Cdk-Cyelia Hình 1: Quá trình chuyển từ G„ sang G, Chú thích hình 1: - GE: yếu tố tăng trưởng (srowth factor) -R: thụ thể (receptor)
- MAPKKK : protein kinase hoat héa phan bao (mitogen activated — protein
kanase kinase kinase)
- MAPKK : protein kinase hoạt hóa phân bao (mitogen activated — protein kinase
kinase)
- MAPK : protein kinase hoat hóa phân bao (mitogen activated — protein kinase) - Cdk : kinase phu thudc cyclin (cyclin-dependent kinase) - Ade: Adenyleyclase - PKA, PKC: phospho kinase A phospho kinase C - PLC: phospholipase C - PIP2: phospho inositol biphosphate - DG : diacylglycerol
- IP3: inositol triphosphate
———* :; hoạt hóa bằng tương tác vật lý
Trang 7—— : hoạt hóa bằng phosphoryl hóa >_ cdi chuyển
——— : bất hoạt
“li : tổng hợp protein
2.1.3 Từ Gị chuyển sang S
Két qua cta giai doan G, JA tao nén cyclin va Cdk (Cyclin-dependent
kinase), hai yếu tố này kết hợp lai tao thanh CDCK-1 (Cell Division Control
Kanase) Phite hop cyclin-Cdk G, dudc hoat héa bdi sw phosphoryl héa va
đephosphoryl hóa của Cdk tại những vị trí threonine va tyrosine Cyclin-Cdk G, khởi sự việc chuyển từ Ơi sang S bằng cách phosphoryl hóa protein H1 (histone-
1) và Rb, HI bị phosphoryl hóa dẫn đến sự tháo xoắn của nhiễm sắc thể để tạo
điều kiện cho sự nhân đôi DNA Sự phosphoryl hóa protein Rb là nguyên nhân
dẫn đến sự giải phóng những yếu tế phiên mã (ví dụ :E2Ð cần cho việc gắn RNA
polymerase vào vàng bắt đầu phiên mã RNA polymerase gắn vào vùng bắt đầu
phiên mã và tổng hợp RNA mỗi ở những vị trí bất đầu sao chép DNA dẫn đến sự
nhân đôi DNA
Sau khi sự nhân đôi DNA hoàn tất, CDCK-I hoạt hóa những phosphatase thực hiện sự dephosphoryl hóa HI và Rb dẫn đến việc đóng các vị trí ori và làm
E2f gắn lên vị trí bắt đầu phiên mã (promoter) của các gene mà nó kiểm soát
CDCK-I còn hoạt hóa hệ thống nbiquitin gây nên sự thủy phần chính nó Những sự kiện trên làm DA không thể nhân lên nhiều hơn một lần trong mỗi chủ trình
tế bảo
3.1.4 Từ giai đoạn Œ chuyển sang M
Ở giai đoạn G¿ tế bào tổng hợp cyclin G¿ và Cdk, hai yến tố này kết hợp lại
tạo thành CDCK-2
CDCK-2 phosphoryl hóa một protein nầng đỡ nhiễm sắc thể (có thể là một
topoimerase) lam cho nhiễm sắc thể đóng xoắn,
CDCK-2 cũng liên quan đến việc phosphoryl héda lamine A, B va C làm
nhiềm sắc thể tách ra khỏi màng nhân và khởi đầu cho việc màng nhân bị tan ra
CDCK-2 phosphoryl bóa caldesmon, caldesmon hoạt động bắt lấy các ion
Ca” làm giảm nồng độ Ca” trong tế bào tạo nên sự polymer hóa của tnbulin từ
trung tâm tổ chức vi ống (MÓC : Microtubule organizing centers) hay trung thể
“bio Déng thoi CDCK-2 efing phosphoryl héa protein Tau thúc đấy
sự tổng hợp vi ống Thoi vô sắc phát triển kéo nhiễro sắc thể kép tập trung về
Ở mỗi cực
mặt phẳng xích đạo ở kỳ giữa của nguyên phần,
2.1.5 Những tín hiệu đưa tế bào vào quá trình sau kỳ giữa của nguyên phân »à làm tế bào trở về giai đoạn Go
Khi tế bào ở kỳ giữa của nguyên phân, CDCK-2 hoạt bóa các phosphatase có nhiệm vụ dephosphoryl hóa caldesmon va Tau tao nén sự khử tràng hợp vi
ống Đồng thời chúng cũng đephosphoryl hóa protein, giữ các nhiễm sắc thể với
Trang 8nhâu ở tâm động lâm nhiễm sắc thể tách ra và kéo các nhiễm sắc thể chị em về
hai cực đôi diện
CDCK-2 còn hoạt hóa các phosphatase để dephosphory]l hóa lamine A,B,€ dẫn đến hình thành màng nhân mới ở mỗi cực tế bào, tạo thành hai nhân mới và
sau đó là hai tế bào mới
Những yếu tố làm tế bào đi vào giai đoạn Qạ là: (1) sự ức chế tiếp xúc xây ra khi thụ thể của các tế bào lân cận gắn với nhau làm kìm hấm kinase mang qua
đó bất hoạt con đường truyền tín hiệu, (2) thiếu các yếu tố tăng trưởng, (3) tích
lấy các protein ức chế phân bào như P53, Rb [21]
2.2 CƠ CHẾ PHÁT SINH UNG THỨ
Trong 30 năm qua, ung thư ngày càng được hiểu rõ là một bệnh liên quan đến nhiều đột biến xây ra ở DNA của một tế bào sinh dưỡng, là nguyên nhân làm tế bào khơng kiểm sốt được sự phát triển
Ở cơ thể trưởng thành, vài loại tế bào rất hiếm khi phân chia thậm chí không
bao giờ phân chia (ví dụ tế bào thần kinh), trong khi những tế bào khác, như đa
và tế bào tao máu, phân chia trong suốt đời sống của cơ thể để tạo các tế bào
mới thay thế cho hàng tỷ tế bào chết mỗi ngày Rõ ràng có một chương trình kiểm soát rất cẩn thận sự phát triển của mỗi lọai tế bào trong cơ thể, vì một vài sự nhân lên dư thừa hay không đủ sẽ dẫn đến sự rối loạn Các khối u phát triển khi một tế bào mat di su nhay cảm với các yếu tố kiểm soát chúng [23]
Như đã để cập ở phần trên, sự phân chia của tế bào được kiểm soát bởi rất
nhiều protein trong con đường truyền tín hiệu Những protein chức năng trong con đường truyền tín hiệu thường tổn tại ở một trong hai trạng thái: hoạt động và bất
hoạt Hoạt tính của chúng thường được xác định bởi mức độ phosphory] hóa và sự
hiện diện những protein có liên quan
Những gene của các protein truyển tín hiệu đôi khi bị biến đồ 3¡ bởi đột biến Vài đột biến làm cho các protein truyền tín hiệu không có chức năng, ngược lại
có những đột biến xảy ra ở vùng điều hòa của protein làm cho những protein
truyền tín hiệu ở trạng thái hoạt đồng liên tục Những tế bào tạo ra những protein
truyền tín hiện không có chức năng thường bị chết Những tế bào tạo ra những protein truyền tín hiệu luôn luôn hoạt động một cách không bình thường, sẽ mở những gene mà lý ra phải đóng, dẫn đến sự phân chia vô tổ chức của tế bào Những øene mã hóa cho các protein truyển ứn hiệu đột biến được gọi là oncogene, ở dạng hoạt động bình thường trong tế bào chúng được gọi là proto- oncogene
Những đột biến ở các protein điều hòa âm con đường truyền tín hiệu (tumor-
Suppressor protein: protein ức chế khối u) như p53, Rb có thể cũng dẫn đến sự
thay đối dạng tế bào và sự phát triển của ung thư vì con đường truyền tin hoạt
Trang 9Tóm lại, Khi một tế bào bị đột biến ở một proto-oncogene hay gene ức chế
Khôi u (tumor-s suppressor gene) lam kích hoạt sự gia tăng số lượng của tế bào,
sene ức chế khối u khác xây ra những đột biến thứ cấp ở các proto-oncosgene và g
làm tế bào mất khả năng kiểm soát số lượng đột biến Những đột biến thứ cấp này làm tăng khả năng sống và phân chia của nhiều dạng khác nhau của các tế
bào khơng cịn được kiểm sốt [21]
2.2.1 Ôncogene
Nguyên nhân gây ra ung thư là do sự xuất hiện những đột biến điểm, sự tái lổ chức các gene, sự gia tăng nhiều bẩn sao và sự gia tăng, phiên mã Thêm vào đó, sự chèn những vùng hoạt hóa của retrovirus (LTRs) kế những oncogene hay đột biến ở trình tự mã hóa của oncogene làm thay đổi
dẫn đến ung thư Một số cơ chế chỉ được xác định trong diéu kién in vivo hay trén
động vật thí nghiệm, nhưng tất cả đều có khả năng xảy ra trong hoạt động của chức năng của chúng cũng oncogene gdy ung thư ở người Bởi vì các proto-oncogene hiện điện ở tất cả tế bào động vật và chúng có thể được hoạt hóa bởi các yếu tố bên trong (như thiếu
sót trong cơ chế sửa chữa các sai hồng trong tế bào) hay các yếu tổ bền ngoài
(như tia cực tím, các chất gây ung thư) để khởi động quá trình ung thư
Các oncogene và thành phần tương ứng với nó trong tế bào bình thường, các proto-oncogene, có thể được phân loại theo chức năng của chúng thành nhiều nhóm khác nhau
Nhóm thứ nhất là một số gene mã hóa cho các yếu tế tăng trưởng (growth
factor), nhw sis (chudi B cua PDGED int-2 va hst (yếu tố giống FGF) Những
oncogene loại này có thể kích hoạt sự nhân lên của tế bào khối n nhưng chúng
không đủ khả năng gây nên thay đổi về kiểu hình
Nhóm thứ hai của oncogene mã hóa cho thụ thể của các yếu tố tăng trưởng,
nhiều thụ thể trong số đó có hoạt tính tyrosine kinase Nh ón m này bao gồm gia dinh oncogene src, erb B (thu thé cia EGF), va’ fins (thu thé cha CSF-1) Ngoai ra
còn có một số thành phần giống thụ thể, những protein màng c 26 hoat tinh tyrosine kinase vGico chat chua biét (trk, met, va ros)
Nhóm thứ ba là các thụ thể không có hoat tinh tyrosine kinase, dé 1A san
phẩm gene mas (thụ thể angiotensin) vA thụ thể tác động kiểu adrenalin
(adrenergic) Clip
Nhóm thứ tư là các protein gắn trên màng, các protein gắn với guanine nhu
họ protein Ras Những protei in nay gắn với GTP, đồng thời có hoạt tính GTPases
và noat động như chất truyền tin của thụ thể của các yếu tố tăng trưởng trên bề
mặt tế bào Những oncogene ras bị đột biến khiến chúng luôn ở trạng thái hoạt động bằng cách duy trì trạng thái gan GTP
Nhóm thứ năm là những oncogene mã hóa cho các oncoprotein trong tế bào chất với hoạt tính serine/threonine kinase Nhóm này gồm các gene raf, pim-] mos và cot Thành viên đầu tiên của nhóm này là protein c-Raf được hoạt hóa bởi
Trang 10Irting gian trong con đường truyền tín hiệu giữa Ras và nhân tế bào bằng cách
hoạt hóa các protein kinase hoạt hóa phân bao (mitogene activated protein
kinase: MAP) Dang ung thư hóa của Raf bị mất trình tự amino acid điều hòa tận
cùng, trở nên luôn hoạt động
Nhóm thứ sấu gồm các oncogene ma héa cho các yếu tế điều hòa trong tế
bào chất, ví dụ gene crÃ
Nhóm thứ bảy, một nhóm oncogene lớn mã hóa cho những yếu tế phiên mã ở nhân như myc, myb, fos, jun, erbA và relL Một số trong chúng bị biến đổi tạo
niên các oncoprotein đột biến mất thành phần điều hòa âm (nhu jun, fos va myb),
và ở những trường hợp khác (như erbA và reD những dạng đệt biến hoạt động bởi vì những vùng hoạt tính của chúng bị mất, tạo ra các protein đột biến ngăn cần hoạt động của các sản phẩm gene bình thường ~ được gọi là đột biến âm trội
r201
2.2.2 Che gene the ché khéi u (tumor suppressor genes)
ty ca : “8 A ae % ti VÀ ĐA 2 2 af Ped
Năm 1696, Harms và cộng sự cho thấy răng khi tế bào ác tính kết hợp với tế
bào thường, hầu hết các tế bào lai khêng phải là tế bào ung thư Nếu ung thư do
+ At ` ` 7 A a 2 A Lit 4 ⁄
những gene trội thì điểu này không thể xây ra Do không được chú ý, quan sát này đã bị bổ qua gần 20 năm Một trụ ường hợp ngoại lệ khác đã được Knudson
công bố vào năm 1971 về dạng di truyền ung thư mat retinoblastoma trong đó có
ai! ene gây nên ung thư hai mắt, vài kiểu gene chỉ gây bệnh ở một mất,
ài kiểu g i
số ít không gây ung thư Hơn nữa, chỉ có 3 hay 4 locus ung thư có tác động
nh v bệ: ìh được quan sát Có hơn một tỉ tế bào võng mạc đều mang bộ gene thiếu nhưng chỉ có một ít hiếm hoi tế bào trở thành dạng ung thư Điều này cho thấy rõ rằng có một sự kiện đi truyền thứ hai tham gia vào cơ chế gâ ắ bệnh nay, va đột biến được di truyền từ bố mẹ không đủ khá năng gây bệnh, từ đó đưa đến “giả thiết hai tác động” (two-hit hypothesis) Giả thiết này cho r rằng trong bệnh di
truyền, một gene mang khiếm khuyết được thừa hưởng như là một dòng đột biến
gốc và cần một đột biến thứ hai xảy ra sau thụ tỉnh để tạo nên khối u, ngược lại Ở
dạng bệnh không đi truyền cá hai đột biến đều xấy ra ở tế bào sinh dưỡng sau sự kiện thụ tĩnh
Có những khám phá khác không phù hợp với thuyết oncogene trội ở ung thư 7 dụ ở các khối u rắn của người, dạng bất thường trong tế bào được quan sát
thấy phổ biến nhất là mất nhiễm sắc thể Với những kỹ thuật sinh học phân tử
nhạy nhất được dùng để phát hiện các đột biến trên oncogene, những đột biến
như vậy chỉ có thể thấy được & 15% - 30% cdc dang ung thu người Đo đó, một số nhà nghiên cứu bắt đấu suy nghĩ một cách nghiêm túc hơn rằng mất một số
gene chức năng ức chế hay điều hòa có có thể là Res vền nhân gây ung thư
Giả thiết đã được chứng minh, khi nhiễm sắc thể đơn số 11 của nguyên bào
Trang 11biệt trên nhiễm sắc thể ở một số ung thự Ở người cho thấy rằng mất thông tin di truyền “ức chế khối u” (tumor suppressor) 1A su kiéa phd bién ở các dạng bệnh ác tính của người Sự biện diện của các gene kìm hãm sự phần sinh tế bào giải thích
tại sao Ở người chỉ có 25% trường ĐỢP có thay đổi trên gene phát triển thành ung thư, mặc dò chúng ta có 10! tếb bào phân chia suốt đời
Gene ức chế khối u đầu tiên được dòng hóa là gene BE RB được xác định
trong bệnh ung thư mắt retinoblastoma, do Cavenee và cộng sự đã sử dụng bản
đồ đa dạng về độ dài của các đoạn cất hạn chế (RELP: restriction fragment lenzth polymorphism) để xác định các gene trên nhiễm sắc thể 13q14 Gene RB
sau đó được Eriilend và cộng sự tạo đồng (1986) Hiện nay người ta biết rằng có
nhiều đạng ung thư khác của người có sự bất hoạt a-len (allele) ®B, gồm có bướu
chị£ / Ve AT TỒN 2 1
thit (sarcoma), ung thư phổi tế bào nhỏ, ung thy bang quang, và vai dang ung thu
vú,
xe -i
Một số gene ức chế khối u khác đã được tạo dòng và xác định đặc điểm
Nhưng đó dường như chỉ là phần nổi của tảng băng và sẽ còn nhiều khám phá giống như vậy khi nghiên cứu về đi truyền ung thư và bản đồ bộ gene người Một
^ at ~ nw 2 a? is A $a và“ 2 ˆ
đột biên đơn có thể đủ để hoạt hóa một oncosene (nhữ ras), đột biển thứ hai không có tính quyết định Những đột biến ở oncogene làm tăng chức năng của
chúng và dẫn đến giảm biệt hóa tế bào Các đột biến oncogene không xuất hiện
- a ` Z_ aA ^ 1 te ete
bằng con đường di truyền, vì tác động trội của chúng có thể phá vỡ sự phát triển
bình thường của cơ thể Ngược lại, những đột biến ở gene ức chế khối u làm mất
chức năng của chúng, thường phải đột biến ở cả hai a-len Chua ø là tính trạng lặn
trong tự nhiên, và những đột biến này có thể di truyền Một đột biến sinh dưỡng
z KV x z ^“ ^“ ` „ 2 ~ ~⁄ aoe
có thể xảy ra Ở các oncogene và gene ức chế khối u và có thế tích lấy suốt đời
[20]
3 ĐẠI CƯƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƯ 2.3.1 Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thư
Các thuốc chữa ung thư có tác động đến các giai đoạn khác nhau trong quá
trình tổng hợp acid nucleic (đặc biệt là DNA) cũng như quá trình tổng hợp protein
Ở các tế ba © ung thư vào các thối kỳ khác nhau của chu trình phân chia tế bào Ở các mô ung thư của người có khoảng 50% tế bào ở giai đoạn nghỉ không
phần chia Gy) Su phan chia của tế bào có thể phần thành 4 giải đoạn:
- Giai đoạn G; là thời kỳ sau gián phân Thời gian của giai đoan này tất khác
phau tày theo loại tế bào Trong thời kỳ này tế bào sinh ra các protein cần cho
tổng Ì “oP DNA,
Giai doan S JA giai đoạn tổng hợp DNA
^
- Giai đoạn Ởs là giải đoạn tiền gián phân, Trong thời kỳ này xảy ra tổng hợp
RNA a các protein đặc hiệu của ung thư
- Giai đoạn MI là thời kỳ gián phân (thời kỳ phân chia tế bào) Giai đoạn này lại chia thành prophase, metaphase, anaphase và telophase
Trang 12Các thuốc chữa tung thư Không ảnh hưởng đến giai đoạn nghỉ, mà chỉ tác
động lên các giai đoạn Š, G› và M, thậm chí có thuốc chỉ tác động lên một 2 Í a we
nào đó của giai đoạn M mà thôi
2.3.2 Sự kháng thuốc của tế bào ung thư
Các tế bào ung thư có thể kháng lại các thuốc chữa ung thư cũng như vi
khuẩn kháng kháng sinh
Cơ chế tế bào ung thư kháng thuốc có thể là:
Jam giảm khả năng xâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thư - Làm giảm hoạt tính của thuốc do làm thay đổi các phan tử thuốc
- Lam biến đổi các protein mục tiêu và các yếu tố cần cho thuốc tác động lên tế bào ung thư
- Lầm tăng khả năng tổng hợp protein để vẫn đầm bảo phân chia tế bào mặc
dù bị thuốc tác động
Sự kháng thuốc có thể đặc hiệu do một loại thuốc nhất định, nhưng cũng như
kháng kháng sinh, các tế bào ung thư cũng có biện tượng kháng chéo thuốc Ví
dụ: một dòng tế bào ung thư đã kháng alcaloid của dừa cạn, cũng kháng cả anthracyclin Hiện tượng này gọi là kháng đa thuốc (muliidrug resistance)
2.3.3 Độc tính của các thuấc chữa ung thư
Các thuốc chữa ung thư có tác dụng độc, ngăn cần sự phân chia các tế bào tung thư, nhưng đồng thời cũng gây độc cả tế bào lành, do đó chúng thường khá Da,
độc
Tác dụng của thuốc chữa ung thư không đặc hiệu như các hóa trị liệu kháng chuẩn, Vì vậy trong điều trị ung thư bằng hóa trị liệu thường có nhiều tác dụng phụ có hại nhiều khi khá nặng, đặc biệt là tác hại lên tủy xương, trên các tế bào
sinh sản, trên các niêm mạc, da, sự phát triển của tóc, bào thai, trên khả năng sinh miễn địch
Một trong những cách hiện đại làm tăng tính đặc hiệu của thuốc chữa ung
thư là gắn chúng lên các kháng thể đơn dòng
Các biểu hiện độc thường là:
- Rối loạn tiêu hoá, buồn nôn và nôn mửa - Rụng tóc
- Trên tủy xưởng: làm yếu chức năng tủy, hạn chế tạo huyết cầu - Anh hưởng xấu đến buồng trứng và tĩnh hồn, dẫn đến vơ sinh
- Làm chậm tăng trưởng và phát triển ở trẻ em
- Gây ung thư thứ phát do dùng thuốc
- Gây tổn thương mạch mắấu và đau khi truyền thuốc tĩnh mạch hay sau khi
điều trị một thời gian
- Rối loạn tính cách, hành vi
- Sút cần người yếu, không còn khả năng lầm việc
- Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm Vì vậy người đã
Trang 13
^ A ^ Z
Phần 3: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
3.1 VẬT LIỆU 3.1.1 Vinblastin
Vinblastin có tỉnh thể hình kim hay dạng bột trắng, nóng chảy ở 211-216°C,
không tan trong nước và trong ether dầu hỏa, tan tốt trong ethanol , acetone, chloroform, benzen, ethylacetate
Công thức nguyên: C,¿H;sO,N,
Vinblastin sulfate là dạng bột trắng hay vàng nhạt kết tỉnh hay vô định hình, rất dễ hút ẩm, cần bảo quản ở 2-8°C, nóng chảy ở 284-285°C, tan trong nước, chloroform, it tan trong ethanol, không tan trong ether [1]
Vinblastin cd nguồn gốc ban đầu từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus) được
các nhà khoa học người Canada tình cờ phát hiện tính chất gây ức chế phân chia
tế bào bạch cầu trên chuột khi nghiên cứu về khả năng điều trị bệnh tiểu đường
của cây dừa cạn vào năm 1958 Hiện nay vinblastin đã được ứng dụng vào điều trị rộng rãi nhiều bệnh ung thư ở người [27] Trong dé tài này vinblastin được sử dụng như là chất kháng phân bào chuẩn trong các thí nghiệm
Theo y học dân gian của một số nước có cây dừa cạn mọc hoang, rễ của
chúng có tác dụng tẩy g giun, chữa sốt, thân và lá có tính chất săn da (astringent), lọc máu (dépuratiÐ, dùng chữa một số bệnh ngoài da và nhất là chữa tiểu đường
Ở nước ta, nhân dân còn dùng dưới dạng thuốc sắc làm thuốc lợi tiểu, chữa huyết áp, tiểu đường
Các nhà khoa học Canada đã phát hiện và cô lập từ cây dừa cạn chất vincaleucoblastin, và ba alkaloid khác cũng có tấc dụng chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin
Ngoài ra người ta còn thấy tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của
catharathin, vindolinin và vindolidin, nhưng ajmalicin lại có tác dụng ngược lại
Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào những năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác Tuy còn rất nhiều ý kiến khác nhau nhưng vì hiện nay
Trang 14Vinblastin sử dụng trong luận văn này 6 dang mudi sulfate do hang Sigma
sản xuất
3.1.2 Gossypol
Gossypol là một sắc tố vàng loại poliphenol trích từ hột của cây bông Gossypium hirsutum, ho Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy là 182°C Ham lyong gossypol trong hạt bông biến đổi từ 0.1 — 6.64% tùy theo giống
Trong kỹ nghệ cây bông, øossypol được xem như là phế phẩm có độc tính và
thường được khử từ đầu; hột sau khi loại dầu và khử gossypol thường dùng làm
thức ăn gia súc
Vào năm 1950, một bác sĩ Trung Hoa đã phát hiện có sự gia tăng bất thường các cặp vợ chồng không có con trong vùng dùng nhiều dầu bông còn chứa
gossypol
Những thí nghiệm trên động vật và sau đó trên con người cho thấy øossypol có tính diệt tỉnh trùng
Về cấu trúc hóa học gossypol gồm 2 đơn vị naptalen đối xứng mang 3 nhóm chức phenol và 1 chức aldehid Công thức nguyên C;oH;oO¿, trọng lượng phân tử là 518.54, có nhiệt độ nóng chảy là 182°C Gossypol HO, * a CHO I i 1 CHO OH ^s, gossypol
Hinh 3: Cay béng (Gossypium hirsutum) Tác dung sinh hoc ctia gossypol:
Nam 1950, ngudi ta phat hién tac dung lén tinh tring cla gossypol Nhiéu thử nghiệm trên động vật sau đó cho thấy gossypol gây nên:
- Sự giảm bớt tính di động và số lượng của tình trùng cùng với sự xuất hiện nhiều tỉnh trùng dị dạng,
- Giảm thiểu sự sinh sản
- Làm ngưng trệ testosteron (kích khích tố nam)
Trang 15Trung Quốc cũng cho thấy kết quả tương tự Tuy nhiên, sau khi ngưng dùng thuốc
3 tháng thì tỉnh dịch của người trở lại bình thường về mặt định tính và định lượng Ngoài ra gossypol còn có nhiều tác dụng khác như :
- Gây co rút ở các loài gặm nhấm
- Kháng khuẩn
- Tác dụng gây độc cho cơ thể: LD¿ạ heo: 550 mg/Kg, LDso chudt: 2200 mg/Kg Hiện tượng ngộ độc gossypol là sự uễ oãi, nôn mửa, tiêu chảy và khó thở dẫn đến chết vì ngạt thở [6]
Gossypol được thử nghiệm trên bệnh nhân bị ung thư thận (adrenocortical cancer) di căn, kết quả là có 15% trường hợp có đáp ứng Nghiên cứu tác động
của øossypol lên tế bào ung thư vú của người nuôi cấy cho thấy gossypol có thể ức chế sự phân bào và thay đổi sự biểu hiện của nhiều protein điều hòa chu trình tế bào (cell cycle) Một thử nghiệm trên bệnh nhân hóa trị liệu chống ung thư vú
di căn cho thấy gossypol, ở liều lượng phù hợp, có tác động lên những protein điều hòa chu trình tế bào và tác dụng có lợi lên một số bệnh nhân [10]
3.1.3 Phunbagin
Plumbagin là tỉnh thể màu vàng cam, hình kim, nhiét dé néng chay 77 — 78°C, được chiết xuất từ rễ cây bạch hoa xà Plưnbago zeylaniea, họ Phưunbaginaceae Công thức phân tử :C¡;HạOs Trọng lượng phân tử : 188.18 CH; OH
Hinh 4: Cay bach hoa xa (Plumbago zeylanica) va céu tric plumbagin Tính chất hóa học của plumbagin:
- Không tan trong nước
- Tan tốt trong CHCI;, CạH¿, AcOH, (CH;);CO
- Cho màu đỏ máu vdi FeCl,
Trang 16“Tác dụng sinh học của plumbasin:
- Tại Ấn Độ và Châu Phi plumbagin được sử dụng, để trị các bệnh đường tiêu
hóa, phong ghẻ
- Plumbagin có tác dụng diệt khuẩn, nấm
Plumbagin được sử dụng làm chất bảo quản đối với thức ăn và hoa quả
- Plumbagin có tác dụng mạnh với nhiều loài vi khuẩn Gram (+) , vi khuẩn
Gram (-), nấm, vi khuẩn khang acid Vi du nhu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium tubercuosis, Escherichia coli [5]
- Một số tài liệu cho thấy plumbagin có hoạt tính kháng ung thu [8,9]
3.1.4 Các dòng tế bào ung thư
3.1.4.1 Dòng tế bào RD (Rhabdomyosarcoma)
Ký hiệu: ATCC CCL 136 RD (tt Catalogue of American Type Culture
Collecton, ATCC)
Dòng tế bào RD được thiết lập bởi R.M MeAllister từ khối u cơ ở vùng chậu của một bé gái 7 tuổi người Cap-ca (Caucasian) vào tháng 2 năm 1968 Các tế bào mọc thành những lớp đơn trong môi trường lỏng và tạo thành cụm tế bào
(coloni) trên môi trường E'MEM Agar (Eagle`Minimum Essential Medium) bổ
sung 10% huyết thanh bào thai bò (Fetal Bovine Serum) Tế bào nuôi cấy có 2
dang, dang tế bào gân giống tế bào mô ung thư ban đầu, và dạng tế bào trai rong
có nhiều nhân Tế bào có myoglobin và hoạt tính myosin-ATPase Dòng tế bào
RD là dòng tế bào ung thư cơ đầu tiên của người được xác định đặc tính và
nghiên cứu chỉ tiết
3.1.4.2 Dòng tế bao HEp2 (Epidermoid carcinoma)
Ky hiéu: ATCC CCL HEp?2 (tit Catalogue of American Type Culture
Collecton, ATCC)
Dòng tế bào HEp2 đã được thiết lập bởi A.E Moore, L Sabachewsky, và
H.W Toolan vào năm 1952, từ những khối u tạo ra ở chuột vừa dứt sữa sau khi dyoc tiêm mô ung thu biểu bì thanh quản của 1 người đàn ông người Cap-ca
(Caucasian) 56 tudi Viéc phan lap in vitro đã được thực hiện ở nhiều phức hợp
của nước ối thai bò, dịch chiết phôi, huyết thanh người và ngựa, và dung dịch
muối cân bằng những tế bào giếng biểu mô này phát triển tốt trong nhiều dạng môi trường nuôi cấy Đây là một dòng tế bào khỏe mạnh có thể chống lại nhiệt
độ, thiếu hụt dinh dưỡng, và những thay đổi môi trường mà không mất khả năng
sống [24]
QO
Trang 173.2 PHƯƠNG PHÁP
3.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào:
Tế bào được nuôi cấy trong môi trường EMEML (Eagle' Minimum Essential Mediuam) có thành phần như sau: Bột E'MIEM 4.1728 L-Glutamine 200mM 5 ml NaHCO; 75% 7.5 mì HEPES IM 10 ml Amphotericin B 0.1% 25 Penicillin 0.000 UI Streptomycin 50 mg Phenol do 0.4% [ml Huyết thanh (Fetal bovine serum) 50 ml Nước cất đủ 500 ml pH 72
Điều kiện nuôi cấy: 37.5°C, 5% CO¿
3.2.2 Phương pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay) : Sau một thời gian nuôi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào
được tách rời bằng dung dich trypsin/EDTA
giếng; mỗi giếng gồm 100L! dịch huyển phù tế bào (khoảng 100.000 tế bào) và 400 oul môi trường
Tế bào được ủ ở 37.5°C trong 24 giờ Sau đó môi trường cũ được thay bằng
và được cấy vào các giếng của đĩa 24
môi trường chứa gossypol 6 néng dé O.lug/ml - 20ug/ml vdi cd 2 dong tế bào
no ndng dé 0.lug/ml - 2ug/mi doi vi ddng té bao RD va 0.lug/ml dòng tế bào HEp2 Lô đối chứng được xử lý với môi trường
chất là DMSO Các lô được ủ 72 giờ ở 37.5 ° : dung hoae plumba agin - [Opg/ml déi vi chứa dung môi hòa tan hoạt Sau thời iA gian Ú, tách rời tế bào trong mỗi giéng bằng dịch
trypsin/EDTA, hòa tế bào vào 500 kÌ mơi trường và nhuộm bằng trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1 (dịch huyền phù tế bào: thuốc nhuộm) Số lượng tế bào sống (tế bào không bắt mau xanh) được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Khả năng
ức chế sự phát triển các đòng tế bào ung thư của hoạt chất được tính theo công
thức: Mật độ tế bào đối chứng ~ Mật độ tế bào thi ae AA x RR A AN
Tỷ lệ ức chế (%) = x 1009
Mật độ tế bào đối chứng
[25]
3.2.3, Phuong phap MTT (MTT assay):
Phương pháp MTT dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol~
2-yi)-2,5 dipheny! tetrazolium bromide) thinh MTT-formazan c6 mau xanh tim
ở tị thể của tế bào Số lượng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng
C
bởi enzyme hô hấp
Trang 18dO formazan, thé hién qua gid trị mật độ quang OD s;o của dung dịch
Sau một thời gian nuôi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào được tách rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và được cấy vào các giếng của dia 96
giếng; mỗi giếng gồm [00H dịch huyền phù tế bào (khoảng 10.000 tế bào) Tế bào được ủ ở 37.5°C trong 24 giờ Sau đó môi trường cũ được thay bằng
mỗi trường chứa gossypol ở nồng độ 0 1ug/ml - 20ugø/ml với cả 2 dòng tế bào piumbagin ở nồng độ 0.1ug/ml - 2ig/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1ug/ml - “uy đối với dòng tế bào HEp2 Lê đối chứng được xử lý với môi trường
a dụng môi hòa tan hoạt chất là DMSO Các lô được ủ 72 giờ ở 37.5 "Œ
Sau thời gian ủ, môi trường xử lý được thay bằng môi trường chứa 0.5 rng/ml MT, Sau 4 siờ ở 37.5 °C môi trường chứa MTT được thay bằng hỗn hợp
isopropanol-HCl (0 04M) Do ODs¿o của các lô thí nghiệm và đối chứng Khả
năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thư của hoạt chất được tính theo
công thức; ¡8,18,19]
; ODs75 dGi chifng — ODs79 thi n ghiệm
Tỷ lệ ức chế (%) = x 100%
ODz¿o đối chứng
3.2.4 Phiiong phap clonogenic (clonogenic assay):
Phương pháp clonogenic dùng để xác định tỷ lệ tế bào ung thư bị ức chế
phân bào o dưới tác động của hoạt chất
000 tế bào RD, hoặc 500 tế bào HEp2, được cấy vào mỗi giếng của đĩa
24øi Ene
Tế bào được ủ ở 37.5°C trong 24 giờ Sau đó môi trường cũ được thay bằng
2
môi trường chứa gossypol ở nồng độ 0.1Hg/ml - “ng với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở nồng đệ 0.1ig/ml - 2ug/ml đối với dòng tế bào RÐ va 0.Lug/ml
- 1ÖHg/ml đối với dòng tế bào HEp2 Lô đối chứng được xử lý với môi trường
chứa dụng môi hòa tan hoạt chất là DMISO Các lô được ủ 72 giờ ở 37.5 ”C
a
Sau thời gian ủ, sế cạm (colony) tế bào hình thành trong mỗi siếng được
đếm dưới kính hiển vi Khả năng ức chế phân bào của hoạt chất được tính theo
công thức: © S6 colony déi chting — So colony thi nghiệm w ae Sp a een
Tỷ lệ ức chế (%) = x 100%
Số colony đối chứng 7.16.17]
Liyà
3.2.5 Phương pháp xác định giai đoạn tác động của hoạt chất lên chu trình tẾế bao ung thi in vitro
_ Phương pháp này được sử dung để xác định giai đoạn hoạt chất tác động ức
chề sự ph át triển của tế bào u trng thư RÐ: ức chế sự tổng hợp ĐNA (G/$) hay ức chế giai đoạn phân bào (G›/M) Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự thay
Trang 19Phương pháp được thực hiện như sau:
- Các bước nuôi cấy, tạo dịch huyền phù và xác định mật độ tế bào được
ð mục 2.2.3
tích địch huyền phà có chứa 100.000 tế bào RD cấy vào các giếng của đĩa 24 giếng chứa sẵn 1000uH1 môi trường E'MEM 0.2% huyết thanh
Sau 4§ giờ ủ ở 37.5, 5% CÓ¿, tế bào trong giếng đồng nhất về giai đoạn Ốp bởi
De © 3 = oO N
thực hiện 1 như mề tí
+ ⁄
vì môi trường thiếu các yếu tố tăng trưởng cần thiết có trong huyết thanh [12,13]
- Sau thời gian ủ, thay môi trường 0.2% huyết thanh bằng môi trường 10% huyết thanh không có hoạt chất để xác định đồ thị biểu thị các giai đoạn của chủ trình tế bào RD ở điều kiện bình thường Môi trường 10% huyết thanh có hoạt
chất vinblasun 0.005ppm, gossypol Sppm hoặc plumbagin 0.2ppm được sử dụng =
khi xác định đồ thị biểu thị tác động của hoạt chất lên chu trình tế bào Tế bào
»
ào Ở các giếng tương ứng với mỗi thời điểm 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18
el
- 7!
16, 18, 20, 22, 24 giờ kể từ khi cho mồi trường 10% huyết thanh vào giếng bằng
trypsin/EDTA, hòa tế bào vào 1ml môi trường, xác định mật độ tế bào trong dịch
huyền phù đó trên buồng dém Neubauer
- Ly tam dich huyền phà 1000 vòng/phút trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi, thu
sinh khối tế bào ở mỗi thời điểm,
- Tách ĐNA từ sinh khối tế bào thu được bằng phương pháp phenol-
chloroform:
+ Cho vào mỗi eppendorf có tế bao 900ul trizol, vortex Ì phút
+ Cho vào mỗi eppendorf trén 200ul chloroform, vortex ] phút, ly tâm 13.000 véng/phut trong 10 phat Hut 250ul dịch trong bên trên cho vào một €ppendorf khác
+ Bổ sung thêm 250.1 isopropanol vao mdi eppendorf, đảo đều, để trong toi | gò Ly 13.000 vong/phiit trong 25 phiit Loai bé dich ndi thu cin DNA
+ Cho vào mỗi “ppendon f iml ethanol 70%, ly tim 13.000 vong trong 10
phut, loại bỏ dịch nổi, thu căn DNA, Để khô cặn tự nhiên, hoà cặn DNA thu được
vào 50ui TE Xác định hàm lượng DNA (ng/_)) thu được bằng phương pháp đo mật độ quang với máy quang phổ định lượag DNA tự động
ye 2 Reto can AP
- Tính tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào (10'/m]) ở mỗi thời điểm
ve do thị biến thiền của tỷ lệ này theo thời gian nuôi cấy
3.2.6, Phương pháp xử lý thống kê
Số liệu thu được từ các thí nghiệm dược xứ lý thống kê bằng phần mền
Trang 20Phần 4: KẾT QUÁ - THẢO LUẬN
4.1 TÁC ĐỘNG CỦA VINBLASTIN LÊN HAI DÒNG TẾ BÀO RD VÀ
HEp-2
Tác động của vinblastin lên hai dòng tế bào RD và HEp-2 được xác định bang ba phương pháp trypan blue, MTT va clonogenic
4.1.1 Tác động của vinblastin lên dòng tế bào RD
Sau khi tiến hành các thử nghiệm thăm dò, chúng tôi xác định được nồng độ
vinblastin phù hợp để khảo sát ảnh hưởng lên sự phát triển của tế bào RD là 0.0005, 0.00
Mỗi thí 1.0.005, 0.01 và 0.05ppm nghiệm lặp lại 9 lần Kết quả trinh bay 6 bang 3.2 và đồ thị 3.2
Bảng 1: Tác động của vinblastin lên dòng tế bào RD Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%) | (ppm) Trypan blue MTT Clonogenic | 0.0005 18.30 + 11.53 c 817 +1180 c 21.54 ~31.46 c | | 0.001 | 28.68 + 12.79 b | 15.99+9.62 ¢ 59.67 = 16.26 b | my 8272+301 a | 7622+336 b | 9735+263 a mm 8736394 a | 8305+218 ab| 98572179 a | 0.05 8912+2.15 a 88.52 + 1084 a | 99.19+0.93 a | | LSDe=0.01 10.92 931 | 20.28 | 100- 90 SỐ 80- —— Sf 0” | s ú0- —Ê 2 30~ | OTrypan blue « 40 MIT 2 30~ _ Th OClonogenic _ 20 0 UL = / 0.0005 0.001 0.005 Nồng độ hoạt chất (ppm)
Đồ thị 1: Tác động của vinblasin lên dòng tế bào D
Kết quả 6 bang 1 va dé thi | cho thấy vinblastin có tác động lên sự phát triển
Trang 21của tế bào RD
Ở các nổng độ 0.05, 0.01, 0.005ppm, vinblastin ức chế gần như hoàn toàn
khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện qua kết quả thử nghiệm bằng phương
pháp clonogenic với tỷ lệ ức chế phân bào xấp xỉ 100% Sự khác biệt về tỷ lệ ức
chế phân bào RD ở ba nồng đô vinblastin trên là không có ý nghĩa thống kê Điều này cho thấy là gần như khơng có cony nào được hình thành trong giếng
nuôi, nghĩa là hầu như mọi tế bào đều không còn khả năng phân chia Tuy nhiên,
kết quả ở hai thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào RD khoảng 70-90% Như vậy, các tế bào RD vẫn còn sống được ở các nồng độ vinblastin 0.005-0.05ppm tuy mất khả năng phân bào
Ở nồng độ 0.001 và 0.0005ppm, vinblasin cũng làm giảm số tế bào RD có
khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm
clonogenic tudng ting 1a 59.67% va 21.54% Dong thời tỷ lệ ức chế xác định bằng
hai phương pháp trypan blue và MTT cũng giảm xuống tương ứng là 28.68 - 18.30% và 16.02 - 8.29%
Khi so sánh tỷ lệ ức chế sự phát triển tế bào RD của vinblastin thu được từ
ba phương pháp trypan blue, MTT, clonogenic chúng tôi thấy rằng ở nồng độ
0.005ppm vinblastin gây ức chế phân bào hoàn toàn (clonogenic: 97.35) nhưng
độc tính gây chết tế bào thấp nhất (trypan blue: §2.72%, MTT: 7§.40%) so với các nồng độ gây ức chế phân bào hoàn toàn khác là 0.01 và 0.05ppm co e mo 2b te bio scing 4 ou đĐ T- T bo chết 4 oe ike Hình 6: Colony tế bao RD (50x) Hình 7: Tế bào được nhuộm bằng trypan blue (50x) ©) | ae S50" Ae
Hinh 8: Tinh thé formazan hinh thanh quanh tế bào RD ở thí nghiệm MTT
(a) đối chứng (50x); (b) có vinblastin (100x)
Trang 22(a) (b) : œ % 2 | ~~ yo 2 ñ | a ' 3 : 5 3 ' lš & g “St Sankey Á a = 2 ~ hai - SN ĐN s Đ A oO, #2 3 Œ eo?:*% ^ Vo 2 = (c) Các ấn ()J.' *: wn “ (e) Hình 9: Tế bào RD ở các nồng độ vinblastin sau 72 giờ tác động (50x) (a) 0.05ppm; (b) 0.01ppm; (c) 0.005ppm:(d) 0.001ppm;(e) 0.0005ppm;(Ð 0.0 ppm 4.1.2 Tác động của viublastin lên dòng tế bào HEp-2
Sau khi tiến hành các thử nghiệm thăm dò, chúng tôi xác định được nồng độ vinblastin phù hợp để khảo sát ảnh hưởng lên sự phát triển của tế bào HEp-2 là 0.0005, 0.001, 0.002, 0.004 và 0.006ppm
Trang 23100 90 §0- & 70: %9 60 =5 58 — — a 30 — | Trypan blue | wa 40 MIT ss - li allt OClonogenic | 0.0005 0.001 0,002 0.004 0.006 Nồng độ hoạt chất (ppm)
Đồ thị 2: Tác động của vinblastin lên dòng tế bào HEp-2
Kết quả ở bảng 3.3 và đồ thị 3.3 cho thấy vinblastin có tác động lên sự phát triển
của tế bào HEp-2
Ở nồng độ 0.006ppm, vinblastin sây độc và giết chết gần như hoàn toàn tế bào HEp-2 thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần như 100% ở cả 3 phương pháp thử nghiệm Tương tự như tác động lên tế bào RD, trên tế bào HEp-2, ở nồng độ 0.004ppm
vinblastin ức chế gần như hoàn toàn khả năng phân bào của tế bào HEp-2 nhưng kết quả thử nghiệm trypan blue (§8.97%) và MTT (§2.52%) cho thấy tế bào vẫn còn sống được ở nồng độ này
Ở các nồng độ 0.002, 0.001 và 0.0005ppm, vinblastin cũng làm giảm số tế bào HEp-2 có khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử
nghiém clonogenic lần lượt 14 94.12%, 66.93% va 19.52% Đồng thời tỷ lệ ức chế
xác định bằng hai phương pháp trypan blue và MTT cũng giảm xuống tương ứng
50.99 — 25.87 — 5.3% và 39.34 — 20.12 —9.11%
Khi so sánh tỷ lệ ức chế sự phát triển tế bào HEp-2 của vinblastin thu được từ ba phương pháp trypan blue, MTT, clonogenic, chúng tôi thấy rằng ở nồng độ
0.004ppm, vinblastin gây ức chế phân bào hoàn toàn tế bào HEp-2 (clonogenic:
Trang 25Nhận xét chúng:
- Vinblastin là một hoạt chất kháng ung thư đã được đưa vào điều trị rộng rãi và đạt nhiều kết quả khả quan Ổ đây chúng tôi sử dụng vinblasun như là một
chất kháng phân bào chuẩn làm đối chứng dương trong các thử nghiệm của mình Với kết quả thu được từ thí nghiệm trên, chúng tôi thấy rằng các phương pháp được xây dựng để sàng lọc và xác định hoạt tính kháng phân bào của hoạt chất
^Z
trên hai đòng tế bào ung thư của người nuôi cấy in vitro hoạt động tốt
- Mỗi phương pháp trypan blue, MTT, clonogenic dựa trên một chỉ tiêu khác nhau để xác định hoạt tính kháng phân bào của hoạt chất Phương pháp trypan
biue dựa trên việc xác định trực tiếp số tế bào ung thư còn sống ở các nồng độ hoạt chất khác nhau, phương pháp MTT đánh giá sức sống của các tế bào gián tiếp thông qua hoạt động hô hấp của tế bào, phương pháp clonogenic dựa trên số colony hình thành ở các nồng độ hoạt chất khác nhau để đánh giá khả năng phân chia của tế bào trong quần thể dưới tác động của hoạt chất Bằng việc sử dụng
kết hợp ba phương pháp trên, chúng tôi có thể xác định nổng độ hoạt chất gây
chết tế bào, ức chế phân bào hoàn toàn nhưng không (hay ft) làm chết tế bào và
ức chế phân bào một phần Những thông tin nay | khong những cho phép đánh giá
hoạt tính kháng phân bà
én
aa của hoạt chất mà còn là cd sé cho bước nghiền cứu sâu
lếr
hơn về giai đoạn tác động og lên chu trình tế bào ung thư
- Cụ thể các nông độ tác động của vinblasun lên hai dòng tế bào ung thư RD va HEp-2 nhw sau
+ RD: tế bào bị ức chế phân bào hoàn toàn nhưng vẫn sống ở nồng độ 0.005
- 0.05ppm, bị ức chế phân bào một phần ở nồng độ 0.001-0.0005ppm
a 2
+ HEp2: tế bào bị giết chết hoàn toàn ở nềng độ 0.006ppm, bị ức chế phần bào hoàn toàn nhưng tế bào vẫn sống ở nồng độ 0.004ppm, bị ức chế phần bào một phần ở nống độ 0.0005 - 0.002ppm
- Đáp ứng của hai đồng tế bào RD và HEp-2 với hoạt chất vinblasuin cũng
khác nhau Tế bào HEp-2 nhạy cảm với vinblastin hơn tế bào RD, thể hiện qua nồng độ vinblastin gây chết hoàn toàn tế bào HEp-2 là 0.006ppm trong khi một số tế bào RD vẫn sống được ở nồng độ vinblastin 0.05ppm Tuy nhiền, nồng độ vinblastin gây ức chế phân bào hoàn toàn nhưng có độc tính thấp ở hai dòng tế bao RD va HEp-2 gan như tương đương nhau, 0.005ppm (RD) và 0.004ppm (HEp-
2) Điều này cho thấy RD có khả năng chống chịu liểu vinblasun cao tốt hơn HEp-2, nhưng ở các nồng độ thấp, sư tác động của vinblastin lên hai dòng tế bào
tàv tương đương nhau
- Theo NI, tiêu chuẩn để một chất được xem là có tiểm năng kháng phân
Trang 26sát, kết quả thí nghiệm của chúng tôi cho thấy vinblastin ức chế trên §0% sự phát
triển của tế bào RD và HEp-2 ở nồng độ 0.004-0.005ppm tức tương đương
0.432x107 - 0.54x10mM Như vậy, vinbiastin có hoạt tính mạnh hơn rất nhiều so với tiêu chuẩn của NCI về hoạt chất kháng phân bào
4.2 GIAI DOAN TAC DONG CUA HOAT CHAT LEN CHU TRINH PHAN
BAO CUA TE BAO UNG THU RD
Sau khi đã xác định được hoạt tính kháng phân bào của ba hoạt chất
vinblastin, gossypol va plumbagin lên hai dòng tế bào ung thư RD và HEp-2,
chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định giai đoạn trong chu trình tế bào RD bi tic
chế bởi các hoạt chất
4.2.1 Chu trình tế bào của tế bào RD
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần Kết quả thể biện ở bảng 3 và đồ thị 3
Bảng 3: Sự biến thiên của tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào RD theo thời gian
| Thời gian | Mật độ tế bào | Hàm lượng _ Tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ
Trang 27S29 = Xà - = 27 o 7 ~ 25 im E = > eg 2.3 z, “ms ret 21 >0 = = 1.9 = = a 17 cá» - — |3 By = ¬ 1.3 ĩ 7 + 7 t ĩ 1 ĩ f : T T i
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Đồ thị 3: Sự biến Huiên của t lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào RD theo thời gian
Bảng 3 và đồ thị 3 cho thấy độ dài thời sian tương đối của các
trong chu trình phần bào cua t€ bao RD
Khi các tế bào RD (đã đồng nhất hóa ở giai đoạn Gp) dude nuôi trong môi trường chứa 10% huyết thanh thì chu trình tế bào của chúng bắt đầu và thời điểm
này được tính là thời điểm Ô giờ
Từ 0 đến 12 giờ, tý lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào dao động trong khoảng
1.904 đến 2.132, cho thấy đây là thời gian tế bào đang ở giai đoạn G5 vì hàm
lượng DNA trong quần thể tế bào chưa tăng lên, hầu hết tế bào mang bộ nhiễm
¡ đoạn
0S, ras)
Từ 12 dén 14 giờ, tý lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào có sự tăng vọt lên
2.656, như vậy chứng tỏ là đã có sự gia tăng hàm lượng DNA trong quần thể tế
bào nhưng số lượng tế bào chưa tăng
thành việc nhân đôi DNA tức là đã hoàn tất giai đoạn S vì tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào đạt giá trị cao nhấ
Từ 14 đến L8 giờ, tỷ lệ ham | lượn cao 2.548-2.656, có nghĩa là tế bào chưa
+
tất Như vậy từ ¡4 ~ 1§ giờ, tế bào đang
lên 14 giờ là thời điểm các tế bào RD hoàn
al
g DNA/ mật độ tế bào được duy trì ở mức độ
ân chia tuy sự nhân đôi DNA đã hoàn giải đoạn ¿ chuẩn bị đi vào giai đoạn
t is
Qe
2
phan bao (ND
Ở thời điểm 20 Ô giờ, tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào giám xuống bằng
với Ở Cj giải đoạn Ö ~ 12 giờ Điều này cho thấy là sự phân bào đã xây ra Vậy giai =
sh
đoạn M của chu trình tế bào đã diễn ra trong khoảng 18-20 giờ
Trang 28Trong khoảng 20 - 24 giờ, tý lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào dao động trong khoảng 2.000-2.060 tức là tương đương với giai đoạn G,/$, cho thấy tế bào
đã trở lại giai đoạn đầu tiên của chủ trình phân bào tiếp theo
Như vậy có thể tóm tắt chu trình tế bào RD như sau:
0-12 giờ: giai đoạn G/S
14 giờ: hoàn thành giai đoạn Š
14-18 giờ: giai đoạn Õa
18- 20 gid: xay ra qué trinh phan bao (M)
Ths _ an một chu trình tế bào RD được xác định là 20 giờ, trong đó giai doan G, vA § đài 14 giờ chiếm 70% tổng thời gian chu trình, giai đoạn Ố¿ đài
khoảng 5 " chiếm 2 25% tổng thời gian chu trình Kết quả này phù hợp với chu
trình tế bào động v$† theo lý thuyết đã để cập ở mục 2.1
Theo kết quả thụ t ược, tỷ lệ trung bình hàm 3 lưg dng DNA/mat dé té bao tang từ 2.016 ở giai đoạn G¡ lên 2.598 ở giai đoạn G Điều này có thể giải thích là do
17 a a lộ ` a ` ` ^“ x, x2 “a
chi c6 28.87% số tế bào RD trong quần thể bước vào phân bào, vì nếu tất cả tế
bào đều phân chia thì tý lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào ở giai đoạn G¿ phải
x
ăng lên gấp đôi giai đoạn Ơi
Kết quả xử lý thống kê cho thấy sự khác biệt tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào ở 14, 16 và 1§ giờ với các thời điểm khác có ý aghfa thống kê
4.2.2 Chu trình tế bào ÑD khi bị tác động bởi viiblastin
Như đã để cập ở trên, vinblastin được sứ dụng troag để tài như là một chất
chuẩn để đánh giá sự hoạt động của các phương pháp được xây dựng Cơ chế tác
động của vinblasuin lên tế bào ung thư đã được biết rõ, vinblastin gắn vào các
or a
- ¬ ae ` ta 2 2 2
protein tubulin trong tế bào làm cho các protein này không thể polymer hóa dé tạo thành thoi vô sắc trong giai đoạn M của chu trình tế bảo Do đó các nhiêm sắc thể không thể di chuyển về hai cực, kết quả là chu trình tế bào ung thy bi gián đoạn ở giai đoạn M (giai đoạn phân bào) Trên cơ sở những hiểu biết này, chúng tôi kiểm tra tính đúng đắn của phương pháp mà chúng tôi thiết lập
Nông độ vinblasun được sử dụng để khảo sát trong thí nghiệm này là 0.005ppm, đây là nồng độ đã được xác định là ức chế phân bào hoàn toàn tế bào
RD nhung độc tính với tế bào tương đối thấp (xem mục 4.1.1)
eae
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần Kết quả thé hién ở bảng 4 và đồ thị 4
Trang 29Bảng 4: Sự biển tiên của tỷ lệ hàm lượng DNA/mẠt độ tế bào RD theo thời gian
dưới tác động của vùtblastin Thời gian Mật độ tế bào Hàm lượng Tỷ lệ hàm lượng DNA/mật nuôi cấy (giờ) (x10/m)) DNA (ng/ul) độ tế bào 2 11.73 20.29 1.730 + 0.71 bc 4 | 12.39 22.13 1786 + 042 be 6 11.85 22.37 1.888 = 0.35 abe 8 12.96 20.19 1.558 +03 ¢ LƠ 12.24 20.24 1.654 + 037 be 12 11.84 21.33 1.802 + 032 bc 14 11.28 20.28 1,798 + 0.46 bc 16 11.55 25.66 2.222 + 0.23 abe i 18 12.34 28.26 2.290 + 0.26 abc | 20 12.61 29.66 2352 + 025 ab 22 11.50 29.60 | 2.574 + 0.57 a 24 | 11.35 26.97 2.376 + 0.08 ab LSD «a =0.01 | 0.666 oS 2.9 227 D>: = 25 = 3 23 ri Zz ^ 2 ặ / = » oe \ J 3 1.7 S.Ồ = U.S ` 1.3 T T T T T T T T T T T N 14
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Đầ thị 4: Sự biến thiên của tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào RD theo thời
gian dưới tác động của vùtblasiin
Trang 30Tương tự như khi thiết lập đồ thị chu trình tế bào RD không xử lý với hoại
chất, thời điểm 0 giờ của chu trình tế bào xử nh với vinblasun được tính từ lúc
cung cấp môi trường chứa 10% huyết thanh với vinblastin 0.005ppm cho tế bào Từ O đến l4 giờ, tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào dao động trong khoảng 1.55§ đến 1.858 Điều này cho thấy đây là thời gian tế bào đang Ở giải đoạn G/§ vì hàm lượng DNA trong quần thể tế bào chưa tăng lên
Từ 14 đến 16 giờ, tỷ lệ hàm lượng DNA mật độ tế bào tăng lên 2.222, chứng
tổ đã có sự gia tăng hàm lượng DNA trong quần thể tế bào nhưng số lượng tế bào
chưa tăng lên Như vậy, 16 giờ là thời điểm các tế bào RD hoàn thành việc nhân
đôi DNA tức là đã hoàn tất giai đoạn S Điều này cho thấy vinblastin không ngăn
cần sự tổng hợp DNA trong tế bào Thời điểm hoàn tất giải đoạn S ở trường hợp có vinbiastin chậm hơn chu trình tế bào RD bình thường 2 giờ Có thể là do vinblastin làm tế bào châm thích nghi với môi trường mới do đé kéo đài thời gian giải đoạn GUS
Từ i6 đến 24 giờ, tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào được duy ind ở mức độ
cao đao động trong khoảng 2 222-2.574 So với đồ thị chu trình tế bào bình thường có thể thấy rằng tế bào không phân chia mặc dù sự nhân đôi DNA đã
hoàn tất, hay nói cách khác là giai đoạn M đã không diễn ra hoặc diễn ra khơng
hồn tồn khi có mặt vinblasun Như đã xác định ở mục 3.1.2.1, vinblastin ở nồng độ 0.005 ppm ức chế hoàn toàn sự phân chia của tế bào RD sau 72 giờ khảo sát,
do đó có thể kết luận rằng đây là tác động ức chế, không phải là tác động làm chậm chu trình phân bào tế bào RD Điều này hoàn toàn phù hợp với cơ chế tác
động của vinblastin lên tế bào ung thư đã được biết rõ
Kết quả thí nghiệm này cho thấy có thể sử dụng phương pháp theo dõi sự
biến thiên của tý lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào theo thời gian để xác định
giai đoạn tác động của hoạt chất kháng phân bào lên chủ trình tế bào Đây là
phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không cần các thiết bị phức tạp như các
phương pháp fow cytomety hay phương pháp đo sự hấp thu PH] thymidine
thường được sử dụng trên thế giới Tuy nhiên phương pháp này mất nhiều công
sức, thời gian và phải được lặp lại nhiều lần thì kết quả mới đáng tin cậy
4.2.3 Chu trình tế bào RD khi bị tác động bởi gossypol
Néng dé gossypol dude stv dung sa khảo sát trong thí nghiệm này là 5ppm,
đây là nồng độ đã được xác định là ức chế phân bào hoàn toàn tế bào RD nhưng
độc tính với tế bào tương đổi thấp Ne isuyén Dang Quan 2005 |
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần Kết quả thể hiện ở bảng Š và đồ thị 5
Trang 31Bảng 5- Sự biến thiên của tỷ lệ hàm lượng ĐNA/mật độ tế bào RD theo thời gian đdướt tác động của gossypol
[ Thời gian Mật độ tế bào | Hàm lượng Tỷ lệ hàm lượng DNA mật độ |
| nuôi cấy (giờ) (x10!/m) DNA (ng/L) té bao | l 2 10.12 14.75 1.458 + 0.34 b | 4 1145 20.93 1.828 + 0.25 ab | 6 13.09 23.48 1.794 + 0.25 ab 8 12.61 22.14 1.756 + 0.38 ab 10 10.42 21.15 2.030 + 0.49 a 12 11.17 20.22 1.810 + 0.40 ab 14 12.64 24.02 1.900 + 0.35 ab 16 13.23 25.96 1.962 + 0.42 ab 18 13.25 26.55 2.004 + 0.35 ab 20 13.56 28.34 2.090 + 0.56 a 22 13.32 25.15 1.888 + 0.41 ab | 24 | 1241 24.79 1.998 + 0.54 ab | LSD a=0.05 | 0.518 Z 29 2 247 « ~ 2 25 E Š 23 z 22] Š lọ [NW a NA z lan 5 127 = L5 ⁄ ~ L.3 —r T T T T T T T T T T T 1 0 2 4 6 § 1 12 14 16 1§ 20 22 24 26
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Đồ thị 5: Sự biến thiên của tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào RD theo thoi gian dưới tác động của gossypol
Trang 32dao động trong khoảng 1.458 đến 2.090 mà Không có sự gia tăng ở thời điểm 14-
16 giờ Diễn biến ở đây hoàn toàn khác với chu trình tế bào bình thường của RD
cũng như chu trình tế bào xảy ra dưới tác động của vinblastin Kết quả trên cho
thấy trong suốt 24 giờ khảo sát đã không có sự gia tăng hàm lượng DNA trong quần thể tế bào hay nói cách khác gossypol đã ngăn chặn sự tổng hợp DNA ở giai đoạn § Vậy gossypol ức chế chu trình tế bào RD ở giai doan G,/S
Kết quả này phù hợp với công bố của các tác giả Wang và Rao (1984) [22], Adlakha (1989) [7] về cơ chế tác động của gossypol lên tế bào
Tỷ lệ hầm lượng DNA/mật độ tế bào suốt 24 giờ khảo sát gần như không đổi Kết quả xử lý thống kê cho thấy các giá trị thu được khác biệt không co ý nghĩa thống kê, (a) + (b)
Hình 13: Tế bào RD sau 12 gid (a) và 24 giờ (b) xử lý với gossypol 5 ppm (50x)
Hình 13 cho thấy ở nồng độ gossypol 5ppm, mật độ tế bào RD không thay
đổi đáng kể giữa thời điểm 12 và 24 giờ tác động, đồng thời cũng không quan sát
thấy hiện tượng gây độc tế bào
4.2.4 Chu trình tế bào RD khi bị tác động bởi phunbagin
Nông độ plumbagin được sử dụng để khảo sát trong thí nghiệm này là
0.5ppm, đây là nồng độ đã được xác định là ức chế phân bào hoàn toàn tế bào
RD nhưng độc tính với tế bào tương đối thấp [Nguyễn Đăng Quân 2003]
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần Kết quả thể hiện ở bảng 6 và dé thị 6
Trang 33Bang 6- Sự biến thiên của tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào RD theo thời gian
dưới tác động của phunbagin
Thời gian Mật độ tế bào Hàm lượng Hàm lượng DNA/mật độ |
[nuôi cấy (giờ) (x10/mÐ DNA (ng/ul) tế bào | 2 11.10 1778 1602 + 04la — | 4 12.16 18.70 1.538 + 0.54 a | 6 J2.11 20.80 1.718 + 0.60 a - § 11.32 17.43 1.540 + 0.32 a | 10 12.19 18.75 1.538 + 0.37 a | 12 1132 18.38 1.624 + 0.33 a | 14 10.14 16.02 1.580 = 0.55 a | 16 11.86 20.92 1.764 + 037 a - 18 11.65 21.39 1.836 + 0.48 a | 20 13.08 24.25 1.854 + 0.42 a | 22 13.36 23.33 1.746 + 0.44 a | | 24 11.12 21.67 1.948 + 0.11 a - LĐD =0,05 0.548 đ 2.9 %9 27 = 25 a € S23 Zz 2q 2 = L9 aT Ã l7 =, LỆ : 13 T T T T T T T T T T T T 1 0 2 4 6 8 LÔ 12 14 16 18 20 22 24 26
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Đồ thị 6: Sự biến thiên của tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào RD theo thời gian dưới tác động của phumbagin
Trang 34Đồ thị 6 cho thấy trong 24 giờ Khảo sát, tỷ lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào đao động trong Khoảng 1.53§ đến I.94§ mà không có sự gia tăng ở thời điểm 14-
16 giờ Dạng đồ thị tương tự dạng đồ thị tác động của gossypol và cũng hoàn toàn
khác với dạng đồ thị thiết lập trong trường hợp có xử lý vinblastin Như vậy,
plumbagin cũng ức chế chu trình tế bào RD ở giai đoạn G/S
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Elangovan (1994) khi khảo sát tác
động của plumbagin lên hai dòng tế bào ung thư HEp-2 và Sarcoma-I80 [II] Ngoài ra, plumbagin còn được Josephrajkumar (2002) thông báo là gây ức chế tổng hợp DNA ở loài côn trùng Welicoverpa armigera [15]
Kết quả xử lý thống kê cho thấy đồ thị biểu diễn tỷ lệ hàm lượng DNA/mật
độ tế bào suốt 24 giờ khảo sát không có dạng biến thiên đặc biệt mà chỉ là sự
dao động ngẫu nhiên không có ý nghĩa thống kê (a) (b) Hình 14: Tế bào RD sau 12 gid (a) và 24 gid (b) xit ly voi plumbagin 0.Sppm (50x)
Hinh 14 cho thấy ở nồng độ plumbagin 0.5ppm, mật độ tế bào RD không thay đổi đáng kể giữa thời điểm 12 và 24 giờ tác động, đồng thời cũng không
thấy hiện tượng gây độc tế bào
Trang 35^“
Phần 5: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
1 Có thể sử dụng phương pháp theo dõi sự thay đổi tý lệ hàm lượng DNA/mật độ tế bào theo thời gian để xác định giai đoạn trong chu trình tế bào ung thư bị hoạt chất ức chế
2 Hai hoạt chất gossypol và plumbagin đều ức chế chu trình tế
RĐÐ ở giai đoạn G/S, =
1
bào ung thư
5.2 DE NGHI
1 Tiếp tục nghiên cứu trên nhiều chất để khẳng định hiệu quả sứ dụng của
quy trình được để xuất
2 Áp dụng các phương pháp đã xây dựng sàng lọc một lượng lớn các hoạt
chất chiết xuất từ cây thuốc Việt Nam, từ đó xác định những hoạt chất kháng
phân bào mạnh để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn và có cơ sở đưa vào ứng dụng
~
Góp phần nâng cao hiểu biết và giá trị sử dụng của nguồn tài nguyên cây thuốc
Việt Nam
Trang 36TÀI LIZU THAM KHAO
Tiếng Việt
£1] DS Thi Phuong Hanh (1998), Pada lap vinblastin ne cay dia can Catharanthus roseus G Den (Apocynuceae), Ludo van tétnghiép cử nhân hóa học Đại học Khoa học Tự nhiền: Tp.HCM
[2] Đỗ Trung Đầm Thuốc chữa ung thư Nhà xuất bản Y học, 1995
[3] Đề Tất Lợi (1999 3, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học
(41 Ngô Đằng Phong, Huỳnh Thị Thùy Trang, Nguyễn Duy Năng (1996), Hướng dẫn sử
đụng phần mẫm MISTATC trong phương pháp thí nghiệm nông nghiệp, Đại học Nông lâm Tp.HCM
{5] Võ Hưng Sen (1995), CO Lap plumbagin w ré cay bach hoa xa Plumbago zeylanica kừm họ Phúnbasinaceae, Luận văn tốt nghiệp cử nhân hóa học Đại học Khoa học Tu nhiên Tp.HCM
[6] Tran Đệ Thăng (1995), Khảo sát chất gossypol cô lập từ hội cây bông Gossypium
hirsutum ho Malvaceae, Luan vin tét nshiép ct nban héa hoc Dai hoc Khoa hoc Tự nhiên Tp.HCM
Tiếng Anh
[7j R€ Adlakba, CL Ashorn, D Chan, LA 2welling (1989), “Moduiauon o£ 4'-(9- acridinylaminojmethanesulfon-m-anisidide-induced, topoisomerase ll-mediated DNA cleavage by sossypol”, Cancer research, Vol 49 (Issue §), 2052-2055 {8] K.V, Anis, G Kuuan, R Kutan (1999), “Role 6Ÿ berberin as an adjuvant response
modifier dung tumour therapy in mlce”, Phaưm Pharmacol Commum, 5, 697-
700
[9] Uma Devi, FE Solomon, A.C Sharada (1999), "Plumbagin, a plant naphtoguinon with antitumor and radiodifying properties”, Pharmaceutical biology, 3, 231-236 [10] Alan Doyle, J Bryan Griffiths (1998), Cefl and tissue culture: Laboratory
procedures in biotechnology, Wiley, England
(L1] V Elangovan, Nalini Ramamoorthy, S Balasubramanian, N Sekat, S
Govindasamy (1994), “Studies on the antiproliferative effect of some naturally occurring bioflavonaidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma-[80 cell lines”, Indian journal of pharmacology, 26, 266-269 (12] Michael Hinz Daniel Krappmann, Alexandra Eichten, Andreas Heder, Claus
Scheidereit Michael Strauss (1999), “NF-,.B function in growth control regulation of cyclin D) expression and GofG)-to-S-phase transition”, Molecular and Cellular Biology vol 19 (No.4), 2690-2698
(13] Deborah T Hung, Jie Chen, Suaart L Schreider (1996), “(+) ~ discoderraolide binds iles in stoichiometric ratio to tubulin dimers, blocks taxol binding and
to microtu
result in mito arrest’, Chemistry and Biology 3, 287-293
(14] WD Jarvis AJ Turner, LF Povirk, RS Traylor, S Grant (1994), “Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death in HL-60 human prorayelocytic leukemia cells by pharmacological! inhibitors of protein kinase C”, Cancer research, vol 34 (issue 7) 1707-1714
Trang 37(15] A Josephrajkumar, B Subrahmanyam (2002), TDNA synthesis in the imaginal wing
dises of the American bollworm Helicoverpa arnigera (Hubner) ”, J Biosci, vol 27
(No.2)
[16] Kyu Won Kim, Young Tae Bae, Nam Deuk Kim (1999), “A novel ursodeoxycholic acid derivative induces apoptosis in human MCF-7 breast cancer cells in vitro”,
Pharm Pharmacol Commun, 5, 701-703
[17] Keyong Ho Lee, Jeong Hwan Kim, Dae Seog Lim, Chang Han Kim (2000), “Anti-
leukaemic and anti-mutagenic effects of di(2-ethylhexyl)phthalate isolated from
Aloe vera Linne”, J, Pharm Pharmacol, 52, 593-598
[18] Keyong Ho Lee, Hee Sun Hong, Chi ho Lee, Chang Han Kim (2000), "Induction of
apoptosis in human leukaemic cell lines K562, HL60 and U937 by
diethylhexylphthalate isolated from Aloe vera Linne”, J Pharm Pharmacol, 52, 1037-1041
[19] Xin Lin, Wen Kui Li, Pei Gen Xiao (1999), "Effect of icariside Il from Epimedium
Koreanwm on tumour cell lines in vitro”, Pharm Pharmacol Commun., 5, 701-703
[20] Raymond W Ruddon (1995), Cancer biology, Oxford University Press, New York
[21] William D Stansfield, Jam S Colomé, Raul J Cano (1996), Theory and problems
of molecular and cell biology, Mc Gram — Hill
[22] Y Wang, PN Rao (1984), “Effects of gossypo! on DNA synthesis and cell cycle progression of mammialia cells in vitro”, Cancer research, vol 44 (issue 1), 35-38 [23] Watson, Hopkins, Roberts, Steitz, Weiner (1987), Molaculer biology of the gene, vol
2, The Benjamin/Cummings publishing company, California
[24] WHO/EPI/CDS/POLI0/90.1, Information on the origin of cell lines RD and HEp2