Biển và đại dương thế giới chiếm 71% diện tích bề mặt trái đất, đồng thời là nơi chiếm đến trên 90% thể tích khu vực sinh sống của trái đất. Với khoảng 300.000 loài động thực vật như rong biển, ruột khoang, hải miên, thân mềm, các loài vi khuẩn biển…sinh sống. Ngoài vai trò to lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm, những sản phẩm của đại dương cũng bước đầu được nghiên cứu và sử dụng trong ngành công nghiệp dược. Trong nhiều năm gần đây, các hoạt chất từ thiên nhiên đã dần dần được phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học. Rất nhiều thuốc mới có nguồn gốc sinh vật biển đã có mặt trên thị trường do các hãng dược lớn trên thế giới cung cấp, như là: cytarabine, halaven… Việt Nam là quốc gia có bờ biển dài hơn 3.260 km chạy dọc từ Bắc vào Nam, hàng nghìn hòn đảo ven biển, đặc biệt có hai quần đảo Trường Sa và Hoàng Sa nằm giữa biển Đông. Điều kiện địa lý đó đã đem lại nhiều thuận lợi, tiềm năng về nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú cho đất nước, tạo nên hệ sinh vật biển vô cùng phong phú, dồi dào cả về trữ lượng và thành phần loài. Với khoảng 12.000 loài bao gồm 2.038 loài cá, 6.000 loài động vật đáy, 635 loài rong biển và hàng ngàn loài động thực vật phù du... Tuy vậy ở Việt Nam, nguồn tài nguyên phong phú này mới bắt đầu thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học. Nhưng cho đến nay cũng chưa có nhiều công trình liên quan được công bố. Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển nói chung, các loài hải miên nói riêng đang là vấn đề quan tâm hiện nay. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới đã chỉ ra các loài hải miên có cấu trúc hóa học đa dạng và phong phú, nhiều hợp chất đã được phát hiện có hoạt tính sinh học lí thú. Xuất phát từ điểm đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính diệt tế bào ung thư của hai loài hải miên Dysidea fragilis và Haliclona oculata”. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của loài hải miên Dysidea fragilis và Haliclona oculata. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm một số chất có hoạt tính, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. 2 Nội dung của luận án bao gồm: Nghiên cứu phân lập các hợp chất từ loài hải miên Dysidea fragilis và Haliclona oculata của Việt Nam. Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập được nhằm định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA HAI LOÀI HẢI MIÊN DYSIDEA FRAGILIS VÀ HALICLONA OCULATA LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội – 2017 iii MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung hải miên 1.2 Tình hình nghiên cứu loài hải miên thuộc giống Dysidea 1.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học loài hải miên thuộc giống Dysidea 1.2.1.1 Các hợp chất sesquiterpene 1.2.1.2 Các hợp chất diterpene sesterterpene .12 1.2.1.3 Các hợp chất chứa halogen 15 1.2.1.4 Các hợp chất peptide alkaloid .17 1.2.1.5 Các hợp chất sterol 21 1.2.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học loài hải miên thuộc giống Dysidea 23 1.2.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào 23 1.2.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm .26 1.2.2.3 Hoạt tính kháng viêm 28 1.2.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa .28 1.2.2.5 Hoạt tính chống bệnh tiểu đường 29 1.2.2.6 Hoạt tính ức chế enzyme: Na+/K+-ATPase, PLA2, ICL 29 1.3 Tình hình nghiên cứu loài hải miên thuộc giống Haliclona .30 1.3.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học loài hải miên thuộc giống Haliclona .30 1.3.1.1 Các hợp chất terpene 31 1.3.1.2 Các hợp chất alkaloid 33 iv 1.3.1.3 Các hợp chất có chứa mạch dài 35 1.3.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học loài hải miên thuộc giống Haliclona .36 1.4 Tình hình nghiên cứu loài hải miên Việt Nam .38 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 42 2.1 Đối tượng nghiên cứu 42 2.1.1 Loài hải miên Dysidea fragilis 42 2.1.2 Loài hải miên Haliclona oculata .42 2.2 Phương pháp nghiên cứu .43 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất 43 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất .43 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 44 2.3 Phân lập hợp chất 45 2.3.1 Phương pháp chung chiết xuất 45 2.3.2 Phân lập hợp chất từ loài hải miên Dysidea fragilis 45 2.3.3 Phân lập hợp chất từ loài hải miên Haliclona oculata 47 2.4 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất 49 2.4.1 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ loài hải miên Dysidea fragilis 49 2.4.1.1 Hợp chất 1: Dysinidine I (chất mới) 49 2.4.1.2 Hợp chất 2: Dysinidine II (chất mới) 49 2.4.1.3 Hợp chất 3: Dysinidine III (chất mới) 50 2.4.1.4 Hợp chất 4: Dysinidin A (chất mới) 50 2.4.1.5 Hợp chất 5: Dysinidin B (chất mới) 50 2.4.1.6 Hợp chất 6: Dysinidin C (chất mới) 50 2.4.1.7 Hợp chất 7: Dysinidin D (chất mới) 50 2.4.1.8 Hợp chất 8: Dysinidin E (chất mới) 51 2.4.1.9 Hợp chất 9: Furodysinin lactone 51 2.4.1.10 Hợp chất 10: O-methyl-furodysinin lactone .51 v 2.4.1.11 Hợp chất 11: O-methyl-6-oxofurodysinin lactone 51 2.4.1.12 Hợp chất 12: Dysideasterol F 52 2.4.1.13 Hợp chất 13: 9α,11α-epoxycholest-7-en-3β,5α,6α-triol 52 2.4.1.14 Hợp chất 14: 9α, 11α-epoxycholest-7-en-3β, 5α, 6α, 19-tetrol 6-acetate ……………………………………………………………………………… 52 2.4.1.15 Hợp chất 15: 5,8-epidioxycholest-6-en-3-ol .52 2.4.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ loài hải miên Haliclona oculata 52 2.4.2.1 Hợp chất 16: 3β-Hydroxy-5-cholenic acid methyl ester .52 2.4.2.2 Hợp chất 17: Stigmasta-5,24(28)-dien-3β,29-diol 53 2.4.2.3 Hợp chất 18: 24-Methylenecholest-4-en-3β,6β-diol 53 2.4.2.4 Hợp chất 19: Cholest-5-en-3β,7β-diol 53 2.4.2.5 Hợp chất 20: Xestospongiene J 53 2.4.2.6 Hợp chất 21: Xestospongiene A 53 2.5 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 54 2.6 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất 55 2.6.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ loài hải miên Dysidea fragilis 55 2.6.2 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ loài hải miên Haliclona oculata .56 CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 59 3.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài hải miên Dysidea fragilis 59 3.1.1 Hợp chất 1: Dysinidine I (chất mới) 59 3.1.2 Hợp chất 2: Dysinidine II (chất mới) 64 3.1.3 Hợp chất 3: Dysinidine III (chất mới) .69 3.1.4 Hợp chất 4: Dysinidin A (chất mới) 72 3.1.5 Hợp chất 5: Dysinidin B (chất mới) 74 3.1.6 Hợp chất 6: Dysinidin C (chất mới) 76 3.1.7 Hợp chất 7: Dysinidin D (chất mới) 79 3.1.8 Hợp chất 8: Dysinidin E (chất mới) 81 vi 3.1.9 Hợp chất 9: Furodysinin lactone .83 3.1.10 Hợp chất 10: O-methyl furodysinin lactone 85 3.1.11 Hợp chất 11: O-methyl-6-oxofurodysinin lactone 86 3.1.12 Hợp chất 12: Dysideasterol F 88 3.1.13 Hợp chất 13: 9α, 11α-epoxycholest-7-en-3β,5α,6α-triol 91 3.1.14 Hợp chất 14: 9α,11α-epoxycholest-7-en-3β,5α,6α,19-tetrol 6-acetate 93 3.1.15 Hợp chất 15: 5,8-epidioxycholest-6-en-3-ol 96 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài hải miên Haliclona oculata .100 3.2.1 Hợp chất 16: 3β-Hydroxy-5-cholenic acid methyl ester 100 3.2.2 Hợp chất 17: Stigmasta-5,24(28)-dien-3β,29-diol 102 3.2.3 Hợp chất 18: 24-Methylenecholest-4-en-3β,6β-diol .104 3.2.4 Hợp chất 19: Cholest-5-en-3β,7β-diol .106 3.2.5 Hợp chất 20: Xestospongiene J .108 3.2.6 Hợp chất 21: Xestospongiene A 110 3.3 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ loài hải miên Dysidea fragilis 112 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ loài hải miên Haliclona oculata 112 KẾT LUẬN 114 KIẾN NGHỊ 116 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO 118 PHỤ LỤC 132 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu 13 C-NMR H-NMR 3T3 A-431 A-549 B16F10 COSY DEPT DMEM Tiếng Anh Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Normal cell Human epidemoid carcinoma Human lung carcinoma Melanoma H-1H- Correlation Spectroscopy Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO DNA DPPH E39 ESI-MS Dimethylsulfoxide Deoxyribo Nucleic Axit 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl Renal carcinoma Electron Spray Ionization Mass Spectra FBS Fetal bovine serum H4IIE Rat hepatoma HCT-116 Colon carcinoma HeLa HeLa cell HepG2 Hepatocellular carcinoma HL-60 Human promyelocytic leukemia HMBC Heteronuclear Mutiple Bond Connectivity HR-ESI-MS High Resolution Electronspray Ionization Mass Spectrum HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence HT-29 Colon carcinoma IC50 Inhibitory concentration at 50% ICL J774 KB LD50 LNCaP Isocitratelyase Murine macrophages Human epidemoid carcinoma Lethal Dose 50 Human prostatic carcinoma LU-1 MCF-7 Human lung carcinoma Human breast carcinoma Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Tế bào thường Ung thư biểu mô người Ung thư phổi người Ung thư da Phổ COSY Phổ DEPT Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (CH3)2SO Ung thư biểu mô thận Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Huyết bò Ung thư gan chuột Ung thư ruột kết Tế bào ung thư cổ tử cung Ung thư biểu mô gan Ung thư máu Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Ung thư ruột kết Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Ung thư đại thực bào chuột Ung thư biểu mô người Liều độc cấp tính Ung thư tuyến tiền liệt người Ung thư phổi người Ung thư vú người viii MDA-MB231 MEL-28 MIC NBT-T2 NCI-H929 NF-B NOESY P-388 QGY-7703 SK-Hep1 SK-MEL2 SK-OV-3 SRB TBUT TLC TMS WEHI-164 Metastatic breast cancer Ung thư vú Melanoma Minimum Inhibitory Concentration Bladder epithelial Myeloma Nuclear Factor-kappa B Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy Lymphocytic leukemia Hepatoma Hepatoma Melanoma Ovarian Sulforhodamine B Ung thư da Nồng độ ức chế tối thiểu Ung thư biểu mô bàng quang Bệnh u tủy Yếu tố nhân kappa B Phổ NOESY Thin layer chromatography Tetramethylsilane Murine fibrosarcoma Ung thư máu lympho Ung thư gan Ung thư gan Ung tư da Ung thư buồng trứng Tế bào ung thư Sắc ký lớp mỏng (CH3)4Si Sarcoma xơ chuột ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất sesquiterpene từ giống Dysidea Bảng 1.2 Các hợp chất diterpene sesterterpene từ giống Dysidea 12 Bảng 1.3 Các hợp chất chứa halogen từ giống Dysidea 15 Bảng 1.4 Các hợp chất peptide alkaloid từ giống Dysidea 17 Bảng 1.5 Các hợp chất sterol từ giống Dysidea 21 Bảng 1.6 Các hợp chất terpene từ giống Haliclona 31 Bảng 1.7 Các hợp chất alkaloid từ giống Haliclona 33 Bảng 1.8 Các hợp chất có chứa mạch dài từ giống Haliclona 36 Bảng 2.1 % Ức chế phát triển tế bào ung thư hợp chất 1-6, 8-11, 13 14 nồng độ 100 µg/mL 55 Bảng 2.2 % Ức chế phát triển tế bào ung thư hợp chất 1-6, 8-11, 13 14 nồng độ 100 µg/mL (tiếp) 55 Bảng 2.3 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất 3, 11, 13 14 56 Bảng 2.4 % Ức chế phát triển tế bào ung thư hợp chất 16-21 57 nồng độ 100 µg/mL 57 Bảng 2.5 % Ức chế phát triển tế bào ung thư hợp chất 16-21 57 nồng độ 100 µg/mL (tiếp) 57 Bảng 2.6 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất 16, 17 19-21 58 Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất hợp chất tham khảo 62 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất hợp chất tham khảo 66 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR hợp chất hợp chất tham khảo 70 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR hợp chất hợp chất tham khảo 73 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR hợp chất hợp chất tham khảo 75 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR hợp chất hợp chất tham khảo 77 Bảng 3.7 Số liệu phổ NMR hợp chất hợp chất tham khảo 10 79 Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR hợp chất 82 Bảng 3.9 Số liệu phổ NMR hợp chất tham khảo 84 Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR 10 hợp chất tham khảo 85 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR hợp chất hợp chất 11 hợp chất tham khảo 87 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR hợp chất 12 hợp chất tham khảo 88 x Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR hợp chất 13 hợp chất tham khảo 92 Bảng 3.14 Số liệu phổ NMR hợp chất 14 hợp chất tham khảo 94 Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR hợp chất 15 hợp chất tham khảo 97 Bảng 3.16 Số liệu phổ NMR hợp chất 16 100 Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR hợp chất 17 hợp chất tham khảo 102 Bảng 3.18 Số liệu phổ NMR hợp chất 18 hợp chất tham khảo 104 Bảng 3.19 Số liệu phổ NMR hợp chất 19 hợp chất tham khảo 107 Bảng 3.20 Số liệu phổ NMR hợp chất 20 hợp chất tham khảo 109 Bảng 3.21 Số liệu phổ NMR hợp chất 21 hợp chất tham khảo 110 xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh loài hải miên Hình 2.1 Hải miên Dysidea fragilis 42 Hình 2.2 Hải miên Haliclona oculata 42 Hình 2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài hải miên Dysidea fragilis 46 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài Haliclona oculata 48 Hình 3.1 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 59 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất 59 Hình 3.3 Phổ 13C-NMR của hợp chất 60 Hình 3.4 Phổ HSQC của hợp chất 60 Hình 3.5 Phổ HMBC của hợp chất 61 Hình 3.6 Phổ COSY của hợp chất 61 Hình 3.7 Phổ NOESY của hợp chất 62 Hình 3.8 Các tương tác HMBC, COSY NOESY của hợp chất 63 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất hợp chất tham khảo 1a 63 Hình 3.10 Phổ HR-ESI-MS hợp chất 64 Hình 3.11 Phổ 1H-NMR hợp chất 64 Hình 3.12 Phổ 13C-NMR hợp chất 65 Hình 3.13 Phổ DEPT hợp chất 65 Hình 3.14 Phổ HSQC hợp chất 67 Hình 3.15 Phổ HMBC hợp chất 67 Hình 3.16 Phổ COSY hợp chất 68 Hình 3.17 Phổ NOESY hợp chất 68 Hình 3.18 Các tương tác HMBC, COSY NOESY hợp chất 69 Hình 3.19 Cấu trúc hóa học hợp chất hợp chất tham khảo 1a 69 Hình 3.20 Các tương tác HMBC, COSY NOESY hợp chất 71 Hình 3.21 Cấu trúc hóa học hợp chất hợp chất tham khảo 10 71 Hình 3.22 Các tương tác HMBC, COSY NOESY hợp chất 72 Hình 3.23 Cấu trúc hóa học hợp chất hợp chất tham khảo 74 Hình 3.24 Các tương tác HMBC, COSY NOESY hợp chất 76 Hình 3.25 Cấu trúc hóa học hợp chất hợp chất tham khảo 76 lxxviii PHỤ LỤC HỢP CHẤT 18 Công thức phân tử: C28H46O2 Khối lượng phân tử: 414 - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR - Phổ DEPT - Phổ HSQC - Phổ HMBC lxxix Phổ 1H-NMR hợp chất 18 Phổ 13C-NMR hợp chất 18 lxxx Phổ DEPT hợp chất 18 Phổ HSQC hợp chất 18 lxxxi Phổ HMBC hợp chất 18 lxxxii PHỤ LỤC HỢP CHẤT 19 Công thức phân tử: C27H46O2 Khối lượng phân tử: 402 - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR - Phổ DEPT lxxxiii Phổ 1H-NMR hợp chất 19 Phổ 13C-NMR hợp chất 19 lxxxiv Phổ DEPT hợp chất 19 lxxxv PHỤ LỤC HỢP CHẤT 20 Công thức phân tử: C14H20Br2O3 Khối lượng phân tử: 396 - Phổ ESI-MS - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR - Phổ DEPT - Phổ HSQC - Phổ HMBC lxxxvi Phổ ESI-MS hợp chất 20 Phổ 1H-NMR hợp chất 20 lxxxvii Phổ 13C-NMR hợp chất 20 Phổ DEPT hợp chất 20 lxxxviii Phổ HSQC hợp chất 20 Phổ HMBC hợp chất 20 lxxxix PHỤ LỤC HỢP CHẤT 21 Công thức phân tử: C14H20Br2O3 Khối lượng phân tử: 396 - Phổ ESI-MS - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR - Phổ DEPT - Phổ HSQC - Phổ HMBC xc Phổ ESI-MS hợp chất 21 Phổ 1H-NMR hợp chất 21 xci Phổ 13C-NMR hợp chất 21 Phổ DEPT hợp chất 21 xcii Phổ HSQC hợp chất 21 Phổ HMBC hợp chất 21 ... Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính diệt tế bào ung thư hai loài hải miên Dysidea fragilis Haliclona oculata Mục tiêu luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chủ yếu loài hải miên. .. hình nghiên cứu loài hải miên thuộc giống Dysidea 1.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học loài hải miên thuộc giống Dysidea Theo thống kê tài liệu, đã có khoảng 16 loài hải miên thuộc giống Dysidea. .. có tế bào chưa biệt hóa chuyển thành dạng tế bào chuyên biệt khác loài hải miên có số tế bào đã biệt hóa mà chuyển thành dạng tế bào khác Hải miên hệ thần kinh, hệ tiêu hóa hệ tuần hoàn Thay vào