Nghiên cứu thành phần hóa học cây màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và màn màn hoa vàng (Cleome vicosa L.)

MỞ ĐẦU Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo Phạm Hoàng Hộ, thực vật Việt Nam khoảng 12.000 loài cây có mạch, không kể rong, rêu và nấm [6] . Số loài cây thuốc đã thống kê được ở Việt Nam là 3948 loài thuộc 307 họ thực vật và nấm, chiếm 37,6 % số loài trong tự nhiên. Thông qua việc khảo sát các đặc điểm hóa thực vật, dược tính… của cây thuốc, chúng ta có thể từng bước lý giải thích việc trị bệnh của thảo dược, đồng thời tiêu chuẩn hoá các bài thuốc cổ truyền nhằm sử dụng một cách hợp lý, có hiệu quả đồng thời góp phần bảo tồn cây thuốc dân tộc. Chính vì vậy, việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên định hướng vào hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng. Màn màn hoa tím ( Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.) mọc hoang khắp Việt Nam. Trong dân gian, Màn màn hoa tím được dùng chữa các chứng cảm cúm nóng lạnh, nhức đầu, ho hen, và chữa cả rắn cắn, lá dùng chữa viêm đau thận. Toàn cây Màn màn hoa vàng nấu nước xông chữa nhức đầu. Rễ có tính kích thích và chống bệnh hoại huyết, bệnh chảy máu chân răng. Quả non ăn kích thích tiêu hoá. Hạt làm thuốc xoa bóp chữa tê thấp và cũng dùng trị giun. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu phục vụ y học nhưng đa số chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát hoạt tính sinh học của các dịch chiết, và rất ít công trình nghiên cứu chi tiết về thành phần hóa học của các hợp chất có trong hai loài này. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học hai loài Màn màn hoa tím ( Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.), xác định hoạt tính sinh học hoạt chất phân lập cũng như cao chiết làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng dược liệu hoặc phát hiện ra những hoạt tính mới, góp phần nâng cao giá trị loại dược liệu này tại Việt Nam. Luận án giới thiệu kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome vicosa L.). Nội dung chính của luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất tinh khiết từ hai loài Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được. 3. Thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết và các hợp chất phân lập được.

Trang 1

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

PHAN NHẬT MINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY MÀN MÀN HOA TÍM (Cleome chelidonii L.f.)

VÀ MÀN MÀN HOA VÀNG (Cleome viscosa L.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Tp Hồ Chí Minh – 2016

Trang 2

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan chi Màn màn 2

1.2 Mô tả thực vật 3

1.2.1 Màn màn hoa tím 3

1.2.2 Màn màn hoa vàng 3

1.3 Vùng phân bố 4

1.4 Thành phần hóa học 4

1.5 Những nghiên cứu về dược tính 9

1.6 Bệnh gan và thuốc bảo vệ gan 13

1.7 Dòng tế bào HepG2 13

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 15

2.1 Mẫu thực vật 15

2.2 Hóa chất và thiết bị 15

2.2.1 Hóa chất 15

2.2.2 Thiết bị 15

2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 16

2.3.1 Khảo sát khả năng gây độc tế bào in vitro bằng phương pháp MTT 16

2.3.2 Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan trên dòng tế bào HepG2 17

2.4 Phân lập các hợp chất 18

2.4.1 Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa tím 18

2.4.2 Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa tím 18

2.4.3 Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa vàng 20

2.4.4 Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa vàng 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 22

3.1 Cấu trúc các hợp chất phân lập được 22

3.1.1 Hợp chất 1: Quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranoside 22

3.1.2 Hợp chất 2: Quercitrin 24

3.1.3 Hợp chất 3: Isoquercitrin 25

3.1.4 Hợp chất 4: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside 26

Trang 3

3.1.5 Hợp chất 5:Quercetin-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L

-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside 28

3.1.6 Hợp chất 6: Cleomeside A (Mới) 31

3.1.7 Hợp chất 7: Quercetin-3-O-[2"-O-(6'''-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranosyl]-α-L -rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside 33

3.1.8 Hợp chất 8: Cleomeside B (Mới) 35

3.1.9 Hợp chất 9: Visconoside A (Mới) 38

3.1.10 Hợp chất 10: Visconoside B (Mới) 40

3.1.11 Hợp chất 11: Kaempferol-3-O-methylether 43

3.1.12 Hợp chất 12: Kaempferol-3,4'-O-dimethylether 45

3.1.13 Hợp chất 13: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside 46

3.1.14 Hợp chất 14: Kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranoside 47

3.1.15 Hợp chất 15: Kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranoside) 49

3.1.16 Hợp chất 16: Kaempferol-3-O-(2,4-O-diacetyl-α-L-rhamnopyranoside) 51

3.1.17 Hợp chất 17: Kaempferol-3,7-O-α-L-dirhamnopyranoside 53

3.1.18 Hợp chất 18:Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside 54

3.1.19 Hợp chất 19:Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside56 3.1.20 Hợp chất 20: Cleomeside C (Mới) 58

3.1.21 Hợp chất 21: Glycerol monostearate 61

3.1.22 Hợp chất 22: Ethyl α-galactopyranoside 63

3.1.23 Hợp chất 23: Adenine 64

3.1.24 Hợp chất 24: 5-(Hydroxymethyl)-2-furaldehyde 65

3.1.25 Hợp chất 25: Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside 66

3.2 Khảo sát khả năng gây độc tế bào và tác dụng bảo vệ tế bào gan 68

3.3 Nhận xét chung 74

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

KẾT LUẬN 77

KIẾN NGHỊ 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 89

Trang 4

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Danh mục các loài có giá trị trong họ Màn màn ở Việt Nam 2

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 1 23

Bảng 3.26: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết từ Màn màn hoa tím trên dòng tế bào HepG2 69

Bảng 3.27: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết từ Màn màn hoa vàng trên dòng tế bào HepG2 70

Bảng 3.28: Khả năng gây độc tế bào của các hợp chất trên dòng tế bào HepG2 71

Bảng 3.29: Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do CCl4 2 mM gây ra sau 24 giờ của các chất phân lập từ cao MeOH lá/thân Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng 72

Trang 5

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH

Trang

Sơ đồ 1: Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa tím 18

Sơ đồ 2: Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa tím 19

Sơ đồ 3: Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa vàng 20

Sơ đồ 4: Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa vàng 21

Hình 2.1: Màn màn hoa tím 15

Hình 2.2: Màn màn hoa vàng 15

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học hợp chất 1 22

Trang 6

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 1 PL-1 Phụ lục 1b: Phổ 1H-NMR hợp chất 1 PL-1 Phụ lục 1c: Phổ 13C-NMR hợp chất 1 PL-2 Phụ lục 1d: Phổ DEPT hợp chất 1 PL-2 Phụ lục 1e: Phổ HSQC hợp chất 1 PL-3 Phụ lục 1f: Phổ HMBC hợp chất 1 PL-3 Phụ lục 1g: Phổ COSY hợp chất 1 PL-4 Phụ lục 2a: Phổ 1H-NMR hợp chất 2 PL-4 Phụ lục 2b: Phổ 13C-NMR hợp chất 2 PL-5 Phụ lục 2c: Phổ DEPT hợp chất 2 PL-5 Phụ lục 2d: Phổ HSQC hợp chất 2 PL-6 Phụ lục 2e: Phổ HMBC hợp chất 2 PL-6 Phụ lục 3a: Phổ 1H-NMR hợp chất 3 PL-7 Phụ lục 3b: Phổ 13C-NMR hợp chất 3 PL-7 Phụ lục 3c: Phổ DEPT hợp chất 3 PL-8 Phụ lục 3d: Phổ HSQC hợp chất 3 PL-8 Phụ lục 3e: Phổ HMBC hợp chất 3 PL-9 Phụ lục 4a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 4 PL-9 Phụ lục 4b: Phổ 1H-NMR hợp chất 4 PL-10 Phụ lục 4c: Phổ 13C-NMR hợp chất 4 PL-10 Phụ lục 4d: Phổ DEPT hợp chất 4 PL-11 Phụ lục 4e: Phổ HSQC hợp chất 4 PL-11 Phụ lục 4f: Phổ HMBC hợp chất 4 PL-12 Phụ lục 4g: Phổ COSY hợp chất 4 PL-12 Phụ lục 5a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 5 PL-13 Phụ lục 5b: Phổ 1H-NMR hợp chất 5 PL-13 Phụ lục 5c: Phổ 13C-NMR hợp chất 5 PL-14 Phụ lục 5d: Phổ DEPT hợp chất 5 PL-14 Phụ lục 5e: Phổ HSQC hợp chất 5 PL-15 Phụ lục 5f: Phổ HMBC hợp chất 5 PL-15 Phụ lục 5g: Phổ COSY hợp chất 5 PL-16 Phụ lục 6a: Phổ UV-Vis hợp chất 6 PL-16 Phụ lục 6b: Phổ IR hợp chất 6 PL-17 Phụ lục 6c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 6 PL-17 Phụ lục 6d: Phổ 1H-NMR hợp chất 6 PL-17 Phụ lục 6e: Phổ 13C-NMR hợp chất 6 PL-18 Phụ lục 6f: Phổ DEPT hợp chất 6 PL-18 Phụ lục 6g: Phổ HSQC hợp chất 6 PL-19 Phụ lục 6h: Phổ HMBC hợp chất 6 PL-19 Phụ lục 6i: Phổ COSY hợp chất 6 PL-20

Trang 7

Phụ lục 7a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 7 PL-20 Phụ lục 7b: Phổ 1H-NMR hợp chất 7 PL-21 Phụ lục 7c: Phổ 13C-NMR hợp chất 7 PL-21 Phụ lục 7d: Phổ DEPT hợp chất 7 PL-22 Phụ lục 7e: Phổ HSQC hợp chất 7 PL-22 Phụ lục 7f: Phổ HMBC hợp chất 7 PL-23 Phụ lục 7g: Phổ COSY hợp chất 7 PL-23 Phụ lục 8a: Phổ UV-Vis hợp chất 8 PL-24 Phụ lục 8b: Phổ IR hợp chất 8 PL-24 Phụ lục 8c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 8 PL-24 Phụ lục 8d: Phổ 1H-NMR hợp chất 8 PL-25 Phụ lục 8e: Phổ 13C-NMR hợp chất 8 PL-25 Phụ lục 8f: Phổ DEPT hợp chất 8 PL-26 Phụ lục 8g: Phổ HSQC hợp chất 8 PL-26 Phụ lục 8h: Phổ HMBC hợp chất 8 PL-27 Phụ lục 8i: Phổ COSY hợp chất 8 PL-27 Phụ lục 9a: Phổ UV-Vis hợp chất 9 PL-28 Phụ lục 9b: Phổ IR hợp chất 9 PL-28 Phụ lục 9c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 9 PL-28 Phụ lục 9d: Phổ 1H-NMR hợp chất 9 PL-29 Phụ lục 9e: Phổ 13C-NMR hợp chất 9 PL-29 Phụ lục 9f: Phổ DEPT hợp chất 9 PL-30 Phụ lục 9g: Phổ HSQC hợp chất 9 PL-30 Phụ lục 9h: Phổ HMBC hợp chất 9 PL-31 Phụ lục 9i: Phổ COSY hợp chất 9 PL-31 Phụ lục 10a: Phổ UV-Vis hợp chất 10 PL-32 Phụ lục 10b: Phổ IR hợp chất 10 PL-32 Phụ lục 10c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 10 PL-32 Phụ lục 10d: Phổ 1H-NMR hợp chất 10 PL-33 Phụ lục 10e: Phổ 13C-NMR hợp chất 10 PL-33 Phụ lục 10f: Phổ DEPT hợp chất 10 PL-34 Phụ lục 10g: Phổ HSQC hợp chất 10 PL-34 Phụ lục 10h: Phổ HMBC hợp chất 10 PL-35 Phụ lục 10i: Phổ COSY hợp chất 10 PL-35 Phụ lục 11a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 11 PL-36 Phụ lục 11b: Phổ 1H-NMR hợp chất 11 PL-36 Phụ lục 11c: Phổ 13C-NMR hợp chất 11 PL-37 Phụ lục 11d: Phổ DEPT hợp chất 11 PL-37 Phụ lục 11e: Phổ HSQC hợp chất 11 PL-38 Phụ lục 11f: Phổ HMBC hợp chất 11 PL-38 Phụ lục 12a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 12 PL-39

Trang 8

Phụ lục 12b: Phổ 1H-NMR hợp chất 12 PL-39 Phụ lục 12c: Phổ 13C-NMR hợp chất 12 PL-40 Phụ lục 12d: Phổ DEPT hợp chất 12 PL-40 Phụ lục 12e: Phổ HSQC hợp chất 12 PL-41 Phụ lục 12f: Phổ HMBC hợp chất 12 PL-41 Phụ lục 13a: Phổ 1H-NMR hợp chất 13 PL-42 Phụ lục 13b: Phổ 13C-NMR hợp chất 13 PL-42 Phụ lục 13c: Phổ DEPT hợp chất 13 PL-43 Phụ lục 13d: Phổ HSQC hợp chất 13 PL-43 Phụ lục 13e: Phổ HMBC hợp chất 13 PL-44 Phụ lục 14a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 14 PL-44 Phụ lục 14b: Phổ 1H-NMR hợp chất 14 PL-45 Phụ lục 14c: Phổ 13C-NMR hợp chất 14 PL-45 Phụ lục 14d: Phổ DEPT hợp chất 14 PL-46 Phụ lục 14e: Phổ HSQC hợp chất 14 PL-46 Phụ lục 14f: Phổ HMBC hợp chất 14 PL-47 Phụ lục 14g: Phổ COSY hợp chất 14 PL-47 Phụ lục 15a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 15 PL-48 Phụ lục 15b: Phổ 1H-NMR hợp chất 15 PL-48 Phụ lục 15c: Phổ 13C-NMR hợp chất 15 PL-49 Phụ lục 15d: Phổ DEPT hợp chất 15 PL-49 Phụ lục 15e: Phổ HSQC hợp chất 15 PL-50 Phụ lục 15f: Phổ HMBC hợp chất 15 PL-50 Phụ lục 16a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 16 PL-51 Phụ lục 16b: Phổ 1H-NMR hợp chất 16 PL-51 Phụ lục 16c: Phổ 13C-NMR hợp chất 16 PL-52 Phụ lục 16d: Phổ DEPT hợp chất 16 PL-52 Phụ lục 16e: Phổ HSQC hợp chất 16 PL-53 Phụ lục 16f: Phổ HMBC hợp chất 16 PL-53 Phụ lục 16g: Phổ COSY hợp chất 16 PL-54 Phụ lục 17a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 17 PL-54 Phụ lục 17b: Phổ 1H-NMR hợp chất 17 PL-55 Phụ lục 17c: Phổ 13C-NMR hợp chất 17 PL-55 Phụ lục 17d: Phổ DEPT hợp chất 17 PL-56 Phụ lục 17e: Phổ HSQC hợp chất 17 PL-56 Phụ lục 17f: Phổ HMBC hợp chất 17 PL-57 Phụ lục 17g: Phổ COSY hợp chất 17 PL-57 Phụ lục 18a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 18 PL-58 Phụ lục 18b: Phổ 1H-NMR hợp chất 18 PL-58 Phụ lục 18c: Phổ 13C-NMR hợp chất 18 PL-59 Phụ lục 18d: Phổ DEPT hợp chất 18 PL-59

Trang 9

Phụ lục 18e: Phổ HSQC hợp chất 18 PL-60 Phụ lục 18f: Phổ HMBC hợp chất 18 PL-60 Phụ lục 18g: Phổ COSY hợp chất 18 PL-61 Phụ lục 19a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 19 PL-61 Phụ lục 19b: Phổ 1H-NMR hợp chất 19 PL-62 Phụ lục 19c: Phổ 13C-NMR hợp chất 19 PL-62 Phụ lục 19d: Phổ DEPT hợp chất 19 PL-63 Phụ lục 19e: Phổ HSQC hợp chất 19 PL-63 Phụ lục 19f: Phổ HMBC hợp chất 19 PL-64 Phụ lục 19g: Phổ COSY hợp chất 19 PL-64 Phụ lục 20a: Phổ UV-Vis hợp chất 20 PL-65 Phụ lục 20b: Phổ IR hợp chất 20 PL-65 Phụ lục 20c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 20 PL-65 Phụ lục 20d: Phổ 1H-NMR hợp chất 20 PL-66 Phụ lục 20e: Phổ 13C-NMR hợp chất 20 PL-66 Phụ lục 20f: Phổ DEPT hợp chất 20 PL-67 Phụ lục 20g: Phổ HSQC hợp chất 20 PL-67 Phụ lục 20h: Phổ HMBC hợp chất 20 PL-68 Phụ lục 20i: Phổ COSY hợp chất 20 PL-68 Phụ lục 21a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 21 PL-69 Phụ lục 21b: Phổ 1H-NMR hợp chất 21 PL-69 Phụ lục 21c: Phổ 13C-NMR hợp chất 21 PL-70 Phụ lục 21d: Phổ DEPT hợp chất 21 PL-70 Phụ lục 21e: Phổ HSQC hợp chất 21 PL-71 Phụ lục 21f: Phổ HMBC hợp chất 21 PL-71 Phụ lục 22a: Phổ 1H-NMR hợp chất 22 PL-72 Phụ lục 22b: Phổ 13C-NMR hợp chất 22 PL-72 Phụ lục 22c: Phổ DEPT hợp chất 22 PL-73 Phụ lục 22d: Phổ HSQC hợp chất 22 PL-73 Phụ lục 22e: Phổ HMBC hợp chất 22 PL-74 Phụ lục 23a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 23 PL-74 Phụ lục 23b: Phổ 1H-NMR hợp chất 23 PL-75 Phụ lục 23c: Phổ 13C-NMR hợp chất 23 PL-75 Phụ lục 23d: Phổ HSQC hợp chất 23 PL-76 Phụ lục 23e: Phổ HMBC hợp chất 23 PL-76 Phụ lục 24a: Phổ 1H-NMR hợp chất 24 PL-77 Phụ lục 24b: Phổ 13C-NMR hợp chất 24 PL-77 Phụ lục 24c: Phổ DEPT hợp chất 24 PL-78 Phụ lục 24d: Phổ HSQC hợp chất 24 PL-78 Phụ lục 24e: Phổ HMBC hợp chất 24 PL-79 Phụ lục 25a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 25 PL-79

Trang 10

Phụ lục 25b: Phổ 1H-NMR hợp chất 25 PL-80 Phụ lục 25c: Phổ 13C-NMR hợp chất 25 PL-80 Phụ lục 25d: Phổ DEPT hợp chất 25 PL-81 Phụ lục 25e: Phổ HSQC hợp chất 25 PL-81 Phụ lục 25f: Phổ HMBC hợp chất 25 PL-82 Phụ lục 25g: Phổ COSY hợp chất 25 PL-82 Phụ lục 26a: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa tím trên tế bào HepG2 sau 24 giờ PL-83 Phụ lục 26b: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa tím trên tế bào HepG2 sau 48 giờ PL-83 Phụ lục 26c: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa tím trên tế bào HepG2 sau 72 giờ PL-84 Phụ lục 27a: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa tím trên tế bào HepG2 sau 24 giờ PL-84 Phụ lục 27b: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa tím trên tế bào HepG2 sau 48 giờ PL-85 Phụ lục 27c: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa tím trên tế bào HepG2 sau 72 giờ PL-85 Phụ lục 28a: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa vàng trên tế bào HepG2 sau 24 giờ PL-86 Phụ lục 28b: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa vàng trên tế bào HepG2 sau 48 giờ PL-86 Phụ lục 28c: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa vàng trên tế bào HepG2 sau 72 giờ PL-87 Phụ lục 29a: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa vàng trên

tế bào HepG2 sau 24 giờ PL-87 Phụ lục 29b: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa vàng trên

tế bào HepG2 sau 48 giờ PL-88 Phụ lục 29c: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa vàng trên

tế bào HepG2 sau 72 giờ PL-88 Phụ lục 30a: Khả năng gây độc tế bào của các hợp chất trên dòng tế bào HepG2 PL-89 Phụ lục 30b: Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do CCl4 2

mM gây ra sau 24 giờ của các chất phân lập từ cao MeOH lá/thân màn màn hoa tím và màn màn hoa vàng PL-89 Phụ lục 31a: Định danh tên khoa học cây Màn màn hoa tím PL-90 Phụ lục 31b: Định danh tên khoa học cây Màn màn hoa vàng PL-90

Phụ lục 32a: Kết quả tra Scifinder ngày 26/7/2013 hợp chất cleomeside A PL-91

Phụ lục 32b: Kết quả tra Scifinder ngày 26/12/2013 hợp chất cleomeside B PL-91 Phụ lục 32c: Kết quả tra Scifinder ngày 6/12/2014 hợp chất cleomeside C PL-91 Phụ lục 32d: Kết quả tra Scifinder ngày 7/4/2015 hợp chất visconoside A PL-92 Phụ lục 32e: Kết quả tra Scifinder ngày 28/5/2015 hợp chất visconoside B PL-92

Trang 11

MỞ ĐẦU

Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo Phạm Hoàng Hộ, thực vật Việt Nam khoảng 12.000 loài cây có mạch, không kể rong, rêu và nấm[6] Số loài cây thuốc đã thống kê được ở Việt Nam là 3948 loài thuộc 307 họ thực vật và nấm, chiếm 37,6 % số loài trong tự nhiên

Thông qua việc khảo sát các đặc điểm hóa thực vật, dược tính… của cây thuốc, chúng ta có thể từng bước lý giải thích việc trị bệnh của thảo dược, đồng thời tiêu chuẩn hoá các bài thuốc cổ truyền nhằm sử dụng một cách hợp lý, có hiệu quả đồng thời góp phần bảo tồn cây thuốc dân tộc Chính vì vậy, việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên định hướng vào hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng

Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa

L.) mọc hoang khắp Việt Nam Trong dân gian, Màn màn hoa tím được dùng chữa các chứng cảm cúm nóng lạnh, nhức đầu, ho hen, và chữa cả rắn cắn, lá dùng chữa viêm đau thận Toàn cây Màn màn hoa vàng nấu nước xông chữa nhức đầu Rễ có tính kích thích và chống bệnh hoại huyết, bệnh chảy máu chân răng Quả non ăn kích thích tiêu hoá Hạt làm thuốc xoa bóp chữa tê thấp và cũng dùng trị giun

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu phục vụ y học nhưng đa số chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát hoạt tính sinh học của các dịch chiết,

và rất ít công trình nghiên cứu chi tiết về thành phần hóa học của các hợp chất có trong hai loài này

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học hai loài Màn màn

hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.), xác định

hoạt tính sinh học hoạt chất phân lập cũng như cao chiết làm cơ sở khoa học cho việc

sử dụng dược liệu hoặc phát hiện ra những hoạt tính mới, góp phần nâng cao giá trị loại dược liệu này tại Việt Nam Luận án giới thiệu kết quả nghiên cứu về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.)

và Màn màn hoa vàng (Cleome vicosa L.)

Nội dung chính của luận án bao gồm:

1 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ hai loài Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

3 Thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết và các hợp chất phân lập được

Trang 12

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Màn màn

Họ Màn màn (Cleomaceae) phân bố khắp các vùng nhiệt đới và các vùng có khí hậu nóng ấm trên thế giới Tại Việt Nam có khoảng 55 loài và thứ, có ý nghĩa kinh tế về nhiều mặt như: Phần lớn các loài trong họ được sử dụng làm thuốc, làm thức ăn (rau

ăn, lấy quả) cho người và động vật, lấy gỗ, làm cảnh vì có hoa đẹp Bên cạnh đó, họ Màn màn còn có giá trị khoa học như được sử dụng nhiều trong nghiên cứu di truyền học, tế bào học…[7]

Bảng 1.1: Danh mục các loài có giá trị trong họ Màn màn ở Việt Nam

STT Tên khoa học Tên Việt Nam LT TP LG LC CDK

1 Capparis flavicans Kurz Cáp vàng X X X

3 Capparis khuamak Gagnep Bạch hoa X

4 Capparis micracantha DC Cáp gai nhỏ X X

5 Capparis pyrifolia Lamk Cáp lá xá lị X X

6 Capparis sepiaria L Cáp hàng rào X

7 Capparis siamensis Kurz Cáp xiêm X

8 Capparis sikkimensis Kurz Bạch hoa X X

9 Capparis thorelii var pranensis Gagnep Dây độc mộc ô X

10 Capparis tonkinensis Gagnep Cáp bắc bộ X

13 Cleome chelidonii L.f Màn màn hoa tím X

Trang 13

20 Crateva roxburghii R Br Mấm núi X X X

21 Crateva unilocularis Buch-Ham Bún một buồng X X

23 Stixis fasciculata Gagnep Dây tấm cám X X

Ghi chú: LT: làm thuốc; TP: thực phẩm (làm rau ăn, lấy quả); LG: lấy gỗ; LC: làm cảnh; CDK: công dụng khác

1.2 Mô tả thực vật

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hai loài thuộc họ Màn màn: Màn màn hoa tím

(Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.)

1.2.1 Màn màn hoa tím [6]

Tên Việt Nam: Màn màn tím, màn ri tím, màn ri tía

Tên khoa học: Cleome chelidonii L.f

Tên đồng danh: Cleome rutidosperma DC., Polanisia chelidonii (L.f.) DC

Họ: Cleomaceae, Chi: Cleome

Cây thân thảo cao 20 - 40 cm Thân có 5 cạnh, ít lông, màu xanh nhạt hay đỏ Lá kép ba lá chét, lá giữa lớn hơn, cuống lá dài bằng phiến hay gấp rưỡi phiến lá

Hoa đơn độc tại nách lá, có cuống dài, lá đài 4, cánh hoa 4, nhị 6, bầu có lông, vòi nhuỵ ngắn, quả dạng quả cải dài

1.2.2 Màn màn hoa vàng [1,6]

Tên Việt Nam: Màn màn vàng, sơn tiên

Tên khoa học: Cleome viscosa L

Tên đồng danh: Polanisia viscosa (L.) DC., Cleome isocandra L

Họ: Cleomaceae, Chi: Cleome

Cây thảo sống hằng năm cao đến 80 cm, rễ khỏe, vặn vẹo Thân và cành hơi khía rãnh, phủ lông mềm và dính Lá mọc so le, kép chân vịt gồm 3 - 5 lá chét dài 3 - 4 cm, rộng 1 - 1,5 cm, hai mặt có lông nhất là ở mặt bên, mép có lông nhỏ dạng mi Cụm hoa mọc thành chùm dài ở ngọn, hoa có 4 lá đài màu lục, 4 cánh màu vàng dài 7 - 12 mm, đài có 4 phiến có lông ở mặt ngoài, tràng có 4 cánh hình trái xoan, 7 - 30 nhị với bao phấn xanh, chỉ nhị mảnh đính ở dưới bầu, bầu hẹp và thuôn dài Quả loại quả cải dài

5 - 9 cm, hạt 1,5 mm

Trang 14

1.4 Thành phần hóa học

1.4.1 Màn màn hoa tím

học của cây này Kết quả cho thấy: Trong thân, lá cây có chứa các nhóm hợp chất antraquinon, flavonoid, chất béo, sterol, saponin, đường khử và protid Đồng thời, hàm lượng flavonoid toàn phần là 1,07 ± 0,02% tính theo dược liệu khô [5]

Rahman và cs (2008) phân lập được 2 hợp chất từ cao n-hexane: Acid

2-ethyl-cyclohex-2-ene-6-hydroxy-methylene-1-carboxylic và acid bentunic.[84]

Mondal và cs (2010) phân lập được β-sitosterol, lupeol và acid bentunic trong cao

CHCl3 của rễ.[70]

Trang 15

Acid 2-ethyl-cyclohex-2-ene-6-hydroxy-methylene-1-carboxylic

1.4.2 Màn màn hoa vàng

Srivastava và cs (1979) đã phân lập naringenin 4'-(xylosyl-β-(1→4)-glucoside.[98] Chauhan và cs (1979) phân lập kaempferol-3-glucuronide-4'-methylether từ rễ.[24]

Srivastava và cs (1980) phân lập stigmasta-5,24(28)-diene-3β-O-α-L-rhamnoside.[97]

Từ hạt, Ray và cs (1985)[86] phân lập cleomiscosin A-C và Kumar và cs (1988)[54] phân lập được cleomiscosin D

Jente và cs (1990) phân lập được clemeolide và acid cleomaldeic.[48]

Đỗ Huy Bích và cs (2003) và Mali (2010) đã tổng hợp các tài liệu về thành phần hóa học của cây này như sau:[1, 59] Hạt có 18 % dầu béo gồm hỗn hợp 5 loại acid béo như acid linoleic, acid palmitic, acid stearic và acid oleic Trong hạt chứa acid viscosic,

cleosandrin, cleomiscosin A-D Toàn cây có β-amyrin; 3',4'-dihydroxy-5-methoxy flavanone-7-O-α-L-rhamnoside, cleomeolide, cleosandrin, acid cleomaldeic; 5,4'-di-O- methyleriodictyol-7-O-β-D-glucoside, eriodictyol-5-rhamnoside, egost-5-en-3-O-α-L-rhamnoside, stigmasta-5,24(28)-diene-3β-O-α-L-rhamnoside, naringenin-4'-

galactoside; 3',4',5'-trihydroxyflavanone-7-O-α-L-rhamnoside,

dihydrokaempferol-4'-xyloside, naringenin-4-(xylosyl-β-(1,4)-glucoside),

kaempferol-3-glucuronide-4'-methylether và lupeol

Biwas và cs (2010) phân lập acid 2-amino-9-(4-oxoazetidin-2-yl) nonanoic từ rễ.[15]Jana và cs (2011) đã phân lập trong rễ được acid lactam nonanic.[46]

Senthamilselvi và cs (2012) phân lập được quercetin-3-O-(2''-acetyl)-glucoside từ

phân đoạn EtOAc của hoa.[90]

Chatterjee và cs (2013) phân lập được nevirapine.[22]

Kapoor và cs (2013) công bố hàm lượng flavonoid (chủ yếu là quercetin và kaempferol) trong lá là 0,71 mg/gdw.[49]

Bainiwal và cs (2013) cho biết, trong rễ, thân và lá có sự hiện diện của protein, steroid, flavonoid, terpenoid, carbohydrate và tannin Trong đó, hàm lượng flavonoid có trong

Trang 16

rễ, thân, lá lần lượt là 0,012; 0,013 và 0,019% và hàm lượng phenolic lần lượt là 0,007; 0,024 và 0,057%.[11]

Priyanka và cs (2014) đã phân tích bằng HPLC cho thấy có sự hiện diện của myricetin,

kaempferol-7-O-rutinoside, galacatechin, acid protocatechuic, acid gallic, và acid

β-resorcylic trong thân.[83]

Thành phần hóa học của Màn màn hoa vàng được phân loại theo các nhóm sau:

● Acid béo: Acid linoleic, acid oleic, acid palmitic và acid stearic

Trang 17

O HO

HO HO

O

O OH

OH

OH O

H3C HO HO OH

Quercetin 3-O-(2''-acetyl)-glucoside Kaempferol-7-O-rutinoside

● Terpen

O

O HO

● Triterpenoid

Stigmasta-5,24(28)-diene-3β-O-α-L-rhamnoside Egost-5-en-3-O-α-L-rhamnoside

Trang 19

Acid lactam nonanic Cleosandrin

1.5 Những nghiên cứu về dược tính

1.5.1 Màn màn hoa tím

Bose và cs (2007) công bố cao ethanol và cao phân đoạn diethyl ether có tác dụng

kháng khuẩn và kháng nấm trên Aspergillus niger, Bacillus polymexia, Bacillus subtilis, Candida albicans, Pseudomonas aerugenosa, Penicillum notatum, Salmonella typhi, Shigella flexiniry, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis và Vibrio cholerae.[18]

Theo Bose và cs (2007), cao chiết nước có tác dụng lợi tiểu phụ thuộc liều dùng và

có tác dụng kháng vi khuẩn Gram dương và Gram âm phụ thuộc nồng độ.[16]

Mondal và cs (2009) cũng báo cáo về khả năng giảm đau, kháng viêm và hạ sốt của cao rễ màn màn hoa tím.[71]

Dey và cs (2009) báo cáo cao methanol thể hiện khả năng ức chế khối u trên mô hình thực nghiệm gây ung thư da và ung thư dạ dày.[28]

Chakraborty và cs (2010) báo cáo cao ethanol và cao nước thể hiện hoạt tính ức chế

gốc tự do in vitro qua các phương pháp thử DPPH, nitric oxid và gốc hydroxyl.[21]

Nguyễn Tuấn Quang và cs (2011) công bố về tác dụng kháng khuẩn của cao chiết

của thân lá trên 5 chủng vi khuẩn gồm Proteus mirabilis, S typhi, P aeruginosa, S aureus, Bacillus cereus, tác dụng kháng viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân

chuột cống bằng carragenin và tác dụng chống oxy hoá thông qua cơ chế làm giảm lượng MDA và tăng lượng GSH trong gan chuột nhắt trắng.[4]

Nghiên cứu của Bose và cs (2012) cho thấy cao ethanol có hoạt tính kháng sốt rét

có in vitro với giá trị IC50 là 34,4 µg/mL.[19]

Trong nghiên cứu của Battu và cs (2012), dịch chiết của rễ màn màn hoa tím có

hoạt tính kháng oxy hóa và bảo vệ gan in vitro.[13]

Theo Patil và cs (2012), cao EtOAc có tác dụng kháng khuẩn mạnh, ức chế sự tăng trưởng của nhiều vi khuẩn kháng thuốc.[82]

Mondal và cs (2012) cũng báo cáo về khả năng làm lành vết thương của cao MeOH

và cao nước nhanh hơn so với cao khác với cùng điều kiện nghiên cứu.[72]

Trang 20

Theo Bose và cs (2013) cao EtOH và các cao phân đoạn có tác dụng giảm đau chống co giật nhờ tác dụng trên hệ thần kinh trung ương.[17]

Ethadi và cs (2013) báo cáo các cao chiết của rễ màn màn hoa tím có tác dụng kháng viêm và bảo vệ gan.[31]

Sridhar và cs (2014) báo cáo dịch chiết MeOH có tác động kháng nấm C albicans

mạnh với giá trị MIC là 0,039 mg/mL.[96]

Theo Okoro và cs (2015), cao MeOH uống liều 1.095 mg/kg tác dụng giảm lượng glucose trong máu trên mô hình chuột bị đái tháo đường do streptozotocin gây ra.[77]

1.5.2 Màn màn hoa vàng

● Tác động kháng khuẩn, kháng nấm

Williams và cs (2003) báo cáo cao chiết n-hexane từ lá và thân có hoạt tính kháng

khuẩn và kháng nấm.[104]

Sudhakar và cs (2006) chứng minh cao EtOH từ lá và hoa có tác dụng kháng khuẩn

trên E coli, Proteus vulgaris và P aeruginosa.[99]

Theo Bawankule và cs (2008), uống coumarinolignoid thể hiện tác dụng ức chế chất hóa học trung gian (chất tiền viêm) và tăng sản xuất chất trung gian kháng viêm.[14]Trong nghiên cứu của Biswas và cs (2010), hợp chất acid 2-amino-9-(4-oxoazetidin

-2-yl) nonanoic phân lập từ rễ có hoạt tính kháng khuẩn trên P aeruginosa và S aureus ở nồng độ 500 ppm.[15]

Theo nghiên cứu của Saradha và cs (2011), cao MeOH và cao nước có hoạt tính

kháng khuẩn in vitro trên 7 chủng vi khuẩn gồm B subtilis, E coli, Klebsiella pneumoniae, P vulgaris, P aeruginosa, S aureus và Streptococcus pneumoniae, trong khi cao nước có tác dụng trên K pneumoniae, P vulgaris và P aeruginosa.[89]

Ahmed và cs (2011) cùng Bose và cs (2011) cho biết cây có hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, hạ sốt, tiêu chảy, điều hòa miễn dịch, gây tê cục bộ, trị bệnh sốt rét và trị

giun sán.[9, 20]

Nghiên cứu của Dhanalakshmi và cs (2011) cho thấy cao MeOH có tác dụng ức chế

vi khuẩn B subtilis, S aureus, E coli và P aeruginosa.[29]

Nghiên cứu của Koppula và cs (2011) đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao

MeOH với 4 chủng vi khuẩn (E carotova, P marginalis, P syringe và X campestris)

và 10 loài nấm (A alternate, A flavus, A niger, A strictum, B bicolor, F oxysporium,

P expansum, R solani, T phaseolina và U maydis) cho kết quả hoạt tính mạnh nhất

Trang 21

đối với E carotova, T phaseolina và A alternate.[52]

Merekar và cs (2011) cho biết cao MeOH kết hợp cao cây thủy xương bồ có hoạt tính diệt giun mạnh.[65]

Wake và cs (2011) báo cáo hoạt tính kháng vi sinh vật in vitro của cao chiết từ hạt với S aureus, B subtillis, E coli, A niger, S cerviceae, A flavous và C albicans.[101]

Gopal và cs (2012) cho thấy cao MeOH thể hiện hoạt tính kháng u đáng kể trên chuột được cấy tế bào ung thư Ehrlich Ascites Carcinoma.[33]

Jane và cs (2012) nghiên cứu cho thấy cây Màn màn hoa vàng có khả năng kiểm soát tác nhân gây bệnh viêm tai giữa, dịch chiết aceton có tác dụng ức chế mạnh với

S pneumoniae và E coli, tiếp theo là S aureus, K pneumoniae và P aeruginosa.[47]Islam và cs (2014) nghiên cứu về cao chiết n-hexane, CHCl3 và MeOH của rễ, thân

và hạt trên Tribolium castaneum, Artemia salina và ấu trùng muỗi, kết quả cho thấy

cao chiết CHCl3 và MeOH của thân màn màn hoa vàng kháng T castaneum cao nhất

với IC50 0,170 bằng 0,248 ppm Các cao chiết n-hexane và CHCl3 có hoạt tính gây độc

tế bào cao với A salina (IC50 21,905 và 26,675 ppm sau 30 giờ) Cao chiết CHCl3 từ

hạt và rễ kháng ấu trùng muỗi Culex sp (IC50 185,39 và 272,91 ppm sau 30 giờ).[42]

Sakthivadivel và cs (2014) công bố về phân đoạn n-hexane có tác dụng kháng ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus với giá trị IC50 là 52,62 và 43,16 mg/L sau 24 giờ

và 48 giờ, kế tiếp là các cao chiết aceton, nước và CHCl3 với giá trị IC50 tương ứng 328,64 và 280,58; 493,44 và 298,76; 509,27 và 434,40 mg/L.[88]

Tomar và cs (2015) nghiên cứu về cao chiết MeOH và aceton từ hạt cho thấy có tác

dụng đối với các chủng vi khuẩn như B cereus, K pneumonia, P vulgaris và

P aeruginosa Cao chiết MeOH có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm hơn các cao

Trang 22

Theo nghiên cứu của Mishra và cs (2010), cao EtOH và cao nước từ hạt có tác động chống co giật bằng phương pháp sốc điện và pentylenetetrazole trên mô hình chuột nhắt.[66]

Theo nghiên cứu của Rao và cs (2014), cao chiết EtOH có tác dụng bảo vệ thần kinh trên chuột bị đái tháo đường gây bởi streptozotocin (STZ), lảm tăng hoạt tính các enzym kháng oxy hóa (superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH), catalase và giảm lượng malondialdehyde (MDA) đồng thời giảm qúa trình peroxyd lipid và stress oxy hóa.[85]

Nhóm nghiên cứu của Devi và cs (2015) báo cáo cao chiết MeOH với liều

120 mg/kg làm giảm chỉ số glucose, AST, ALT, ALP, ure, acid uric, creatinin và lipid

ở chuột đái tháo đường do alloxan gây ra so với nhóm đối chứng và tương tự thuốc metformin.[25]

● Hoạt tính bảo vệ gan

Chattopadhyay và cs (2008) báo cáo hai hợp chất coumarinolignoid là cleomiscosin

A và B trong hạt có tác dụng giảm tổn thương gan.[23]

Theo nghiên cứu của Kumar và cs (2009), cao MeOH thể hiện hoạt tính chống xơ hóa gan trên mô hình chuột bị gây xơ gan bằng CCl4.[55]

Gupta và cs (2009) công bố tác dụng bảo vệ gan của cao chiết EtOH tương tự với silymarin.[34, 35]

Mobiya và cs (2010) báo cáo về hiệu quả hoạt tính bảo vệ gan của hạt trên chuột bị gây độc gan bằng paracetamol: Cao EtOH có tác dụng bảo vệ, phòng ngừa tổn thương

tế bào gan do paracetamol Kết quả nghiên cứu mô bệnh học ở gan chuột cho thấy sự tái sinh của tế bào gan sau khi điều trị với cao EtOH.[68]

Yadav và cs (2010) nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan và đánh giá mức độ an toàn coumarinnolignoid (cleomiscosin A-C) được phân lập từ hạt Kết quả cho thấy các coumarinolignoid có hiệu quả bảo vệ gan, chống nhiễm độc gan do CCl4 gây ra.[105]

Trang 23

1.6 Bệnh gan và thuốc bảo vệ gan

Gan là một cơ quan quan trọng của con người, do đó bệnh gan là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới Có rất nhiều nguyên nhân gây ra bệnh gan khác nhau như ô nhiễm môi trường, lạm dụng thuốc, điều kiện vệ sinh kém và điều trị bằng thuốc đặc trị Một số bệnh gan thường gặp là viêm gan siêu vi, bệnh gan

do rượu, bệnh gan nhiễm mỡ không cồn, bệnh gan tự miễn, bệnh gan chuyển hóa, thuốc gây tổn thương gan và sỏi mật Trong đó, nguyên nhân của bệnh gan cấp tính là

sử dụng lâu dài các loại thuốc như paracetamol, zidovudin, lamivudin, CCl4, thioacetamid Hầu hết các thuốc gây tổn thương tế bào gan chủ yếu qua cơ chế peroxid hóa lipid và stress oxy hóa

Thuốc điều trị bệnh gan bao gồm thuốc tổng hợp và sản phẩm tự nhiên có tác dụng bảo vệ gan khỏi bị hư hại Các loại thảo mộc là nguồn quan trọng của thuốc bảo vệ gan Hoạt tính sinh học trong các loại thảo mộc như chất chống oxy hóa, loại bỏ gốc tự

do, chống viêm, kháng virus cũng kích thích tái tạo gan có thể là tác nhân như bảo vệ gan Tuy nhiên, hầu hết loại thảo mộc có tính bảo vệ gan chủ yếu là do chống oxy hóa

và loại bỏ gốc tự do

Các hợp chất từ thực vật được xem như là tác nhân bảo vệ gan bao gồm các hợp chất phenolic (flavanolignan, lignan, phenolic, flavanoid) và terpernoid (lactone diterpenic, glycosid triterpenic, glycosid irridoid, triterpen) Flavonoid là một trong những nhóm lớn nhất của các chất chuyển hóa thứ cấp Các loại thảo mộc có chứa flavonoid được biết như là một tác nhân bảo vệ gan chính Flavonoid đã được chứng minh là chất chống oxy hóa, kháng virus, kháng viêm Flavonoid có khả năng ổn định màng tế bào, do đó thể loại bỏ superoxide, các gốc hydroxyl ức chế lipid và peroxid hóa lipid Do đó, flavonoid thường được dùng trong các bệnh về gan và có thể bảo vệ

tế bào gan.[67]

1.7 Dòng tế bào HepG2

Mô hình in vitro thực hiện trên gan hoặc tế bào gan từ cơ thể và nuôi dưỡng trong

điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ giống môi trường cơ thể động vật hoặc người

Các tế bào phân lập trong huyền dịch hoặc nuôi cấy sơ cấp thường tăng trưởng chậm, số lượng tế bào thu được ít, kiểu hình không ổn định, khó nuôi cấy do thu hỗn tạp nhiều tế bào, đời sống ngắn Do đó, không thể lặp lại thí nghiệm nhiều lần dẫn đến hạn chế trong nghiên cứu tác dụng hay độc tính của thuốc Vì vậy, hiện nay các mô

Trang 24

hình in vitro thường dùng các dòng tế bào có nguồn gốc từ khối ung thư gan người với

đặc điểm phát triển nhanh, tăng sinh không giới hạn, thực hiện thí nghiệm nhiều lần với độ lặp lại và độ chính xác cao Trên thế giới, các dòng tế bào gan người được dùng

rộng rãi làm mô hình in vitro trong nghiên cứu sàng lọc các chất có khả năng phòng và

điều trị gan gồm WIF-B9, HepG2, HepRG, Hep3B, Huh7… Trong đó, HepG2 được

sử dụng phổ biến do đặc điểm, tính chất, quy trình nuôi cấy đã được biết rõ.[87]

HepG2 là dòng tế bào ung thư biểu mô gan người được phân lập từ khối ung thư gan của bệnh nhân nam người Mỹ da trắng 15 tuổi Tế bào HepG2 có hình thái và chức năng giống với tế bào gan người biệt hóa, thể hiện qua khả năng sản xuất các protein huyết tương (albumin, transferrin, fibrinogen, α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, plasminogen…), có các biểu hiện về insulin, transferrin, yếu tố tăng trưởng biểu bì, quá trình chuyển hóa, điều hòa chu kỳ tế bào, sao chép, vận chuyển, chuyển đổi tín hiệu và đáp ứng tốt với sự kích thích của hormon tăng trưởng của người

Trên thế giới đã nuôi cấy thành công dòng tế bào HepG2 ở các quy mô khác nhau với điều kiện nuôi cấy thích hợp thu được các tế bào biểu mô phân cực có hình dạng

và chức năng giống như tế bào gan trưởng thành biệt hóa Nhiều công trình nghiên cứu

về sự giống và khác nhau trong biểu hiện của bộ gen tế bào HepG2 so với tế bào gan người tươi cho thấy bộ gen của HepG2 tương đồng rất cao so với tế bào gan người bình thường[37, 38, 106] Với phương pháp microarray phân tích biểu hiện của gần 31.000 gen trong tế bào HepG2 so với tế bào gan người tươi mới phân lập và tế bào gan người nuôi cấy sơ cấp, nhóm nghiên cứu của Hart cho thấy tỷ lệ tương đồng về biểu hiện bộ gen giữa HepG2 so với tế bào gan người khoảng 80% Dưới tác động của các chất ngoại sinh, HepG2 có đặc tính tương tự như tế bào gan người nuôi cấy sơ cấp trong biểu hiện các gen mã hóa protein tham gia quá trình vận chuyển, đáp ứng với kích thích từ môi trường bên ngoài, các quá trình chuyển hóa acid amin, carbohydrat, lipid, steroid, chu kỳ tế bào, quá trình tăng trưởng, phát triển, biệt hóa của tế bào, truyền thông tin trong tế bào, bài tiết các chất…[40]

Hiện nay, HepG2 được sử dụng làm mô hình nghiên cứu quá trình chuyển hóa ở gan, tác dụng bảo vệ tế bào gan, chống oxy hóa… của hợp chất/dược liệu[41, 43, 45, 93, 95] Nhiều công trình đã sử dụng dòng HepG2 để khảo sát về tác hại của các gốc tự do và tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan khi tiếp xúc với các chất độc gan như rượu, chất béo, CCl4 và glucose (bệnh đái tháo đường týp II).[ 60, 62, 63, 64, 73, 74, 75]

Trang 25

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mẫu thực vật

Mẫu thực vật gồm lá và thân cây Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.) được thu hái tại huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương

2.2.1 Hóa chất

- Ethanol 96%, Việt Nam

- n-Hexane, Xilong, Trung Quốc

- Methanol, Xilong, Trung Quốc

- Chloroform, Xilong, Trung Quốc

- Ethyl acetate, Xilong, Trung Quốc

- H2SO4, Guanghua, Trung Quốc

2.2.2 Thiết bị

a Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254

(Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại tại hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện đến khi hiện màu

b Sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo

Trang 26

Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm Silica gel pha đảo RP-18

Ngoài ra, sử dụng chất nhồi cột là nhựa trao đổi ion diaion HP-20 và sephadex LH-20

lâm KH & CN Việt Nam với chất chuẩn nội là TMS (tetrametyl silan)

2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.3.1 Khảo sát khả năng gây độc tế bào in vitro bằng phương pháp MTT

Nguyên tắc: Tỷ lệ sống của tế bào được xác định qua hoạt tính enzym succinate

dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong tế bào sống SDH chuyển MTT dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] thành tinh thể formazan tan trong dimethyl sulfoxid tạo dung dịch đỏ tía được đo mật độ quang OD tại bước sóng

[3-(4,5-535 nm hoặc có thể hòa tan formazan trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch có màu, đo OD tại bước sóng 570 nm Giá trị OD phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu nuôi cấy [106]

Tiến hành: Các mẫu thử được pha trong DMSO với nồng độ: Cao n-hexane và

EtOAc: 10 mg/mL; cao MeOH: 100 mg/mL; hợp chất tinh khiết: 10 mM Các dung dịch bảo quản ở -20 oC, rã đông và pha loãng trong môi trường để đạt các nồng độ khảo sát, lọc vô trùng qua màng lọc 0,22 µm hoặc chiếu UV 60 phút trước khi dùng

Trang 27

Tế bào HepG2 được nuôi trong môi trường EMEM, bổ sung 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/mL penicilin, 100 µg/mL streptomycin Tế bào được nuôi trong bình nuôi cấy 75 cm2, ủ 37 oC, 5% CO2 Khi tế bào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ

70 - 80%), thu tế bào và chia vào đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ 4 x 104 tế bào/cm2 Ủ

ở 37 oC, 5% CO2 qua đêm để tế bào bám lên bề mặt đĩa nuôi cấy và phát triển ổn định Thay môi trường và xử lý tế bào với mẫu thử ở nồng độ khác nhau (Cao thử: 25, 50 và

100 µg/mL; hợp chất tinh khiết: 25, 50 và 100 µM) trong 24 giờ Nồng độ DMSO cuối cùng trong môi trường là 1%, 0,5% và 0,25% (v/v) Mẫu chứng bổ sung DMSO với nồng độ tương đương và mẫu đối chứng doxorubicin 10 µg/mL Thực hiện 6 mẫu cho

1 điều kiện nuôi cấy (ứng với 1 nồng độ) Sau 24, 48 và 72 giờ tiến hành xác định tỷ lệ

tế bào sống bằng phương pháp MTT

2.3.2 Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan trên dòng tế bào HepG2

Tế bào HepG2 được nuôi trong môi trường EMEM, bổ sung 10% FCS, 2 mM glutamin, 100 IU/mL penicilin, 100 µg/mL streptomycin Tế bào được nuôi trong bình nuôi cấy 75 cm2, ủ ở 37 oC, 5% CO2 Khi tế bào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70 - 80%), thu tế bào và chia vào đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ 4 x 104 tế bào/cm2 Ủ ở

L-37 oC, 5% CO2 qua đêm để tế bào bám lên bề mặt đĩa nuôi cấy và phát triển ổn định Thay môi trường và xử lý tế bào với CCl4 2 mM có hoặc không bổ sung các mẫu thử ở nồng độ 100 µM (DMSO trong môi trường là 1%) hoặc chất đối chứng quercetin

10 µM trong 24 giờ Các điều kiện nuôi cấy được bố trí cụ thể như sau:

• Mẫu sinh lý: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bình thường

• Mẫu chứng DMSO 1%: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường có DMSO 1%

• Mẫu bệnh lý: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bổ sung CCl4 2 mM

• Mẫu bệnh lý chứa DMSO 1%: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bổ sung DMSO 1% và CCl4 2 mM

• Mẫu thử riêng lẻ: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bổ sung hợp chất tinh khiết ở nồng độ 100 µM hoặc mẫu đối chứng quercetin 10 µM

• Mẫu thử tác dụng bảo vệ tế bào gan: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bổ sung CCl4 2 mM và hợp chất tinh khiết ở nồng độ 100 µM hoặc mẫu đối chứng quercetin 10 µM

Ủ 37 oC, 5% CO2 trong 24 giờ, thực hiện MTT khảo sát sự tăng trưởng tế bào

Trang 28

Hiệu quả bảo vệ tế bào gan đánh giá qua % phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng do CCl4 2 mM gây ra theo công thức: [2, 45, 80]

HQ (%) = [(ODCCl4 + mẫu thử - ODCCl4)/(ODmẫu chứng - ODCCl4)] x 100

2.4 Phân lập các hợp chất

2.4.1 Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa tím

Lá tươi (40 kg) rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thu được 5 kg bột khô

Bột khô (5 kg) được tận trích với EtOH 96% bằng phương pháp ngâm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH (520 g)

Sau đó, trích pha rắn lần lượt với n-hexane, EtOAc và MeOH, dịch chiết được thu hồi dung môi thu được cao tương ứng n-hexane (120 g), EtOAc (228 g) và MeOH (170 g)

Từ cao EtOAc (228 g), thực hiện sắc ký cột nhiều lần trên silica gel pha thường với

hệ dung môi n-hexane-CHCl3 với tỉ lệ 5:1, 2:1 và 1:1 thu được hợp chất 21 (20 mg), 22 (15 mg) và 23 (5 mg) tương ứng

Thực hiện sắc ký cột nhiều lần cao MeOH (170 g) trên silica gel pha thường với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (7:1:0,1) thu được hợp chất 2 (13 mg), hệ dung môi

CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,1) thu được hợp chất 5 (15 mg), 6 (50 mg) và 8 (30 mg)

Sơ đồ 1: Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa tím

2.4.2 Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa tím

Thân cây (75 kg) rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thu được 8,5 kg bột khô

Bột khô (8,5 kg) được tận trích với EtOH 96 % bằng phương pháp ngâm, lọc bỏ bã,

Trang 29

dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH (970 g) Sau đó

trích pha rắn lần lượt với n-hexane, EtOAc và MeOH, thu hồi dung môi thu được cao

tương ứng

Sơ đồ 2: Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa tím

Thực hiện sắc ký cột cao MeOH (302 g) trên silica gel với hệ dung môi CHCl3MeOH (0 - 100%) thu 7 phân đoạn (M1 - M7)

-Tại phân đoạn M2, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3MeOH-H2O (10:1:0,1) và silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (1:5)

Trang 30

-2.4.3 Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa vàng

Lá tươi (68 kg) rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thu được 7,5 kg bột khô

Bột khô (7,5 kg) được tận trích với EtOH 96% bằng phương pháp ngâm, lọc bỏ bã, dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH (810 g) Sau đó

trích pha rắn lần lượt với n-hexane, EtOAc và MeOH, thu hồi dung môi thu được các

cao tương ứng

Sơ đồ 3: Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa vàng

Thực hiện sắc ký cột cao MeOH (400 g) trên silica gel với hệ dung môi CHCl3MeOH (0 - 100%) thu 7 phân đoạn (M1 - M7)

-Tại phân đoạn M2, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3

-MeOH (10:1) thu được hợp chất 11 (8 mg)

Tại phân đoạn M3, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3MeOH-H2O (7:1:0,1) và silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (1:3)

Trang 31

2.4.4 Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa vàng

Thân cây (65 kg) rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thu được 7 kg bột khô

Bột khô (7 kg) được tận trích với ethanol 96% bằng phương pháp ngâm, lọc bỏ bã, dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH khối lượng là

850 g Sau đó trích pha rắn lần lượt với n-hexane, EtOAc và MeOH, thu hồi dung môi

thu được các cao tương ứng

Từ cao EtOAc (50 g) thực hiện sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung

môi n-hexane-CHCl3 (10:1) thu được hợp chất 24 (8 mg)

Thực hiện sắc ký cột cao MeOH (100 g) trên silica gel pha thường với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (15:1:0,1) thu được hợp chất 12 (6 mg), hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (7:1:0,1) thu được các hợp chất 13 (7 mg) và 14 (22 mg), hệ dung môi

CHCl3-MeOH-H2O (2:1:0,1) thu được hợp chất 10 (40 mg)

Sơ đồ 4: Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa vàng

Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất đã được phân lập được trình bày chi tiết trong các bảng 3.1 - 3.25

Trang 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Cấu trúc các hợp chất phân lập được

3.1.1 Hợp chất 1: Quercetin-7-O-α-L -rhamnopyranoside

→ HMBC

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học hợp chất 1 Hợp chất 1 có dạng vô định hình, màu vàng

Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 471,0885 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C21H20O11Na]+ là 471,0903) xác định công thức phân tử là C21H20O11 (Phụ lục 1a) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , δH ppm, J = Hz) (Phụ lục 1b) cho thấy sự hiện

diện của proton tại δH 12,48 ppm (1H, s, 5-OH) đặc trưng cho nối hydrogen nội phân

tử của một nhóm -OH gần nhóm carbonyl trong khung flavone Đồng thời, có sự hiện

diện hai proton tại δH 6,41 (H-6) và 6,78 (H-8) với hằng số tương tác J = 2,0 Hz trên vòng A và 3 proton trên hệ ABX δH 7,72 (1H, d; 2,5); 6,89 (1H, d; 8,5) và 7,58 (1H, dd; 8,5 và 2,5)

Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 , δC ppm) (Phụ lục 1c) hợp chất 1 xuất hiện 15 tín hiệu carbon của khung aglycone Dựa vào các phổ DEPT (Phụ lục 1d) xác định

chúng gồm có 5 CH (δC 120,1; 115,6; 115,2; 98,8 và 94,1) và 10 carbon bậc bốn (δC

176,0; 161,4; 160,3; 155,7; 147,9; 147,5; 145,0; 136,1; 121,8 và 104,6) và nhóm C=O

tại δC 176,0 chứng tỏ cấu trúc khung flavone là quercetin

Ngoài ra, phổ 1H-NMR cho các tín hiệu của vùng đường tại δH 1,13 - 5,54 ppm

Trong đó, tín hiệu doublet tại δH 1,13 ppm (3H, d; 6,0) cho thấy đơn vị đường là

rhamnose Tín hiệu proton tại δH 5,54 (1H, d) của carbon anomer với hằng số tương

tác spin khá thấp (J = 1,0 Hz) chứng tỏ đây là cấu hình α

Phổ 13C-NMR cho thấy ngoài 15 tín hiệu carbon của khung flavone hợp chất 1 còn

có thêm 6 tín hiệu carbon của phân tử đường rhamnose là δC 98,4 (C-1''); 69,8 (C-2''); 70,2 (C-3''); 71,6 (C-4''); 70,0 (C-5'') và 17,9 (C-6'')

Trang 33

Trên phổ HMBC (Phụ lục 1f), cho thấy có sự tương quan giữa proton anomer của

đường rhamnose tại δH 5,54 (1H, d; 1,5; H-1'') với carbon C-7 (δC 161,4) cho thấy đường rhamnose gắn vào khung aglycone tại vị trí C-7 Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ lục 1g), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau như H-1'' và H-2'', H-2''

và H-3'', H-5'' và H-6'' của phần đường rhamnose Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1

được trình bày trong bảng 3.1

Như vậy, hợp chất 1 là quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranoside Các kết quả phổ của

hợp chất 1 được xác định dựa vào sự so sánh với dữ kiện phổ đã được công bố.[10]

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 1

Vị trí δC

a,b [10] δC

a,c δH a,d (J = Hz) HMBC

( 1 H- 13 C)

COSY ( 1 H- 1 H) Aglycone

aDMSO-d 6, b150 MHz, c125MHz, d500 MHz

Trang 34

3.1.2 Hợp chất 2: Quercitrin

→ HMBC

Hình 3.2: Cấu trúc hóa học hợp chất 2 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 2

Vị trí δC a,b [102] δC a,c δH a,d (J = Hz) HMBC ( 1 H- 13 C) Aglycone

aDMSO-d 6, b100MHz, c125 MHz, d500 MHz

Trang 35

Hợp chất 2 có dạng vô định hình, màu vàng

Phổ 1H và 13C-NMR (Phụ lục 2a, 2b) của hợp chất 2 gần giống với phổ của hợp chất 1 Tuy nhiên, trên phổ HMBC (Phụ lục 2e) có sự khác biệt là proton anomer của

đường rhamnose tại δH 5,25 (1H, br s, H-1'') với carbon δC 134,2 (C-3) cho thấy đường

rhamnose gắn vào khung aglycone tại vị trí C-3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2

Như vậy, hợp chất 2 là quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside hay còn gọi là

quercitrin Các kết quả phổ của hợp chất 2 được xác định dựa vào sự so sánh với dữ

kiện phổ đã được công bố cho quercitrin.[102]

3.1.3 Hợp chất 3: Isoquercitrin

→ HMBC

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR khung aglycone hợp chất 3 là quercetin tương tự như hợp chất 2 (Phụ lục 3a, 3b)

Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR xuất hiện thêm các tín hiệu trong vùng đường tại δH

3,17 - 5,46 ppm, trong đó 2 tín hiệu của nhóm -CH2 tại δH 3,35 (1H, s) và 3,56 (1H, d; 11,5) Đồng thời, phổ 13C-NMR kết hợp DEPT cho tín hiệu tại δC 60,9 là nhóm -CH2-,

cho thấy hợp chất 3 có gắn thêm một đơn vị đường glucose

Trên phổ HMBC (Phụ lục 3e) cho thấy có sự tương tác giữa proton anomer của

đường glucose tại δH 5,46 (1H, d; 7,0; H-1'') với carbon C-3 (δC 133,3) cho thấy đường

glucose gắn vào aglycone tại vị trí C-3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 3 được trình

bày trong bảng 3.3

Từ các dữ kiện trên, cùng với tài liệu tham khảo[30] cho biết hợp chất 3 là quercetin

3-O-β-D-glucopyranoside hay còn gọi là isoquercitrin

Trang 36

3,35 (1H, m)

4'', 5''

aDMSO-d 6, b75 MHz, c125 MHz, d500 MHz

3.1.4 Hợp chất 4: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L -rhamnopyranoside

Hợp chất 4 có dạng vô định hình, màu vàng Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z:

633,1441 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C27H30O16Na]+ là 633,1431) xác định công thức phân tử là C27H30O16 (Phụ lục 4a)

Phổ 1H và 13C-NMR khung aglycone hợp chất 4 là quercetin tương tự như hợp chất

1 và 3 (Phụ lục 4b, 4c)

Các tín hiệu δH 5,48 (1H, d; 7,5; H-1''); 3,58 (1H, d; 11,5; H-6a''); 3,32 - 3,33 (1H,

m, H-6b''); 5,55 (1H, br s, H-1''') và 1,12 (3H, d; 6,0; H-6''') cùng với δC 99,4 (C-1'');

Trang 37

100,7 (C-1'''); 61,0 (C-6'') và 17,9 (C-6''') cho phép xác định trong hợp chất 4 có hai

đơn vị đường lần lượt là glucose và rhamnose

3,32 - 3,33 (1H, m) 4'', 5'' 5''

Rha

2''' 71,6 70,0 3,84 (1H, br s) 1''', 3''', 4''' 1''', 3''' 3''' 71,9 70,2 3,64 (1H, dd; 9,0 và 3,0) 1''', 2''', 4''', 5''' 2''', 4''' 4''' 73,4 74,1 3,30 (1H, m) 2''', 3''', 5''', 6''' 3''', 5''' 5''' 71,2 69,8 3,42 - 3,45 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 6''' 4''', 6'''

aMeOD-d 4, b200 MHz, cDMSO-d 6, d125 MHz, e500 MHz

Trang 38

→ HMBC

Hình 3.4: Cấu trúc hóa học hợp chất 4 Trên phổ HMBC (Phụ lục 4f) cho thấy có sự tương tác giữa proton anomer của

đường rhamnose tại δH 5,55 (1H, br s, H-1''') với carbon C-7 (δC 161,6) cho thấy đường rhamnose gắn vào khung aglycone tại vị trí C-7 và proton anomer của đường

glucose tại δH 5,48 (1H, d; 7,5; H-1'') tương quan với carbon C-3 tại δC 133,6 cho thấy đường glucose gắn vào khung aglycone tại vị trí C-3 Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ lục 4g), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau của phần đường

rhamnose và glucose Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 4 được trình bày trong bảng 3.4

Từ các dữ kiện trên, cùng với tài liệu tham khảo[50] cho biết hợp chất 4 là

quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside

-rhamnopyranoside-7-O-α-L -rhamnopyranoside

→ HMBC

Phổ HR-ESI-MS m/z: 779,2027 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C33H40O20Na]+ là 779,2010) xác định công thức phân tử là C33H40O20 (Phụ lục 5a)

Trang 39

Khung aglycone hợp chất 5 là quercetin với các tín hiệu proton tại δH 12,57 (1H, s, 5-OH); 7,39 (1H, d; 2,0; H-2'); 7,31 (1H, dd; 8,5 và 2,0; H-6'); 6,89 (1H, d; 8,5; H-5'); 6,75 (1H, d; 2,0; H-8) và 6,43 (1H, d; 2,0; H-6) trên phổ 1H-NMR và tín hiệu của các carbon phổ 13C-NMR tại δC 178,0 (C-4); 161,7 (C-7); 160,9 (C-5); 157,5 (C-2); 156,0 (C-9); 148,8 (C-4'); 145,2 (C-3'); 134,8 (C-3); 121,1 (C-6'); 120,4 (C-1'); 115,6 (C-2'); 115,5 (C-5'); 105,7 (C-10); 99,4 (C-6) và 94,5 (C-8) (Phụ lục 5b, 5c)

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (Phụ lục 5d) cho thấy hợp chất 5 có các tín hiệu:

1 carbon methylene kề oxy tại δC 60,2 (C-6'"); 2 carbon methyl tại δC 17,4 (C-6") và

17,9 (C-6"") cùng với 3 proton anomer tại δH 5,47 (1H, brs, H-1"); 4,22 (1H, d; 8,0;

H-1'") và 5,53 (1H, d; 1,0; H-1""); 6 proton của 2 nhóm methyl bậc hai tại δH 0,89 (3H, d; 6,5; H-6") và 1,11 (3H, d; 6,0; H-6""); 2 proton của nhóm methylene kề oxy tại

δH 3,40 -3,47 (1H, m, H-6a'") và 3,27 (1H, br s, H-6b'") trên phổ 1H-NMR Vậy hợp

chất 5 là flavonoid glycoside có khung quercetin với 3 đơn vị đường

Với 2 proton anomer tại δH 5,47 (1H, br s, H-1") và 5,53 (1H, d; 1,0; H-1"") cùng

với 6 proton của 2 nhóm methyl bậc hai tại δH 0,89 (3H, d; 6,5; H-6") và 1,11 (3H, d; 6,0; H-6"") xác nhận 2 đơn vị đường này đều là L-rhamnopyranose Bên cạnh đó, phổ COSY và HSQC xác nhận đơn vị đường còn lại là D-glucopyranose Mặt khác, với

hằng số ghép cặp J của 3 proton anomer tại δH 5,47 (1H, brs, H-1"); 4,22 (1H, d; 8,0;

H-1'") và 5,53 (1H, d; 1,0; H-1""), chứng tỏ các đơn vị đường lần lượt là đường α-Rha,

β-Glc và α-Rha

Mặt khác, phổ HMBC (Phụ lục 5f) cho thấy proton anomer tại δH 5,49 (1H, brs,

H-1") tương tác với carbon tại δC 134,8 (C-3), chứng tỏ đơn vị đường thứ nhất α-Rha

gắn vào khung aglycone tại vị trí C-3 Proton anomer tại δH 4,22 (1H, d; 8,0; H-1'")

tương tác với carbon methine kề oxy tại δC 81,4 (C-2"), chứng tỏ đơn vị đường thứ hai

β-Glc gắn vào đơn vị đường thứ nhất tại vị trí C-2" Ngoài ra, proton anomer còn lại tại δH 5,53 (1H, d; 1,0; H-1"") cho tương tác với 1 carbon bậc bốn vòng thơm kề oxy

tại δC 161,7 (C-7), chứng tỏ đơn vị đường thứ ba α-Rha gắn vào khung aglycone tại vị

trí C-7 Trên phổ COSY (Phụ lục 5g), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền

kề nhau của phần các đường rhamnose và glucose Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5

Từ các dữ kiện trên và so sánh với tài liệu đã công bố[12], hợp chất 5 là

quercetin-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside

Trang 40

Glc

1''' 103,2 106,2 4,22 (1H, d; 8,0) 2'', 3''', 5''' 2''' 2''' 73,8 73,9 2,94 - 2,98 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 2''' 1''', 3''' 3''' 77,2 76,2 3,10 - 3,16 (1H, m) 1''', 2''', 4''', 5''' 2''', 4''' 4''' 71,3 69,0 3,59 - 3,63 (1H, m) 2''', 3''', 5''', 6''' 3''', 5''' 5''' 77,4 76,5 3,10 - 3,16 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 6''' 4''', 6''' 6''' 61,3 60,2 3,39 - 3,47 (1H, m)

Định dạng
Số trang	99
Dung lượng	1,14 MB