Nghiên cứu thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo (canscora lucidissima) họ long đởm (gentianaceae) ở cao bằng

Nghiên cứu thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo (canscora lucidissima) họ long đởm (gentianaceae) ở cao bằng

HOÀNG THỊ YÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

CÂY XUYÊN TÂM THẢO (CANSCORA LUCIDISSIMA)

HỌ LONG ĐỞM (GENTIANACEAE) Ở CAO BẰNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC

Thái Nguyên, năm 2010

HOÀNG THỊ YÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

CÂY XUYÊN TÂM THẢO (CANSCORA LUCIDISSIMA)

HỌ LONG ĐỞM (GENTIANACEAE) Ở CAO BẰNG

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ Mã số: 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

Thái Nguyên, năm 2010

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Hoàng Thị Yên

Luận văn được hoàn thành tại phòng thí nghiệm khoa Hóa học cơ trường Đại học sư phạm Thái Nguyên

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS Phạm Văn Thỉnh - Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm Thị Hồng Minh, Th.S Vũ Anh Tuấn những người thầy đã động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hoá - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, phòng hoạt chất sinh học của trường Đại học Y Thái Nguyên, các thầy cô ở phòng HCSH -Viện KH và CNVN, phòng nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, khoa Sau Đại học trưòng Đại học Sư phạm Thái Nguyên- Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2010 Tác giả

Hoàng Thị Yên

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN CÁC THỰC VẬT CHI CANSCORA VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA NÓ 3

1.1 Khái quát vÒ các thực vật chi Canscora 3

1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây xuyên tâm thảo (Canscora lucidissima Hand- Mazz) 4

1.3 Những nghiên cứu hoá thực vật chi canscora 5

1.4 Nghiên cứu hoá thực vật loài Canscora lucidissima 15

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng các thực vật chi Canscora 16

1.6 Những nghiên cứu và ứng dụng cây xuyên tâm thảo trong nước 18

CHƯƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1.Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 192.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết cây xuyên tâm thảo 20

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 202.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 21

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất 21

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 22

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết 22

2.3.2 Khảo sát định tính các dịch chiết 24

2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan của cây xuyên tâm thảo (C H) 30

2.4.2 Cặn chiết etylaxetat (CE) 32

CHƯƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.3.1 Ancol no mạch dài nonacosan-1-ol (CH.1) 35

3.3.2 β-Sitosterol hay stigmast-5-en-3-ol (C29H50O) (CH.2) 36

3.3.3 1-Hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (CH.3) 38

3.3.4 1-Hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (CH.4) 47

3.3.5 1,7-Đihiđroxy-3-methoxy xanthon (E1) 52

3.3.6 1,7-Đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon (E2) 59

3.4 Thử hoạt tính sinh học 65

KẾT LUẬN 66

PHỤ LỤC 72

* Các phương pháp phổ

MS : Mass Spectrometry (Phổ khối lượng) FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại biến đổi Fourie)

NMR : Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectrometry (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer HSQC : Heteronuclear Single - Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

Bảng 2.1 Khối lượng các cặn chiết thu được từ các phân đoạn cây xuyên tâm thảo 24Bảng 2.2 Kết quả định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo 26Bảng 2.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây xuyên tâm

thảo 29Bảng 3.1 Số liệu phổ 13

C-NMR của chất CH.2 phân lập từ cây xuyên tâm thảo và phổ β-sitosterol [17] 37Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR và các tương tác xa trong CH.3 40Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR và các tương tác xa của 1-hiđroxy-3,5-

đimethoxyxanthon (CH.4) 48Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR, DEPT và tương tác xa của 1,7-đihyđroxy-3-

methoxy xanthon (E1) 53Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR, DEPT và các tương tác xa của 1,7-đihyđroxy-

3,6-đimethoxy xanthon 60

Hình 1.1 Hình ảnh cây xuyên tâm thảo (Canscora lucidissima) 5

Hình 2.1: Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch 28

Hình 3.1 Phổ 1 H-NMR của 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon 42

Hình 3.2 Phổ 1 3C-NMR của 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon 43

Hình 3.3 Phổ DEPT của 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxyxanthon 44

Hình 3.4 Phổ HSQC của 1-hidroxy-3,7,8-trimethoxyxanthon 45

Hình 3.5 Phổ HMBC của 1-hidroxy-3,7,8-trimethoxyxanthon 46

Hình 3.6 Phổ 1 H-NMR của 1-hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon 49

Hình 3.7 Phổ 1 3C-NMR của 1-hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon 50

Hình 3.8 Phổ DEPT của 1-hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon 51

Hình 3.9 Phổ IR của 1,7-Đihiđroxy-3-methoxy xanthon 54

Hình 3.10 Phổ 1 H-NMR của 1,7-đihiđroxy-3-methoxyxanthon 55

Hình 3.11 Phổ 13 C-NMR của 1,7-đihiđroxy-3-methoxy xanthon 56

Hình 3.12 Phổ DEPT của 1,7-đihiđroxy-3-methoxy xanthon 57

Hình 3.13 Phổ HMBC của 1,7-đihiđroxy-3-methoxy xanthon 58

Hình 3.14 Phổ 1H-NMR của 1,7-đihyđroxy-3,6-đimethoxy xanthon 61

Hình 3.15 Phổ 13C-NMR của 1,7- đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon 62

Hình 3.16 Phổ DEPT của 1,7-đihyđroxy-3,6-đimethoxy xanthon 63

Hình 3.17 Phổ HMBC của 1,7-đihyđroxy-3,6-đimethoxy xanthon 64

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, gió mùa, mưa thuận, gió hoà nên hệ thực vật rất phong phú và đa dạng với nhiều loài thực vật là những loại dược liệu quí Từ thời xa xưa, trước khi sự ra đời của thuốc tây cha ông ta đã biết sử dụng nhiều loại cây cỏ trong tự nhiên làm thuốc chữa bệnh, rất nhiều loại bệnh tật đã được chữa khỏi nhờ các loại cây cỏ Những thực vật này đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người.

Từ nhiều thế kỷ nay những hợp chất thiên nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành như ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm

Ngày nay công nghệ tổng hợp hoá dược đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh Điều đó đã góp phần làm tăng tuổi thọ con người, nhưng không vì thế mà việc sử dụng các loại cây cỏ trong chữa bệnh giảm đi, mà nhu cầu sử dụng chúng theo cách cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học Trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp, đã được khoa học hiện đại soi sáng Mặt khác việc dùng thuốc nam trong chữa bệnh hầu như không gây ra tác dụng phụ

Việc sử dụng các thảo dược dù chỉ là một loại dược liệu nhưng lại là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong mọi trường hợp hầu hết đều chưa xác định rõ hoạt chất của từng chất Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên Từ đó định hướng cho

việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm ra các loại thuốc mới hay bằng con đường tổng hợp để tạo ra những chất có hoạt chất trong việc chữa trị nhiều loại bệnh Chính vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

Nghiên cứu cây thuốc giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần, cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học và tác dụng dược lí của cây thuốc Trên cơ sở các nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao có vai trò và là một tiềm năng to lớn trong sự nghiệp bảo vệ sức khoẻ và phòng chống các loại bệnh tật phục vụ cho nhân dân

Cây xuyên tâm thảo có tên khoa học là Canscora lucidissima thuộc họ

Long đởm (Gentianaceae) là loại thực vật mọc hoang ở Việt Nam, từ lâu cây

đã được sử dụng trong y học dân gian để chữa trị một số bệnh như ho do phế nhiệt, viêm gan, đau ngực, đau dạ dày, thanh nhiệt, đòn ngã ứ máu, chữa bệnh tim Đây là bài thuốc độc vị khá độc đáo Mặc dù vậy ở nước ta mới chỉ có một số tài liệu giới thiệu tác dụng của cây xuyên tâm thảo, còn những hiểu biết về thành phần hoá học và những hoạt tính sinh học của chúng hầu như chưa có công trình nào nghiên cứu và thực vật này cũng chưa có tên trong các sách cây thuốc ở Việt Nam

Vì vậy, chúng tôi chọn cây xuyên tâm thảo làm đối tượng nghiên cứu, với mục đích nhằm góp phần làm rõ thêm những hiểu biết về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học của cây Từ đó tạo thuận lợi cho việc sử dụng cây làm dược liệu trong chữa bệnh và làm tăng thêm kho tàng tri thức về cây thuốc cổ

truyền Việt Nam với đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học cây xuyên tâm

thảo (Canscora lucidissima) họ Long đởm (Gentianaceae) ở Cao Bằng”

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

CÁC THỰC VẬT CHI CANSCORA VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA NÓ

1.1 Khái quát vÒ các thực vật chi Canscora

Các thực vật chi Canscora, thuộc họ Long đởm (Gentianaceae) là loại

cây thân thảo, thường là loại cây thân rễ, có các nốt sần ở rễ Cây mọc vào tháng 2 -3, các lá đơn mọc đối, ra hoa vào tháng 9 - 10 và thu hoạch vào tháng

10-12 hàng năm Thực vật chi Canscora gặp ở các vùng có khí hậu nhiệt đới

của Châu Phi, Châu Á, đặc biệt là ở Nepal, Ấn Độ, Srilanka, Malaixia, Ôxtrâylia,Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Inđonexia và Philippines

Chi Canscora gồm khoảng 30 loài [39]

Theo tài liệu của trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, ở nước ta chi

Canscora có 8 loài: C andrograpioide, C carinata, C gracili, C lucidissia, C.macrocalyx, C.petelotii, C.decussata và C.diffua Trong đó 3 loài thường nói đến C decussata, C diffua và C.lucidissima [36]

Loài Canscora decussata Schult tên tiếng việt gọi là cỏ can chéo hay cỏ

bươm bướm, loài này mọc phổ biến ở nhiều nước có vùng khí hậu nhiệt đới của Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam Ở nước ta gặp nhiều ở vùng núi Tam Đảo, Khánh Hoà Cây mọc hoang dọc đường đi ở vùng núi [37]

Loài Canscora diffusa Vahl gọi là cỏ can tràn hay cỏ bươm bướm tràn,

loài này gặp ở các vùng nhiệt đới của Châu Phi, Châu Á, đặc biệt là ở Nepal, Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Inđonexia, Philippines và ở nhiệt đới Australia Ở nước ta có mọc nhiều ở các tỉnh Nam Bộ Cây mọc ở ruộng vào

tháng 2-3 ra hoa quả tháng 12 [38]

Loài Canscora lucidissima Hand-Mazz tên tiếng việt là xuyên tâm

thảo, loài thực vật này gặp phổ biến ở Trung Quốc (Quảng Tây, Quý Châu),

Ấn Độ, Việt Nam Ở nước ta chúng phổ biến ở các tỉnh niềm núi vùng Đông Bắc như Cao Bằng, Bắc Cạn, Lạng Sơn và một số nơi khác có núi đá vôi

Năm 2003 Nguyễn Tiến Hiệp và các cộng sự đã phát hiện thấy loài Canscora

lucidissima có ở các đảo thuộc Vịnh Hạ Long tỉnh Quảng Ninh [34], [40]

1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây xuyên tâm thảo (Canscora

lucidissima Hand- Mazz)

Cây xuyên tâm thảo là cây thân thảo mọc hàng năm, cao 30cm, thân rễ, rễ có những nốt sần, phân nhánh lưỡng phân, nhánh mảnh

Lá mọc đối, các lá ở trên dính nhau từng cặp một thành bản tròn, có đường kính 1-2cm, mặt dưới màu lục trắng cuống xuyên qua tâm lá giống như các lá hoa

Hoa ở ngọn các nhánh, có lá bắc; hoa nhỏ, màu vàng trắng, có cuống hoa; đài hình ống, 3 - 5 thùy hình tam giác, tràng hình ống với 5 cánh; bầu trên, hình tròn

Quả nang hình cầu, hạt nhiều, thuộc loại thực vật hạt kín

Cây mọc trên đất giàu mùn ở hốc đá vôi, vách đá ẩm nhiều mùn, dưới tán cây rậm, mọc vào tháng 2 - 3, ra hoa tháng 9-10 và thu hoạch tốt nhất vào tháng 10 -11 thời kỳ này trên cây có cả hoa già lẫn quả non [33], [39]

Hình 1.1 Hình ảnh cây xuyên tâm thảo (Canscora lucidissima)

1.3 Những nghiên cứu hoá thực vật chi canscora

Cho đến nay đã có 4 loài thực vật chi Canscora (C.lucidisima, C

decussata, C diffusa và C cachanlahuen) được nghiên cứu hoá thực vật, sử

dụng các phương pháp sắc kí người ta đã phân lập được các chất kết tinh tinh khiết Các chất tinh khiết phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: Màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy và các phương pháp quang phổ hiện đại Người ta đã phân lập và nhận dạng được 49 chất thuộc các nhóm chất khác nhau điển hình là: Các flavonoit, steroit, tritecpenoit, xanthon, cumarin và hợp chất poliphenol

1.3.1 Các hợp chất có khung flavonoit

Từ thực vật Canscora diffusa người ta đã phân lập được 2 hợp chất flavan

và người ta xác định thức cấu tạo của chúng là 5,7-đihyđroxy-3',4'-đimethoxy

flavan tên thông thường là điffutidin (1) và 7-hiđroxy-3',4'- đimethoxy O-β-D-glucopyranozit và gọi là điffutin (2) [6]

Từ dịch chiết n-hexan của thân, lá và hoa của thực vật Canscora

decussata ở Ấn Độ Shibnath Ghosal cùng các cộng sự bằng phương pháp

sắc kí hấp thụ đã phân lập được 3 hợp chất có khung steroit và xác định cấu trúc của chúng là campesterol hay 24(R,S)-methylcholesterol (C28H48O) (3),

β-sitosterol hay stigmast-5-en-3-ol (C29H50O) (4) và stigmasterol hay

(3) Campesterol

2223

I.3.3 Các hợp chất có khung triterpenoit

Năm 1972 từ dịch chiết n-hexan của thân, lá và hoa của thực vật Canscora

decussata ở Ấn Độ Shibnath Ghosal, Ratan K Chaudhuri và Amar Nath đã phân lập và nhận dạng được 5 triterpenoit Các hợp chất tritecpenoit này thuộc hai kiểu khung olean, lannostan và các tác giả xác định công thức cấu tạo của chúng là fridelan-3-on tên thường gọi friedelin C30H50O (6); olean-12-

en-3-β-ol hay β-a myrin (C30H50O) (7); friedelan-3-β-ol (C30H52O) (8);

tirucalla-8,22-đien-3-on (C30H48O) (9) và lanosta-8,24-đien-3,22-đion hay

canscorađion (C30H46O2 ) (10) [6], [9], [10]

(6)

Fridelan-3-on

(7)

Olean-12-en-3β-ol

MeMe

Me MeMe

(10)

Lanosta-8,24-đien-3,22-đion

1.3.4 Các hợp chất khung xanthon

Trong số các chất đã phân lập được từ 4 loài thuộc chi Canscora thì

cấu trúc các hợp chất xanthon được tìm thấy nhiều nhất Chủ yếu là cấu trúc xanthon chứa các nhóm thế OH, OCH3, gốc glycozit ở các vị trí khác nhau

của khung xanthon

Từ rễ loài thực vật Canscora decussata Schult năm 1970, R K

Chaudhljri và S Ghosal ở trường Đại học dược Banaras Hindu, Varanasi-5 Ấn Độ đã phân lập và nhận dạng được 12 hợp chất xanthon Dựa vào kết quả phân tích các phổ UV, NMR, MS các tác giả đã xác định công thức cấu tạo

của chúng đó là: 1-hyđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (11); methoxy xanthon (12); 1,3,5,6-tetrahyđroxy xanthon (13); 1,3,5-trihyđroxy-6-methoxy xanthon (14); 1,3,8-trihyđroxy-7-methoxy xanthon (15); 1,8-đihyđroxy-3,7-đimethoxy xanthon (16); 1-hyđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (17); 1,3,7,8-tetrahyđroxy xanthon (18); 1-hyđroxy-3,6,7,8-tetramethoxy xanthon (19); 1,8-đihyđroxy-3,6,7-trimethoxy xanthon (20); 1,3,8-trihyđroxy-6,7-đimethoxy xanthon (21) và 1,3,6,7,8- pentahyđroxy xanthon (22) [7]

Từ hoa tươi loài thực vật Canscora decussata ở Ấn Độ năm 1978,

Shibnath và các cộng sự phân lập được một xanthon và người ta xác định cấu

trúc của chúng là 3,6-đihyđroxy-1,5,7-trimethoxy xanthon (23) [5], [6], [11]

OOMe

Theo tài liệu [6], [15] người ta đã tách từ thực vật Canscora decussata

được 1 hợp chất thuộc nhóm xanthon và các tác giả đã đề nghị cấu trúc của nó

xanthon (25); 1,6,8-trihyđroxy-2-methoxy xanthon (26); đimethoxy xanthon (27); 1,5,6-trihyđroxy-3-methoxy xanthon (28); 1,3,6-trihyđroxy-5-methoxy xanthon (29); 1,6-trihyđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (30); 1-hyđroxy-3,5,6-trimethoxy xanthon (31); 1,6,7-trihyđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (32); 1,5,7-trihyđroxy-3,6-methoxy xanthon (33); 1,5,6-trihyđroxy-3,7-đimethoxy xanthon (34); 1,3,5-trihyđroxy-6,7-đimethoxy xanthon (35); 1,7-đihyđroxy-3,5,6-trimethoxy xanthon (36); 1,5-đihyđroxy-3,6,7-trimethoxy xanthon (37) và 1-hyđroxy-3,5,6,7-tetramethoxy xanthon (38)

1,8-đihyđroxy-2,6-[6], [8], [11], [18], [19], [25]

OMeMeO

R1 = R3 = R4 = H; R2 = Me (26)

R1 = R4 = H; R2 = R3 = Me (27)

OOOR1OR4R2OOR3 R1 = R3 = R4 = H; R2 = Me (28)

R1 = R2 = R4 = H; R3 = Me (29)

R1 = R4 = H; R2 =R3 = Me (30)

R1 = H; R2 = R3 = R4 = Me (31)

OOOR1OR4R2OOR3OR5R1 = R4 = R5 = H; R2 = R3 = Me (32)

Năm1984, Kanamori và các cộng sự đã tách từ thực vật Canscora

cachanlahuen được 1 xanthon có cấu trúc là 8-hiroxy-1,2,6-trimethoxy

xanthon tên thường gọi decussatin (39) [6], [24]

Từ loài canscora decussata người ta đã tách được 6 hợp chất là dẫn xuất

xanthon có chứa gốc đường dạng xanthon-glycozit Các chất sau khi được phân lập, người ta làm rõ cấu trúc của nó và xác định công thức cấu tạo chúng

là 1,3,6,7-tetrahyđroxy xanthon -2-β-D-glucopyranozit (hay mangiferin) (40); 1,3,5,6-tetrahyđroxyxanthon-2-β-D-glucopyranozit(41); 1,6-đihyđroxy-3,7-đimethoxy xanthon-5-O-β-D-glucopyranozit (42); 1,6-đihydroxy-3,5-đimethoxy xanthon -7-O- β - D-glucopyranozit (43); 3-hyđroxy-5-methoxy xanthon -1-O-

glucopyranozit (44) và 5-hiđroxy-1-methoxy xanthon -3-O-rutinozit (45) [6], [7],

[8], [11], [12]

OHOHO

(43

1,6-Đihydroxy-3,5-đimethoxy xanthon -7-O- β - D-glucopyranozit

Theo tài liệu [7] từ thực vật Canscora decussata, người ta tách được một

hợp chất poliphenol chúng có cấu trúc là 3-hiđroxybenzyl-2,4,6-trihyđroxy

benzylxeton (46)

Năm 1976, Ghosal S và các cộng sự từ thực vật Canscora decussata đã

tách và nhận dạng được một hợp chất lacton có cấu trúc là loliolide (47) [13]

(47)

Loliolide

Từ dịch chiết metanol của canscora decussata, Neeraj K cùng các cộng

sự đã phân lập được một hợp chất cumarin và xác định chúng có cấu trúc là

7-hiđroxy-6-methoxy cumarin tên thường gọi scopoletin (48) [28]

(48)

7-Hiđroxy-6-methoxy cumarin

1.4 Nghiên cứu hoá thực vật loài Canscora lucidissima

Từ loài thực Canscora lucidissima, dựa vào các phương pháp sắc kí đã phân

lập và nhận dạng được 5 hợp chất xanthon, người ta xác định chúng có cấu trúc là

1-hyđroxy-3,5-đimethoxyxanthon (11); 1-hyđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon(17);

1,6-đihyđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (30); 1-hyđroxy-3,5,6-trihyđroxy xanthon (31) và 1,8-đihyđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (49) [23], [24]

(49)

1,8-Đihiđroxy-3,5- đimethoxy xanthon

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng các thực vật chi Canscora

Ở mục 1.3 và 1.4 đề cập đến những nghiên cứu hoá thực vật của chi

Canscora đã chỉ ra tính đa dạng về thành phần hoá học của chúng bao gồm:

Các flavan, tritecpenoit, sterol, poliphenol, cumarin, lacton và xanthon với cấu trúc rất phong phú và đa dạng

Các thực vật chi Canscora chủ yếu chứa nhóm chất xanthon và các

hợp chất này là một loại dược liệu quý có hoạt tính chống oxy hóa cao, nhiều

loại xanthon và những dẫn xuất của chúng đã được chứng minh có đặc tính kháng nấm và kháng vi khuẩn, có tác dụng làm giảm cholesterol, bảo vệ tế bào gan, ức chế những tế bào ung bướu Vì vậy được xem là một loại chất có tác dụng kháng ung thư; Có tác dụng làm gảm đau nên được dùng để điều trị điều trị những chứng đau viêm, làm hạ nhiệt độ cơ thể khi bị sốt; Có tác động kháng dị ứng, rõ rệt nhất là những dị ứng xảy ra trong ruột; Các hợp chất

xanthon được xem là “ứng viên tiềm năng” trong việc chữa trị những chứng

bệnh Parkinson và Alzheimer [42]

Có nhiều loài thực vật thuộc chi Canscora thường có vị đắng được sử

dụng làm thuốc trong y học dân gian, trong đó có 3 loài được dùng phổ biến

nhất là C decussata, C diffusa và C lucidissima

Loài Canscora diffusa toàn cây được dùng làm thuốc nhuận tràng, bồi bổ thần kinh [36] Các chất chiết xuất từ loài Canscora diffusa được dùng để

chữa các bệnh: Đau đầu, chóng mặt, mất ngủ, suy nhược thần kinh, người làm việc trí óc căng thẳng suy giảm giảm trí nhớ và độ minh mẫn Hợp chất

điffutin (2) tách từ thực vật canscora diffusa có tác dụng chống lại stress, mất

ngủ, giảm trí nhớ và độ minh mẫn [32]

Rễ của loài Canscora decussata Schult có những tính chất đắng và bổ

Cây có tác dụng nhuận tràng, bổ thần kinh, trấn kinh, an thần [35] Ở Ấn Độ dịch cây tươi dùng trị bệnh tâm thần, động kinh, suy nhược thần kinh [30],

[35] Hợp chất mangiferin (40) tách được từ thực vật Canscora decussata

được sử dụng trong mỹ phẩm có tác dụng bảo vệ da chống lại các tia cực tím bức xạ [41], mangiferin nhóm dược lý chữa bệnh da liễu [33], mangiferin được sử dụng trong y học ở nhiều nước trên thế giới như chống oxy hoá, kháng viêm, kháng virus, tăng cường miễn dịch, giảm đau Thực tế cho thấy,

mangiferin có tác động kháng virus Herpes, chống lão hoá tế bào thần kinh, tế

bào gan, suy giảm trí nhớ, ức chế chuyển glucogen thành glucozơ, giảm nguy cơ tiểu đường [32]

Các xanthon nhóm thế ở các vị trí 1,3,5,6,7 và 1,3,6,7,8 của khung

xanthon phân lập từ Canscora decussata có khả năng chống vi khuẩn lao đặc

biệt các xanthon có nhóm OH ở các vị trí 1,3 và 6 hoặc 8 có khả năng chống vi khuẩn lao tốt hơn so với xanthon nhóm thế ở các vị trí khác [26]

Loài Canscora lucidissima Hand-Mazz cây có vị đắng, tính mát có tác

dụng thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết chỉ thống Ở Trung Quốc người ta sử

dụng làm thuốc chữa ho do phế nhiệt, viêm gan, đau ngực, đau dạ dày, rắn cắn, đòn ngã ứ máu [40], [43]

Y cổ truyền Trung Quốc đã tiến hành thí nghiệm và rút ra kết luận

hợp chất 1,6-đihydroxy-3,5-đimethoxy xanthon (30) tách được từ thực vật

Canscora lucidissima có tác dụng kháng viêm rất tốt [29]

Ở Trung Quốc, tác giả He Q cùng các cộng sự nghiên cứu ba hợp chất

xanthon (1-hyđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (11); 1-hyđroxy-3,7,8- trimethoxy xanthon (17) và 1,8 - đihyđroxy - 3,5- đimethoxy xanthon (49) tách từ loài thực

vật Canscora lucidissima có tác dụng làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc rối loạn

nhịp tâm thất và thời gian phát bệnh, bảo vệ bệnh thiếu máu cơ tim cục bộ gây ra bởi rối loạn nhịp tim, làm giảm tổn thương cơ tim (thí nghiệm nghiên cứu được thử nghiệm trên cơ thể chuột cống) [23], [24]

1.6 Những nghiên cứu và ứng dụng cây xuyên tâm thảo trong nước

Ở Việt Nam hầu như chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo, ngoại trừ một số tài liệu giới thiệu về tác dụng dược lý của cây như: Cây có tác dụng kháng viêm rất tốt được dùng để điều trị viêm gan, vàng da, đau dạ dày, đòn ngã ứ máu, giảm đau, rắn cắn, chữa

3 Đau bụng kinh, rối loạn kinh nguyệt, máu cam: Cây khô 10-15 gam/ ngày sắc nước uống, nếu cây tươi dùng lượng gấp đôi

4 Chữa bệnh tim: Cây khô 10-15 gam / ngày đun nước uống hàng ngày mỗi đợt điều trị uống từ 1-2 tháng

Ngoài ra nhân dân còn dùng cây để sắc nước uống hàng ngày có tác dụng thanh nhiệt, giải độc và khi cơ thể mệt mỏi, ăn uống kém Liều dùng 10-15 gam cây khô/ ngày

CHƯƠNG 2

PHẦN THỰC NGHIỆM

Cây xuyên tâm thảo là cây thuốc được sử dụng trong y học dân gian Việt Nam để chữa trị một số bệnh như ho do phế nhiệt, thanh nhiệt, giải độc, đinh nhọt, rắn cắn, đau ngực, đòn ngã ứ máu, chữa bệnh tim [38]

Ở nước ta chỉ có một số tài liệu giới thiệu về tác dụng dược lý của cây, còn những hiểu biết về thành phần hoá học của cây này hầu như chưa được nghiên cứu, thậm chí cây xuyên tâm thảo còn chưa có tên trong các sách cây thuốc ở Việt Nam Vì vậy chúng tôi chọn cây xuyên tâm thảo làm đối tượng nghiên cứu

Nhiệm vụ của luận văn là phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số chất trong cây xuyên tâm thảo thu hoạch ở Cao Bằng bằng các phương pháp vật lý, hoá học hiện đại

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu là toàn bộ cây phần trên mặt đất của thực vật xuyên tâm thảo Mẫu cây tươi được thu hái vào tháng 10/2009 tại huyện Quảng Uyên tỉnh Cao Bằng

Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật đã được TS Lê Ngọc Công (khoa Sinh trường Đại học sư phạm Thái Nguyên) giám định có tên khoa học

là Canscora lucidissima Hand – Mazz Ngoài ra còn có tên gọi theo địa

phương là xuyên rim, xuyên tim

Bộ phận mẫu được hong khô ở nơi thoáng mát, sau đó sấy ở nhiệt độ 500C- 600C tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng, dịch chiết được thu gom lại và cất

cô bằng máy cất quay với áp suất giảm

Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, xác định khối lượng cặn chiết thu được Sau đó thêm nước vào cặn rồi lần lượt chiết bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự: n-hexan, etyl axetat, n-butanol Phần còn lại là cặn tiếp tục được cô cạn rồi hòa tan vào metanol Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 600C dưới áp suất thấp, thu được các cặn thô

Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần như nhau, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp hoặc tách trên sắc ký cột lặp lại nhiều lần v.v để được chất tinh khiết

Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết cây xuyên tâm thảo

Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây xuyên tâm thảo chúng tôi phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết

tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm:

- Sắc kí lớp mỏng (SKLM) - Sắc kí cột thường

- Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các tính chất vật lý đặc trưng như: Màu sắc, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy v.v khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR), các kỹ thuật phổ một chiều (1D-NMR) và phổ hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng

2.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng hay dùng trong phân tích đều phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA)

Sắc kí cột được tiến hành trên cột với chất hấp phụ silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 – 0,063 mm)

Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được

Các hệ dung môi triển khai SKLM:

Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng

= 254 nm – 365 nm, phun thuốc thử vanilin 1% - H2SO4 5% trong dung dịch etanol, sấy ở trên 100oC hoặc thử bằng hơi iođ, amoniac, sau đó quan sát màu để phát hiện các hợp chất

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai theo biểu thức: Chiều dài di chuyển chất thử

Rf =

Chiều dài di chuyển của dung môi

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (khoa Hoá trường Đại học sư phạm Thái Nguyên) dưới dạng viên nén KBr

- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, DMSO

- Phổ ESI-MS (Phổ khối với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD (Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam)

2.3 Thu nhận các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết

Mẫu cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu Dịch chiết được cất loại dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50-600

C dưới áp suất thấp Cặn dịch chiết metanol sau khi thêm nước được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, n-butanol, metanol Các dịch chiết phân đoạn, được làm khô bằng Na2SO4 khan, sau đó cất đến hết hoàn toàn dung môi ở áp suất giảm, thu được các cặn chiết tương ứng

Việc thu nhận các dịch chiết và phân lập các chất từ cây xuyên tâm thảo được tiến hành theo sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết và phân lập các chất từ cây xuyên tâm thảo

( Canscora lucidissima Hand - Mazz )

Mẫu khô nghiền nhỏ

Cặn n- hexan

(C.H)

Cặn tổng metanol

CH.1

Etylaxetat 1 MeOH

2 Cất loại dung môi dưới áp suất giảm

+ H2O

Lắc chiết phân đoạn

n-hexan

Sắc kí cột Sắc kí cột

n-butanol

Cặn Etylaxetat

(C.E)

Cặn n- butanol

(C.B)

Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 600C dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng không đổi

Như vậy từ cây xuyên tâm thảo sẽ có 3 loại cặn chiết được ký hiệu là: C H C E C B

C.H: Cặn chiết n- hexan C.E: Cặn chiết etylaxetat

C.B: Cặn chiết n -butanol của cây xuyên tâm thảo

Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo được nêu trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ các phân đoạn cây xuyên tâm thảo

Mẫu thu vào tháng 10/2009

Khối lượng mẫu khô (g)

Khối lượng cặn chiết thu được (g)

2.3.2.2 Phát hiện các ancaloit

Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit

Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch thuốc thử Wagner, nếu có nhiều kết tủa là phản ứng dương tính

Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính

Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính

2.3.2.3 Phát hiện các flavonoit

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin

Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1 Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính

Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin

2.3.2.5 Định tính các glycozit tim

Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1 Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%

Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glycosit tim

2.3.2.6 Định tính các saponin

Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1 lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho

2ml dịch thử Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính

2.3.2.7 Định tính các đường khử

Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, hoà tan trong cồn, dung dịch thu được đem trộn với dung dịch thuốc thử Felinh theo tỉ lệ 1-1, đun sôi 2-3 phút Nếu có kết tủa da cam của Cu2O thì chứng tỏ có mặt của đường

Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo được nêu trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Kết quả định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo

cây

Dung dịch nhạt màu dẫn

6 Glycozit tim FeCl3 trong CH3COOH +

Chú giải : + : Phản ứng dương tính - : Phản ứng âm tính.

2.3.3 Thử hoạt tính sinh học

Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định theo phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn của bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Thái Nguyên

Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:

 Vi khuẩn: Gr (-) Escherichia coli (thực khuẩn đường ruột)

 Vi khuẩn: Gr (+) Staphylococcus auresu (tụ cầu vàng)

 Vi khuẩn: Salmonella spp (thương hàn)

 Vi khuẩn: Shigella spp (lỵ trực khuẩn)

Vi khuẩn: Streptococcus pyogenes (liên cầu)

Hình 2.1: Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm)

theo phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch

Bảng 2.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây xuyên tâm thảo

Dịch chiết

Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch

Escherichia coli

Staphylococcus auresu

Salmonella

Strepto coccus pyogenes

ĐK (mm)

Hoạt tính

ĐK (mm)

Hoạt tính

ĐK (mm)

Hoạt tính

ĐK (mm)

Hoạt tính

ĐK (mm)

Hoạt tính Cặn

Các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo đều là những hỗn hợp phức tạp

chứa các hợp chất khác nhau Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng

Phân lập và tinh chế các chất từ cây xuyên tâm thảo được thực hiện theo sơ đồ 2.1

Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng n-hexan của cây xuyên tâm thảo chúng tôi đã thu được 4 hợp chất sạch dùng để xác định

cấu trúc hoá học bao gồm: 1ancol no mạch dài, 1steroit và 2 xanthon Từ dịch chiết etylaxetat phân lập được 2 xanthon sạch

2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan của cây xuyên tâm thảo (C H)

Lấy 5g cặn chiết n-hexan đem tách trên cột silicagel pha thường có cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm, rửa giải cột bằng hệ dung môi clorofom: n-hexan theo tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 -100% clorofom Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5÷10 ml/ phân đoạn) Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng = 254 nm -365 nm, phun thuốc thử vanilin 1 % - H2SO4 10% trong dung dịch etanol, sấy 5 phút trên 100o

C hoặc thử bằng hơi iod, hơi amoniac, sau đó quan sát màu Các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi thu được 4 chất sạch bao gồm 1ancol no mạch dài (CH.1), 1 steroit (CH.2) và 2 xanthon (CH.3, CH.4)

2.4.1.1 Ancol no mạch dài nonacosan-1-ol (CH.1)

Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan : clorofom theo tỉ lệ (8:2) thu được tinh thể rắn, không màu, có khối lượng 7 mg, Rf A= 0,8, nhiệt độ nóng chảy 84÷850

C

Phổ FT-IR (KBr), νmax (cm-1): 3288,77 (rộng); 2914,58; 2849,00 và 1467,97 Phổ 1

H-NMR (500 MHz, CDCl3 & MeOD),  (ppm): 3,57 (2H, t); 1,54 (2H, t); 0,88 (3H, t); 1,26 đến 1,3 ( 52H, m)

2.4.1.2  - Sitosterol (CH.2)

Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan:clorofom theo tỉ lệ (7: 3) thu được tinh thể hình kim, không màu, có khối lượng 10 mg, Rf B= 0,55 và nhiệt độ nóng chảy 138 ÷ 1400C

Phổ 1

H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 (3H, s, Me-18); 1,01 (3H, s, 19-Me); 2 cụm doublet H tại 0,81 và 0,88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26

và Me-27); 0,83 (3H, t, 7.32 Hz, Me-29); 0,92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3,6 (1H, m, H-3); 5,4 (1H, d, J= 5Hz, H-6)

Phổ 13

C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 140,78 (s, C-5); 121,73 (d, C-6); 71,84 (d, C-3); 56,8 (d, C-14); 56,10 (d, C-17); 50,17 (d, C-9); 45,87 (d, C-24); 42,35 (s, C-13); 42,32 (t, C-4); 39,81 (t, C-12); 37,28 (t, C-1); 36,52 (s, C-10); 36,16 (d, C-20); 31,68 (d, C-8); 31,93 (t, C-7); 33,91 (t, C-2); 29,2 (d, C-25); 28,26 (t, C-16); 26,14 (t, C-23); 24,31 (t, C-15); 21,11 (t, C-11); 18,8 (q, C-26); 19,41 (q, C-19); 19,05 (q, C-27); 18,80 (q, C-21); 11,88 (q, C-29); 11,99 (q, C-18); 23.1 (t, C-28)

2.4.1.3 1-Hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (CH.3)

Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (6:4) thu được khối rắn những tinh thể màu vàng nhạt Khối chất rắn này tiếp tục được tinh chế lại trên cột silicagel cỡ hạt nhỏ 0,040 – 0,063mm, rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (6:4) thu được những tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, có khối lượng 25 mg, RfC= 0,84, nóng chảy ở 148÷1490C Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm-1): 3084,61 yếu; 2951,53; 2841,58; 1661,15; 1601,35; 1489,48

PHổ 1

H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 3.86 (3H, s); 3,91 (3H, s); 3,99 (3H, s); 6,28 (1H, d, J=1,28); 6,30 (1H, d, J=1,69); 7,13 (1H, d, J =9,19); 7,32 (1H, t) và 13,23 (1- OH)

Phổ 13

C-NMR (125MHz, CDCl3); (δ ppm): 163,79 (C-1); 96,84 (C-2, CH); 166,37 (C-3); 91,97(C-4); 148,86 (C-5); 112,7 (C-6); 149,24 (C-7); 148,86 (C-8); 181,12 (C-9); 104,40(C-10); 157,09 (C-11); 150,96 (C-12); 115,70 (C-13); 55,14 (3- OCH3); 57,13 (7-OCH3) và 61,72 (8-OCH3)