Ở mục 1.3 và 1.4 đề cập đến những nghiên cứu hoá thực vật của chi
Canscora đã chỉ ra tính đa dạng về thành phần hoá học của chúng bao gồm: Các flavan, tritecpenoit, sterol, poliphenol, cumarin, lacton và xanthon với cấu trúc rất phong phú và đa dạng.
Các thực vật chi Canscora chủ yếu chứa nhóm chất xanthon và các hợp chất này là một loại dược liệu quý có hoạt tính chống oxy hóa cao, nhiều loại xanthon và những dẫn xuất của chúng đã được chứng minh có đặc tính kháng nấm và kháng vi khuẩn, có tác dụng làm giảm cholesterol, bảo vệ tế bào gan, ức chế những tế bào ung bướu. Vì vậy được xem là một loại chất có tác dụng kháng ung thư; Có tác dụng làm gảm đau nên được dùng để điều trị điều trị những chứng đau viêm, làm hạ nhiệt độ cơ thể khi bị sốt; Có tác động kháng dị ứng, rõ rệt nhất là những dị ứng xảy ra trong ruột; Các hợp chất xanthon được xem là “ứng viên tiềm năng” trong việc chữa trị những chứng bệnh Parkinson và Alzheimer [42].
Có nhiều loài thực vật thuộc chi Canscora thường có vị đắng được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian, trong đó có 3 loài được dùng phổ biến nhất là C. decussata, C. diffusa và C. lucidissima.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Loài Canscora diffusa toàn cây được dùng làm thuốc nhuận tràng, bồi bổ thần kinh [36]. Các chất chiết xuất từ loài Canscora diffusa được dùng để chữa các bệnh: Đau đầu, chóng mặt, mất ngủ, suy nhược thần kinh, người làm việc trí óc căng thẳng suy giảm giảm trí nhớ và độ minh mẫn. Hợp chất điffutin (2) tách từ thực vật canscora diffusa có tác dụng chống lại stress, mất ngủ, giảm trí nhớ và độ minh mẫn [32].
Rễ của loài Canscora decussata Schult có những tính chất đắng và bổ. Cây có tác dụng nhuận tràng, bổ thần kinh, trấn kinh, an thần [35]. Ở Ấn Độ dịch cây tươi dùng trị bệnh tâm thần, động kinh, suy nhược thần kinh [30], [35]. Hợp chất mangiferin (40) tách được từ thực vật Canscora decussata
được sử dụng trong mỹ phẩm có tác dụng bảo vệ da chống lại các tia cực tím bức xạ [41], mangiferin nhóm dược lý chữa bệnh da liễu [33], mangiferin được sử dụng trong y học ở nhiều nước trên thế giới như chống oxy hoá, kháng viêm, kháng virus, tăng cường miễn dịch, giảm đau. Thực tế cho thấy, mangiferin có tác động kháng virus Herpes, chống lão hoá tế bào thần kinh, tế bào gan, suy giảm trí nhớ, ức chế chuyển glucogen thành glucozơ, giảm nguy cơ tiểu đường [32].
Các xanthon nhóm thế ở các vị trí 1,3,5,6,7 và 1,3,6,7,8 của khung xanthon phân lập từ Canscora decussata có khả năng chống vi khuẩn lao đặc biệt các xanthon có nhóm OH ở các vị trí 1,3 và 6 hoặc 8 có khả năng chống vi khuẩn lao tốt hơn so với xanthon nhóm thế ở các vị trí khác [26].
Loài Canscora lucidissima Hand-Mazz cây có vị đắng, tính mát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết chỉ thống. Ở Trung Quốc người ta sử dụng làm thuốc chữa ho do phế nhiệt, viêm gan, đau ngực, đau dạ dày, rắn cắn, đòn ngã ứ máu [40], [43].
Y cổ truyền Trung Quốc đã tiến hành thí nghiệm và rút ra kết luận hợp chất 1,6-đihydroxy-3,5-đimethoxy xanthon (30) tách được từ thực vật
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Canscora lucidissima có tác dụng kháng viêm rất tốt [29].
Ở Trung Quốc, tác giả He Q cùng các cộng sự nghiên cứu ba hợp chất xanthon (1-hyđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (11); 1-hyđroxy-3,7,8- trimethoxy xanthon (17) và 1,8 - đihyđroxy - 3,5- đimethoxy xanthon (49) tách từ loài thực vật Canscora lucidissima có tác dụng làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc rối loạn nhịp tâm thất và thời gian phát bệnh, bảo vệ bệnh thiếu máu cơ tim cục bộ gây ra bởi rối loạn nhịp tim, làm giảm tổn thương cơ tim (thí nghiệm nghiên cứu được thử nghiệm trên cơ thể chuột cống) [23], [24].
1.6. Những nghiên cứu và ứng dụng cây xuyên tâm thảo trong nƣớc
Ở Việt Nam hầu như chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo, ngoại trừ một số tài liệu giới thiệu về tác dụng dược lý của cây như: Cây có tác dụng kháng viêm rất tốt được dùng để điều trị viêm gan, vàng da, đau dạ dày, đòn ngã ứ máu, giảm đau, rắn cắn, chữa bệnh tim [40], [43].
Ở nước ta theo kinh nghiệm dân gian, đã từ lâu cây được sử dụng làm thuốc chữa bệnh và một số bài thuốc cụ thể từ cây xuyên tâm thảo là:
1. Chữa đinh nhọt, rắn cắn: Cây tươi một nắm, rửa sạch, giã nát đáp vào nơi sưng đau, vết cắn và thay mới 2 lần/ngày.
2. Đau do va đập (đòn ngã ứ máu): Cây tươi một nắm, giã nát, sao nóng đắp vào chỗ đau và vắt lấy nước cốt hoà với nước sôi để nguội uống 1cốc/ lần, 3 lần/ ngày hoặc ngâm rượi uống 1 ly nhỏ/ 1lần, 3 lần/ ngày, uống sau bữa ăn.
3. Đau bụng kinh, rối loạn kinh nguyệt, máu cam: Cây khô 10-15 gam/ ngày sắc nước uống, nếu cây tươi dùng lượng gấp đôi.
4. Chữa bệnh tim: Cây khô 10-15 gam / ngày đun nước uống hàng ngày mỗi đợt điều trị uống từ 1-2 tháng.
Ngoài ra nhân dân còn dùng cây để sắc nước uống hàng ngày có tác dụng thanh nhiệt, giải độc và khi cơ thể mệt mỏi, ăn uống kém. Liều dùng 10- 15 gam cây khô/ ngày.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 2
PHẦN THỰC NGHIỆM
Cây xuyên tâm thảo là cây thuốc được sử dụng trong y học dân gian Việt Nam để chữa trị một số bệnh như ho do phế nhiệt, thanh nhiệt, giải độc, đinh nhọt, rắn cắn, đau ngực, đòn ngã ứ máu, chữa bệnh tim [38].
Ở nước ta chỉ có một số tài liệu giới thiệu về tác dụng dược lý của cây, còn những hiểu biết về thành phần hoá học của cây này hầu như chưa được nghiên cứu, thậm chí cây xuyên tâm thảo còn chưa có tên trong các sách cây thuốc ở Việt Nam. Vì vậy chúng tôi chọn cây xuyên tâm thảo làm đối tượng nghiên cứu.
Nhiệm vụ của luận văn là phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số chất trong cây xuyên tâm thảo thu hoạch ở Cao Bằng bằng các phương pháp vật lý, hoá học hiện đại.
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1.Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu.
Nguyên liệu để nghiên cứu là toàn bộ cây phần trên mặt đất của thực vật xuyên tâm thảo. Mẫu cây tươi được thu hái vào tháng 10/2009 tại huyện Quảng Uyên tỉnh Cao Bằng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật đã được TS. Lê Ngọc Công (khoa Sinh trường Đại học sư phạm Thái Nguyên) giám định có tên khoa học là Canscora lucidissima Hand – Mazz. Ngoài ra còn có tên gọi theo địa phương là xuyên rim, xuyên tim.
Bộ phận mẫu được hong khô ở nơi thoáng mát, sau đó sấy ở nhiệt độ 500C- 600C tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng, dịch chiết được thu gom lại và cất cô bằng máy cất quay với áp suất giảm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, xác định khối lượng cặn chiết thu được. Sau đó thêm nước vào cặn rồi lần lượt chiết bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự: n-hexan, etyl axetat, n-butanol. Phần còn lại là cặn tiếp tục được cô cạn rồi hòa tan vào metanol. Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 600C dưới áp suất thấp, thu được các cặn thô.
Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần như nhau, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp hoặc tách trên sắc ký cột lặp lại nhiều lần v.v... để được chất tinh khiết.
Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm.
2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết cây xuyên tâm thảo
Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây xuyên tâm thảo chúng tôi phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm:
- Sắc kí lớp mỏng (SKLM). - Sắc kí cột thường.
- Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.
2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các tính chất vật lý đặc trưng như: Màu sắc, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy v.v... khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR), các kỹ thuật phổ một chiều (1D-NMR) và phổ hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ, hoá chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng hay dùng trong phân tích đều phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA).
Sắc kí cột được tiến hành trên cột với chất hấp phụ silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 – 0,063 mm)
Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được.
Các hệ dung môi triển khai SKLM:
STT Hệ dung môi Tỷ lệ thể tích Kí hiệu
1 n-Hexan - EtOAc (9:1) hệ A
2 n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ B
3 n-Hexan - EtOAc (1 : 1) hệ C
4 Clorofom - MeOH (9 : 1) hệ D
5 Clorofom - MeOH (5 :1) hệ E
Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng
= 254 nm – 365 nm, phun thuốc thử vanilin 1% - H2SO4 5% trong dung dịch etanol, sấy ở trên 100oC hoặc thử bằng hơi iođ, amoniac, sau đó quan sát màu để phát hiện các hợp chất.
Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai theo biểu thức: Chiều dài di chuyển chất thử
Rf =
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam). - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (khoa Hoá trường Đại học sư phạm Thái Nguyên) dưới dạng viên nén KBr.
- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, DMSO.
- Phổ ESI-MS (Phổ khối với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD (Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam)
2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo
2.3.1. Thu nhận các dịch chiết
Mẫu cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết được cất loại dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50-600
C dưới áp suất thấp. Cặn dịch chiết metanol sau khi thêm nước được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, n-butanol, metanol. Các dịch chiết phân đoạn, được làm khô bằng Na2SO4 khan, sau đó cất đến hết hoàn toàn dung môi ở áp suất giảm, thu được các cặn chiết tương ứng.
Việc thu nhận các dịch chiết và phân lập các chất từ cây xuyên tâm thảo được tiến hành theo sơ đồ 2.1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết và phân lập các chất từ cây xuyên tâm thảo
( Canscora lucidissima Hand - Mazz )
Mẫu khô nghiền nhỏ
Cặn n- hexan (C.H) Cặn tổng metanol CH.1 Etylaxetat 1. MeOH
2. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm
+ H2O
Lắc chiết phân đoạn
n-hexan Sắc kí cột Sắc kí cột n-butanol Cặn Etylaxetat (C.E) Cặn n- butanol (C.B) CH.2 CH.3 CH.4 E1 E2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 600C dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng không đổi.
Như vậy từ cây xuyên tâm thảo sẽ có 3 loại cặn chiết được ký hiệu là: C. H C. E C. B
C.H: Cặn chiết n- hexan C.E: Cặn chiết etylaxetat
C.B: Cặn chiết n -butanol của cây xuyên tâm thảo.
Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo được nêu trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ các phân đoạn cây xuyên tâm thảo
Mẫu thu vào tháng 10/2009
Khối lượng mẫu khô (g)
Khối lượng cặn chiết thu được (g)
C. H C. E C. B (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Toàn bộ phần trên
mặt đất của cây 850 15,0 18,0 10
2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết
2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất steroit
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml clorofom - lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính các steroit và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhyđric acetic + 1ml clorofom để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 (đậm đặc). Lấy 1ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính.
2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch thuốc thử Wagner, nếu có nhiều kết tủa là phản ứng dương tính.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit.
2.3.2.4. Phát hiện các cumarin
Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính.
Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin.
2.3.2.5. Định tính các glycozit tim
Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1. Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ