BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH BÙI THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NA (ANNONA SQUAMOSA L.) VÀ CÂY DỦ DẺ TRÂU (MELODORUM FRUTICOSUM LOUR ) THUỘC HỌ NA (ANNONACEAE) Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 62 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2014 Công trình hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Chuyên đề Hữu cơ, khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Đình Thắng PGS TS Ping Chung Kuo Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: vào hồi phút, ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin & Thư viện Nguyễn Thúc Hào – Trường Đại học Vinh MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Thực vật nước ta đa dạng phong phú, số liệu thống kê gần thực vật bậc cao nước ta cho biết có 13.000 loài, đến năm 2002 biết có 2.270 chi 305 họ có khoảng 4.000 loài sử dụng làm thuốc [9], 600 loài cho tinh dầu [6] Đây nguồn tài nguyên thiên nhiên quý báu đất nước Hiện nay, có nhiều nghiên cứu thực vật mà chủ yếu nghiên cứu hóa thực vật Theo thống kê cho thấy, có khoảng 80% dân số giới tin vào y học cổ truyền để chăm sóc sức khoẻ Trong thập kỉ qua, có gần 121 sản phẩm thuốc tạo nên dựa kiến thức y học truyền thống từ nguồn khác [106] Có nhiều sản phẩm thuốc tạo trực tiếp dẫn xuất tổng hợp bắt chước theo khung từ sản phẩm thiên nhiên [9] Nhiều bệnh nhân mắc bệnh nan y đặc biệt ung thư chữa khỏi nhờ sử dụng sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên [41] Đặc biệt 20 năm trở lại đây, hợp chất thiên nhiên sử dụng rộng rãi có hiệu sản xuất thực phẩm chức năng, bổ sung dinh dưỡng hay thực phẩm thuốc sản phẩm nâng cao sinh lực, phòng hỗ trợ điều trị bệnh tật, nâng cao tuổi thọ [8] Chính thế, việc nghiên cứu hợp chất thiên nhiên để làm thuốc chữa bệnh vô quan trọng sử dụng loại thuốc có nguồn gốc từ hoá tổng hợp gây tác dụng phụ làm cho môi trường ngày ô nhiễm hơn, loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên hạn chế nhược điểm Trong việc xác định cấu trúc chúng khâu then chốt việc giải mã chế tương tác thuốc với tác nhân gây bệnh Ở Việt Nam, thuốc sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm, có khoảng 20-30% số loài xác minh khoa học giá trị, chế chữa bệnh dùng để chữa bệnh thông thường: cảm sốt, cảm lạnh, cầm máu, làm lành vết thương, ăn uống khó tiêu, bong gân…, số bệnh nan y như: tim mạch, gan, thận, thần kinh, dị ứng,…Trong số công bố gần 920 loài thuốc có khả điều trị 64 loại bệnh chứng theo cách cổ truyền [4] Các họ Na nói chung thuộc chi Na chi Dủ dẻ nói riêng, có giá trị kinh tế cao, không dùng để làm cảnh, số loài ăn ngon mà sử dụng nhiều thuốc y học dân tộc hoạt tính sinh học đáng quý chúng Ngoài ra, số có mùi thơm đặc biệt nên dùng ngành hương liệu Trên giới có nhiều công trình nghiên cứu na, Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều Còn dủ dẻ trâu, báo cáo khiêm tốn, Việt Nam chưa tìm thấy công trình nghiên cứu loài Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học loài giúp đánh giá giá trị nguồn tài nguyên thiên nhiên nước ta Kết nghiên cứu loài mang lại ý nghĩa to lớn ngành dược liệu Chính ưu điểm thế, nhận thấy cần thiết để nghiên cứu thành phần hóa học Với lí quan trọng nêu thực luận án với tên “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học na (Annona squamosa L.) dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) thuộc họ Na (Annonaceae) Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu Với lí nêu trên, xác định mục tiêu nghiên cứu luận án gồm nội dung sau: - Xác định thành phần hóa học cấu trúc hợp chất phân lập từ na dủ dẻ trâu - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án na (Annona squamosa L.) thuộc chi Na (Annona) dủ dẻ trâu (Melodrum fruticosum Lour.) thuộc chi Dủ dẻ (Melodorum), hai loài thuộc họ Na (Annonaceae) Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu nghiên cứu đặt ra, xác định nhiệm vụ cần thực gồm: - Lựa chọn dung môi thích hợp để chiết hỗn hợp hợp chất từ na dủ dẻ trâu - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất từ cao thu từ na dủ dẻ trâu - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập Những đóng góp luận án Đây công trình khoa học báo cáo thành phần hóa học hoạt tính sinh học chất phân lập từ na (Annona squamosa L.) dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) lần Việt Nam - Đã phân lập xác định cấu trúc 05 hợp chất ent-kauran 02 hợp chất steroit Trong đó, có hợp chất ent-kauran ditecpenoit lần phân lập từ loài na - Từ dịch chiết dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) phân lập xác định 01 hợp chất amit thơm mới, 08 hợp chất flavonoit, 01 hợp chất ancaloit, 01 hợp chất tannin, 02 hợp chất steroit Ngoại trừ 02 hợp chất steroit, hợp chất lại hợp chất lần phân lập từ loài dủ dẻ - Xác định thông số cấu trúc tinh thể hợp chất amit thơm Các số liệu tinh thể học hợp chất (CCDC 872 187) lưu trữ Trung tâm liệu Cambridge - Trong số hợp chất ent-kauran ditecpenoit phân lập từ na có hợp chất lần báo cáo hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) Có ba hợp chất phân lập từ dủ dẻ trâu lần nghiên cứu hoạt tính kháng viêm dựa khả ức chế tạo thành O2- cho bạch cầu trung tính phản ứng với formyl-Lmethionyl-L-leucyl-L-phenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB) Bố cục luận án Luận án gồm 124 trang với 24 bảng số liệu, 23 hình sơ đồ với 144 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (27 trang), phương pháp thực nghiệm (14 trang), kết thảo luận (60 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang) tài liệu tham khảo (16 trang) Ngoài có phần phụ lục gồm 114 phổ hợp chất (62 trrang) liệu tinh thể học melodamit A (6 trang) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan na (Annona squamosa L.) dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) trình bày với mục gồm: - Đặc điểm thực vật - Thành phần hoá học - Sử dụng hoạt tính CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết tách Sử dụng dung môi thích hợp để chiết hỗn hợp chất từ cao metanol trích từ na dủ dẻ trâu 2.2.2 Sắc kí lớp mỏng Thực mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm Phát chất đèn tử ngoại bước sóng 254 nm màu với iot 2.2.3 Sắc kí cột Sử dụng phương pháp sắc kí cột thông thường với pha tĩnh silica gel 70-230/mesh sắc kí cột pha đảo RP-18 2.2.4 Kết tinh phân đoạn Phương pháp kết tinh phân đoạn dùng để làm hợp chất thu phân đoạn sắc kí 2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc Sử dụng phương pháp phổ chứng minh cấu trúc gồm phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), phổ khối (ESI-MS, HR-ESIMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY), X-ray đo độ quay cực riêng 2.2.6 Phương pháp thử hoạt tính sinh học - Hoạt tính gây độc tế bào tiến hành phòng Công nghệ Sinh học, Viện hóa học Hợp chất Thiên nhiên, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Hoạt tính kháng viêm tiến hành trường Đại học Cheng Kung, Đài Loan 2.3 Thu hái mẫu thực vật Mẫu na (Annona squamosa L.) thu hái Đồng Tháp vào tháng 8/2010 dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) thu hái Huế vào tháng 5/2009, hai mẫu thực vật PGS TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học tiêu lưu giữ khoa Sinh-Trường Đại học Vinh 2.4 Kết nghiên cứu chiết tách xác định cấu trúc thành phần hóa học na 2.4.1 Chiết tách cao Lá na (10 kg) - Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol Cao metanol (786 g) - Phân bố nước - Chiết với hexan, etyl axetat, butanol Cao hexan (287 g) Cao etyl axetat (358 g) Dịch nước Cao butanol (145 g) Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách cao từ na 2.4.2 Phân lập chất Cao etyl axetat (358g) CC, silica gel CHCl3:CH3OH (50:1; 30:1; 20:1; 10:1; 4:1) F-1 (44 g) (*) ASE3 (349 mg) ASE5 (294 mg) ASE6 (125 mg) F-2 (95 g) F-3, -4 (**) ASE1 (1027 mg) F-5 ASE2 (246 mg) F-6 F- ASE7 (342 mg) ASE4 (328 mg) (*): CC, silica gel; CHCl3: CH3OH (30:1, 20:1; 10:1; 4:1; 2:1) (**): CC, silica gel; CHCl3: CH3OH (25:1, 15:1; 10:1; 4:1; 2:1) Sơ đồ 2: Quy trình phân lập chất từ cao etyl axetat na 2.5 Kết nghiên cứu chiết tách xác định cấu trúc thành phần hóa học dủ dẻ trâu 2.5.1 Chiết tách cao Lá dủ dẻ (9,8 kg) - Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol Cao metanol (716 g) Cao hexan (38 g) Cao etyl axetat (267 g) Cao butanol (192 g) Sơ đồ 3: Quy trình chiết tách cao từ dủ dẻ trâu 2.5.2 Phân lập chất 2.5.2.1 Cao hexan Cao hexan (38 g) CC, silica gel hexan : axeton (9:1, 5:1, 3:1, 1:1) F-1 F-2 (3 g) F-3 F-4 F-5 F6 CC, silica gel hexan: axeton (9:1) MFH2 (321mg) Sơ đồ 4: Quy trình phân lập chất từ cao hexan dủ dẻ trâu 2.5.2.2 Cao etyl axetat Cao etyl axetat (267 g) CC, silica gel hexan:axeton (19:1, 12:1, 7:1, 3:1, 1:1) F-1 F-2 F-3 F-4 F-5 F-7, -8 F-6 (14,2 g) F-9 (35,7 g) CC, silica gel hexan:axeton (19:1) MFE3 (52 mg) F-10 (15,9 g) CC, silica gel hexan:axeton (15:1, 10:1, 7:1, 5:1) MFE1 (99 mg), MFE4 (70 mg), MFE5 (71 mg), MFE7 (35 mg) CC, silica gel hexan:axeton (7:1) MFE6 (58 mg) Sơ đồ 5: Quy trình phân lập chất từ cao etyl axetat dủ dẻ trâu 2.5.2.3 Cao butanol Cao butanol (192 g) CC, silica gel CHCl3:MeOH ( %, %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 100 %) F-1 F-2 F-3 (5,0 g) F-4 (18,6 g) F-5 F -6 F-7 (30,6 (10,4 g) F-8, F-9, F -10 g) CC, silica gel CC, silica gel CHCl3:CH3OH CC, silica gel CHCl3:CH3OH CC, silica gel CHCl3:CH3OH:H2O CHCl3:CH3OH:H2O (9:1:0,05) (4:1:0,05) (19:1) (15:1) MFB8 (39 mg) MFB10 (87 mg) MFB11 (14 mg) MFB12 (45 mg) MFB13 (97 mg) MFB9 (12 mg) Sơ đồ 6: Quy trình phân lập chất từ cao butanol dủ dẻ trâu ...Công trình hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Chuyên đề Hữu cơ, khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Đình Thắng... lại đây, hợp chất thiên nhiên sử dụng rộng rãi có hiệu sản xuất thực phẩm chức năng, bổ sung dinh dưỡng hay thực phẩm thuốc sản phẩm nâng cao sinh lực, phòng hỗ trợ điều trị bệnh tật, nâng cao... ngành hương liệu Trên giới có nhiều công trình nghiên cứu na, Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều Còn dủ dẻ trâu, báo cáo khiêm tốn, Việt Nam chưa tìm thấy công trình nghiên cứu loài Vì vậy, việc nghiên