Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) và cây Nhó đông (Morinda longissima Y.Z. Ruan)

MỞ ĐẦU Cây Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignya trimera (Oliv.) Guill., thuộc họ Cam chanh (Rutaceae). Cây phân bố ở tỉnh Khánh Hòa và tỉnh Ninh Thuận. Đã từ lâu đời, người dân tỉnh Khánh Hòa sử dụng cao sắc nước của thân rễ, rễ của cây Xáo tam phân để để chữa trị các bệnh về gan, đặc biệt là xơ gan cổ trướng và ung thư gan. Cây Nhó đông có tên khoa học là Morinda longissima Y. Z. Ruan, thuộc họ Cà phê (Rubiaceae). Cây phân bố ở Sơn La, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam. Đồng bào Thái tỉnh Sơn La sử dụng thân rễ và rễ cây để giải độc gan, chữa bệnh vàng da và chữa các bệnh viêm gan và xơ gan. Trước năm 2013 ở nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân. Cây Nhó đông mới có một số công trình bước đầu đánh giá tác dụng của cao chiết trên thực nghiệm. Do đó, việc nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học theo định hướng bảo vệ gan của hai loài cây thuốc quí trên là hoàn toàn cấp thiết và có tính thực tiễn. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân (Paramignya trimea (Oliv.) Guill.) và cây Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan)”. Đề tài có mục tiêu nghiên cứu theo định hướng đánh giá tác dụng bảo vệ gan và xác định các thành phần hóa học chính để bước đầu làm sáng tỏ tác dụng chữa bệnh gan của thân rễ cây hai thuốc Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) – họ Cam chanh (Rutaceae) và Nhó đông (Morinda longissima Y.Z. Ruan) thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) ở Việt Nam. Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành nghiên cứu theo các nội dung sau: ▪ Sàng lọc tác dụng kháng virus viêm gan B trên in vitro và tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột gây độc gan bằng paracetamol của các cao chiết và phân đoạn của thân rễ loài Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) và thân rễ loài Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan).

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY XÁO TAM PHÂN

(PARAMIGNYA TRIMERA (Oliv.) Guill.) VÀ CÂY NHÓ ĐÔNG

(MORINDA LONGISSIMA Y Z Ruan)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội – 2020

Trang 2

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Paramignya 3

1.2 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Morinda 11

1.3 Khái quát về các phương pháp thử hoạt tính sinh học trong luận án 23

1.3 1 Khái quát về mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên động vật 23

1.3.2 Khái quát về mô hình kháng viêm gan virus B trên in vitro 26

1.4 Giới thiệu sơ lược về đối tượng nghiên cứu 30

1.4.1 Cây Xáo tam phân 30

1.4.2 Cây Nhó đông 31

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất 34

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 34

2.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học 35

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 38

3.1 Đánh giá tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn 38

3.2 Phân lập các hợp chất từ loài Xáo tam phân 38

3.3 Phân lập các hợp chất từ thân rễ loài Nhó đông 42

3.4 Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch 48

CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN KẾT QUẢ 49

4.1 Sàng lọc tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn 49

4.1.1 Sàng lọc tác dụng kháng virus viêm gan B in vitro 49

4.1.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên in vivo của cao chiết thân rễ Xáo tam phân 52

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Xáo tam phân 56

4.2.1 Hợp chất PT-1: ostruthin 58

4.2.2 Hợp chất PT-2 (chất mới): ninhvanin 61

4.2.3 Hợp chất PT-3: 6-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran 64

4.2.4 Hợp chất PT-4: citrusinine-I 65

4.2.5 Hợp chất PT-5 (chất mới): paramitrimerol 67 4.2.6 Hợp chất PT-6: 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7-hydroxycoumarin 70

Trang 3

4.2.7 Hợp chất PT-7 (chất mới): ninhvanin B 72

4.2.8 Hợp chất PT-8 (chất mới): paratrimerin A 75

4.2.9 Hợp chất PT-9 (chất mới): paratrimerin B 80

4.2.10 Hợp chất PT-10: parabacunoic acid 85

4.3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Nhó đông 89

4.3.1 Hợp chất ML-1: Damnacanthal 91

4.3.2 Hợp chất ML-2: Lucidin-ω-methyl ether 92

4.3.3 Hợp chất ML-3: Soranjidiol 94

4.3.4 Hợp chất ML-4: Morindone-5-methyl ether 95

4.3.5 Hợp chất ML-5: Rubiadin 97

4.3.6 Hợp chất ML-6: Rubiadin-3-methyl ether 98

4.3.7 Hợp chất ML-7: Damnacanthol 100

4.3.8 Hợp chất ML-8: Morindone 102

4.3.9 Hợp chất ML-9: 1-hydroxy-2-methyl-6-methoxy anthraquinone 103

4.3.10 Hợp chất ML-10: Morindone-6-methyl ether 105

4.3.11 Hợp chất ML-11: Morindone-6-O-β-Gentiobioside 106

4.3.12 Hợp chất ML-12: Lucidin-3-O-β-Primeveroside 108

4.3.13 Hợp chất ML-13 (chất mới): morinlongoside A 110

4.3.14 Hợp chất ML-14 (chất mới): morinlongoside B 114

4.2.15 Hợp chất ML-15 (chất mới): morinlongoside C 115

4.3.16 Hợp chất ML-16: Geniposidic acid 120

4.3.17 Hợp chất ML-17: 3-O-[β-D-Xylopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosyl](3R)-l-octen-3-ol 121

4.3.18 Hợp chất ML-18: Acteoside 124

4.3.19 Hợp chất ML-19: Cistanoside-E 126

4.3.20 Hợp chất ML-20: Ethyl-β-D-Galatopyranoside 128

4.3.21 Hợp chất ML-21: Isoacteoside 129

4.3.22 Hợp chất ML-22: Quercetin 130

4.4 Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch 132

4.4.1 Đánh giá tác dụng kháng virus viêm gan B của các hợp chất sạch từ cây Xáo tam phân và Nhó đông 132 4.4.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của hợp chất ostruthin và ninhvanin từ thân rễ cây

Trang 4

Xáo tam phân 135

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 140

Trang 5

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Cây Xáo tam phân (Ảnh Nguyễn Mạnh Cường) 33

Hình 2 2 Cây Nhó Đông (Ảnh Nguyễn Mạnh Cường) 33

Hình 4 1 Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ thân rễ cây Xáo tam phân 57

Hình 4 2 Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-1 59

Hình 4 3 Tương tác HMBC của hợp chất PT-1 59

Hình 4 4 Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-2 62

Hình 4 5 Phổ HMBC của hợp chất PT-2 63

Hình 4 6 Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-5 68

Hình 4 7 Tương tác HMBC và NOESY của hợp chất PT-5 68

Hình 4 8 Tương tác trong phổ COSY, HMBC, và NOESY của hợp chất PT-6 70

Hình 4 10 Tương tác COSY, NOESY và HMBC của hợp chất PT-7 73

Hình 4 12 Tương tác COSY, NOESY và HMBC của hợp chất PT-8 78

Hình 4 14 Một số tương tác trong phổ COSY, HMBC và NOESY của PT-9 82

Hình 4 15 Phổ1H-NMR của hợp chất PT-10 86

Hình 4 16 Một số tương tác chính trong phổ 2Dcủa hợp chất PT-10 87

Hình 4 17 Phổ 1H NMR của hợp chất ML-13 111

Hình 4 18 Phổ 1H -NMR của hợp chất ML-14 115

Hình 4 19 phổ 1H-NMRcủa hợp chất D-glucose 116

Hình 4 20 Phổ tương tác HMBC của hợp chất ML-15 119

Hình 4 21 Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào gan ở độ phóng đại 200X 139

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4 1 Kết quả thử gây độc tế bào HepG2.2.15 49

Bảng 4 2 Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện HBsAg 50

Bảng 4 3.Ảnh hưởng của cao metanol và cao nước lên nồng độ aminotransferase huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=6) 52

Bảng 4 4.Ảnh hưởng của cao metanol và cao nước lên nồng độ cholesterol toàn phần huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=6) 53

Bảng 4 5 Khối lượng gan chuột ở các lô thí nghiệm 54

Bảng 4 6 Quan sát hình thái trực quan gan chuột ở các lô thí nghiệm 55

Bảng 4 7 Số liệu phổ hợp chất PT-1 60

Bảng 4 14 Bảng số liệu phổ hợp chất PT-8 78

Bảng 4 15 So sánh dữ kiện phổ của hợp chất PT-8 với hợp chất bisparadin 79

Bảng 4 18 Số liệu phổ hợp chất ML-1 91

Bảng 4 25.Số liệu phổ hợp chất ML-8 102

Trang 7

Bảng 4 39.Kết quả thử gây độc tế bào HepG2.2.15 132

Bảng 4 40 Kết quả mức độ biểu hiện HBsAg của các hợp chất sạch 133

Bảng 4 41 Giá trị IC50 làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg của các mẫu nghiên cứu 134

Bảng 4 42 Ảnh hưởng của hợp chất ostruthin và ninhvanin lên nồng độ aminotransferase huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (PRA) (n=6) 136

Bảng 4 43 Ảnh hưởng của hợp chất ostruthin và ninhvanin lên nồng độ cholesterol toàn phần huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=6) 137

Bảng 4 44 Khối lượng gan chuột ở các lô thí nghiệm 137

Bảng 4 45.Quan sát hình thái trực quan gan chuột ở các lô thí nghiệm 138

Trang 8

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3 1 Phân lập các hợp chất từ cao metanol loài Xáo tam phân 40

Sơ đồ 3 2 Phân lập các hợp chất từ cao nước của loài Xáo tam phân 40

Sơ đồ 3 3 Qui trình phân lập các hợp chất từ cao etanol thân rễ cây Nhó đông 44

Sơ đồ 3 4 Phân lập các hợp chất từ cao nước thân rễ cây Nhó đông 46

Trang 9

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Các phương pháp phổ

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

Chemical Ionization Mass Spectrometry

Phổ khối ion hóa hóa học

Electron Spray Ionization

δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học

br broad

t triplet

dd double doublet

m multiplet Sinh học:

carcinoma

Tế bào ung thư gan người

cell line HepG2

Tế bào ung thư gan người dòng HepG2.2.15

Trang 10

AST Aspartate Transaminase Men gan AST

Antigen

kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B

Antigen

kháng nguyên e của virus viêm gan B

sóng 450nm

50%

Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

Các ký hiệu khác:

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

tetrazolium thử hoạt tính độc tế bào

Trang 11

MỞ ĐẦU

Cây Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignya trimera (Oliv.) Guill.,

thuộc họ Cam chanh (Rutaceae) Cây phân bố ở tỉnh Khánh Hòa và tỉnh Ninh Thuận Đã từ lâu đời, người dân tỉnh Khánh Hòa sử dụng cao sắc nước của thân rễ,

rễ của cây Xáo tam phân để để chữa trị các bệnh về gan, đặc biệt là xơ gan cổ trướng và ung thư gan

Cây Nhó đông có tên khoa học là Morinda longissima Y Z Ruan, thuộc họ

Cà phê (Rubiaceae) Cây phân bố ở Sơn La, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam Đồng bào Thái tỉnh Sơn La sử dụng thân rễ và rễ cây để giải độc gan, chữa bệnh vàng da

và chữa các bệnh viêm gan và xơ gan

Trước năm 2013 ở nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân Cây Nhó đông mới có một số công trình bước đầu đánh giá tác dụng của cao chiết trên thực nghiệm Do đó, việc nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học theo định hướng bảo vệ gan của hai loài cây thuốc quí trên là hoàn toàn cấp thiết và

có tính thực tiễn

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần

hóa học và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân (Paramignya trimea (Oliv.) Guill.) và cây Nhó đông (Morinda longissima Y Z Ruan)”

Đề tài có mục tiêu nghiên cứu theo định hướng đánh giá tác dụng bảo vệ gan

và xác định các thành phần hóa học chính để bước đầu làm sáng tỏ tác dụng chữa

bệnh gan của thân rễ cây hai thuốc Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) – họ Cam chanh (Rutaceae) và Nhó đông (Morinda longissima Y.Z Ruan)

thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) ở Việt Nam

Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành nghiên cứu theo các nội dung sau:

▪ Sàng lọc tác dụng kháng virus viêm gan B trên in vitro và tác dụng

bảo vệ gan trên mô hình chuột gây độc gan bằng paracetamol của các cao chiết và

phân đoạn của thân rễ loài Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) và thân rễ loài Nhó đông (Morinda longissima Y Z Ruan)

Trang 12

▪ Nghiên cứu thành phần hóa học của các cao chiết và phân đoạn có

hoạt tính từ thân rễ hai loài Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) và loài Nhó đông (Morinda longissima Y Z Ruan)

▪ Sàng lọc hoạt tính kháng virus viêm gan B trên in vitro và tác dụng

bảo vệ gan trên mô hình chuột gây độc gan bằng paracetamol của một số hợp chất phân lập được

Trang 13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Paramignya

Chi Paramignya thuộc họ Cam chanh (Rutaceae) gồm khoảng 15 loài cây thân

gỗ nhỏ, dạng dây leo có nguồn gốc từ phía nam và đông nam châu Á và ở miền bắc nước Úc [1]

Các loài trong chi Paramignya thường là dạng cây gỗ trườn, có gai mọc ở lá

nách Lá dạng kép một lá, mép lá nguyên, có nhiều tuyến tinh dầu Cụm hoa mọc ở lách ná, hoa lưỡng tính màu trắng Đài bốn đến năm thuỳ thuỳ dính nhau ở gốc thành hình chén.Tràng hoa có bốn hoặc năm cánh, tiền khai lợp Bộ nhị có tám đến mười nhị, chỉ nhị rời nhau, bao phấn thuôn dài Cuống bầu ngắn, các lá noãn dính nhau hoàn toàn, bầu ba đến năm ô, mỗi ô một đến noãn Quả mọng, hình cầu hoặc trứng, không có long hình túi mọng nước (tép), vỏ quả dày, điểm tuyến dày đặc, có

từ một đến năm hạt Hạt to dẹt hai bên, vỏ hạt mỏng, phồng lên [1]

Theo phân loại thực vật học trên cơ sở dữ liệu thực vật học (theplantlist.org),

chi Paramignya bao gồm 30 loài Trong số 30 loài, hiện chỉ có hai loài được chấp nhận tên khoa học (accepted) là P confertifolia Swingle và P rectispinosa W G

Craib Hiện nay, cả bốn loài được nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng

sinh học (P monophylla, P griffithii, P trimera, P scandens), cùng với 22 loài

khác đều chưa được chấp nhận tên khoa học (unresolved) trên cơ sở dữa liệu này

Hiện nay, mới có 4 loài được nghiên cứu về thành phần hóa học ở các mức

độ khác nhau Trong đó, có 01 loài thu ở Sri Lanka (P monophylla), 01 loài ở Thái Lan (P griffithii) và 02 loài ở Việt Nam (P trimera, P scandens) Các lớp chất

chính thuộc chi này gồm chủ yếu là các coumarin, triterpene, alcaloid và các dẫn xuất glycoside Cho đến nay có khoảng 85 hợp chất tự nhiên đã được phân lập ra từ

chi Paramignya, bao gồm mười tám coumarin (1–18), mười lăm tirucallan và

saponin tirucallan (19–33), chín ancaloit (34–42), mười một flavanon (43-53) và một số hợp chất khác (54–85), cùng với một số đánh giá về tác dụng sinh học của

chúng [2 -29] (Bảng 1.2)

Bảng 1 1 Danh mục các hợp chất phân lập từ chi Paramignya

stt Hợp chất Loài Bộ phận Tác dụng sinh học Tài liệu

Trang 14

monophylla

rễ chống tiểu đường [8], [9], [5]

11

6-(7-Hydroperoxy-3,7-

dimethylocta-2,5-dienyl)-7-hydroxycoumarin

Trang 15

alcaloids

thư, chống tiểu đường

[8, 3]

Trang 16

[8, 3]

[8]

thư

[3]

Trang 17

hydroxy-3,7,8,3′,4′-pentamethoxyflavone

52 5,7,8,3′,4′-pentamethoxyflavone P trimera thân - [16]

53 5,7,8,4′-tetramethoxyflavone P trimera thân - [16]

Các hợp chất khác

68 Lignin glycoside syringaresinol

di-O-β-dglucopyranoside

Trang 18

71 methyl protocatechuate P trimera thân - [19]

75 methyl trans-p-coumarate P trimera thân - [19]

76 methyl trans-ferulate P trimera thân - [19]

77 methyl trans-sinapate P trimera thân - [19]

79 5-O-methylanisocoumarin B P trimera thân - [19]

Các coumarin 1–18 từ chi Paramignya được tìm thấy nhiều nhất trong hai

loài P monophylla và P trimera (bảng 1.2) Các coumarin của chi Paramignya

thường ở dạng tự do Cấu trúc hóa học chung của các coumarin này là vòng coumarin hai lần thế ở vị trí 6, 7 (hình 1.1) Về mặt tác dụng sinh học, các coumarin này có phổ hoạt tính khá rộng bao gồm hoạt tính gây độc tế bào, kháng viêm, kháng

Trang 19

tiểu đường và chống trầm cảm Đặc biệt, hợp chất coumarin ostruthin (3) được phân

lập từ loài P trimera có nhiều tác dụng sinh học quí như chống ung thư, kháng

viêm, giảm tiểu đường và chống trầm cảm [4, 6, 7] (Bảng 1.2)

Hình 1.1 Cấu trúc các hợp chất coumarin từ chi Paramignya

Tirucallane và saponin tirucallane

Các nghiên cứu hóa thực vật về chi Paramignya cho thấy sự xuất hiện của

các hợp chất điển hình với cấu trúc tirucallane và saponin tirucallane 19–33 (bảng

1.2), bao gồm bảy tirucallanes 19-25 được phân lập từ quả, lá và thân loài P

monophylla [11, 12], tirucallane 26 được phân lập từ thân cây loài P grithii [13] và

bảy saponin tirucallane từ 27–33 từ thân và lá của loài P scandens [14, 15] Trong

đó, các saponin tirucallane là lớp chất đặc trưng về mặt hóa học chỉ tìm thấy được ở

loài P scandens mà chưa tìm thấy ở các loài khác thuộc chi Paramignya Về mặt

tác dụng sinh học, các hợp chất saponin tirucallan này có tác dụng gây độc tế bào và kháng viêm [14, 15]

Trang 20

Alcaloid

Hiện có, chín hợp chất alcacoid 34 - 42 (bảng 1.2), tất cả đều được tìm thấy

trong các loài P trimera [3, 8] Các hợp chất 34 – 36, 38 - 42 đều thể hiện tác dụng

ức chế enzym α-glucosidase [8]

Flavonoid

Từ chi Paramignya hiện có mười một hợp chất flavonoid 43-53 đã được phân

lập (bảng 1.2) [13,12,16] Các hợp chất flavonoid này được tìm thấy chủ yếu ở thân

loài P grithii và lá cây loài P scandens và năm hợp chất flavonoid được tìm thấy trong thân loài Xáo tam phân P trimera

Các hợp chất khác

Các hợp chất khác được tìm thấy trong chi Paramignya bao gồm các phenol,

các chromen và các hợp chất glycosid (bảng 1.2) Đặc biệt, các hợp chất phenol

được tìm thấy nhiều nhất trong thân rễ loài P trimera Về mặt tác dụng sinh học,

các hợp chất 61 và 63 đã được chứng minh khả năng ức chế enzym α-glucosidase

[8]

Tác dụng sinh học của cao chiết của chi Paramignya

Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của cao chiết chi Paramignya được tiến

hành theo hướng đánh giá hoạt tính kháng ung thư, hoạt tính bảo vệ gan và hoạt tính kháng tiểu đường

Đánh giá sinh học đầu tiên được thực hiện trên loài P lobata thu ở Singapore

về hoạt tính kháng ung thư Cao chiết metanol của thân loài P lobata đã được

chứng minh ức chế dòng ung thư biểu mô KB với giá trị ED50 100 μg/ml [20]

Cây Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum,

là loài được quan tâm nhiều nhất gần đây về mặt tác dụng sinh học [2,6] Nguyễn

Minh Khởi và cs đã chứng minh cao chiết metanol của rễ loài P trimera không độc,

và chưa xác định được giá trị LD50 Về tác dụng gây độc tế bào ung thư, cao chiết

metanol của rễ loài P trimera cùng phân đoạn hexan và hợp chất ostruthin được

chứng minh gây độc với năm dòng tế bào ung thư gồm Hep-G2, HTC-116, MB-231, OVCAR-8 và dòng tế bào Hela [6] Gần đây, Nguyễn Văn Tặng và cs tiếp tục nghiên cứu thêm tác dụng chống ung thư và tác dụng chống oxi hóa của các cao

Trang 21

MDA-chiết và phân đoạn của loài P trimera [21-25] Cao MDA-chiết metanol của lá và rễ loài

P trimera có khả năng gây độc với 12 dòng tế bào ung thư: MiaPaCa2 (tuyến tụy),

HT29 (đại tràng), A2780 (buồng trứng), H460 (phổi), A431 (da), Du145 (tuyến tiền liệt), BE2-C (u nguyên bào thần kinh), MCF-7 (vú), MCF-10A (vú bình thường),

U87, SJ-G2 và SMA (glioblastoma) [21] Ngoài ra, cao chiết metanol của rễ P

trimera có tác dụng chống oxi hóa mạnh hơn hẳn các cao dùng các dung môi hữu

cơ khác (nước, acetonitril, ethyl acetate và hexane) [25] Hơn nữa, Nguyễn Văn Tặng và cs đã nghiên cứu khảo sát các điều kiện chiết xuất khác nhau cùng với các đánh giá về tác dụng chống oxi hóa nhằm tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao chiết

metanol của rễ loài P trimera [22-25]

Ngoài các tác dụng dược lý về gây độc các dòng tế bào ung thư, tác dụng bảo

vệ gan và tác dụng kháng tiểu đường là một trong số các tác dụng sinh học được quan tâm nghiên cứu gần đây Nguyễn Minh Khởi và cs (2013) đã sử dụng mô hình gây độc gan bằng paracetamol (400 mg/kg) ở chuột Swiss, dịch chiết metanol ở liều

10 và 20 g / kg không làm giảm AST, ALT, hoặc bilirubin sau 8 ngày thử nghiệm [6] Năm 2017, Phù Hoàng Đặng và cs đã đánh giá thêm hoạt tính ức chế alpha-

glucosidase của dịch chiết metanol của rễ P trimera [3] Kết quả cho thấy dịch chiết metanol của rễ P trimera có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase khá cao với IC50

giá trị 36,6 μg / mL

1.2 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Morinda

Ngoài nước:

Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa

học của các loài thuộc chi Nhàu (Morinda) như: M citrifolia, M officinalis, M

parvifolia, M coreia, M umbellata ,M parvifolia, M morindoides, M lucida, M elliptica , M coreia, M morindoides, M angustifolia , M pandurifolia Những loài

trên được thu hái ở các nước như Ấn độ, Srilanka, Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia,

Úc, Nhật, v/v Hầu như tất cả các phần của thực vật bao gồm rễ, vỏ, thân, lá và quả của chi Nhàu đã được sử dụng làm thuốc dân gian trong phòng chống vi khuẩn, chống nấm, chống khối u, kháng histamin, giảm đau, chống viêm và tăng cường miễn dịch Sản phẩm nổi tiếng nhất của chi Nhàu được kể đến là nước trái cây noni

(M citrifolia) cụ thể là Tahitian Noni® là một sản phẩm nổi tiếng trên thế giới

Trang 22

[26-27] Về mặt hóa học, các loài thuộc chi Morinda chứa các anthraquinone, iridoid,

este axit béo, saccharide và lignan [28] Khoảng hơn 200 các hợp chất đã được phân

lập và xác định trong chi Morinda Tuy nhiên, thành phần hóa học này khác nhau

tùy thuộc vào bộ phận của cây Các hợp chất anthraquinone và iridoid là các lớp chất chính được tìm thấy trong chi này Các anthraquinone là chủ yếu tìm thấy được

trong rễ của các loài thuộc chi Morinda, trong khi đó, các iridoids được tìm thấy

chủ yếu ở lá Ngoài ra, các flavonoid, coumarin và triterpenoid cũng được tìm thấy

trong các bộ phận khác của các loài này Đặc biệt, loài M citrifolia được quan tâm

nghiên cứu nhiều nhất, bao gồm thực vật học, hóa học và tác dụng dược lý [26-27]

Bảng 1 2 Danh mục các hợp chất phân lập từ chi Nhàu (Morinda L.)

M angustifolia rễ kháng ung thư [41]

M elliptica rễ chống ung thư da [42]

Trang 23

105 Rubiadin-1-methyl ether M lucida Rễ - [29]

M pandurifolia kháng ung thư biểu mô KB [40]

Trang 24

M elliptica rễ chống oxi hóa [39]

M citrifolia Rễ Giảm lượng đường trong máu

trên chuột mắc bệnh tiểu đường

do streptozotocan gây ra

[48]

M citrifolia Rễ Giảm lượng đường trong máu

trên chuột mắc bệnh tiểu đường

Trang 25

151

1-Hydroxy-5,6-dimethoxy-2-methyl-7- primeverosyloxy anthraquinone

Iridoid

M citrifolia nước quả - [50]

154 9-epi-6α-methoxy geniposidic acid M citrifolia quả chống hình thành melanin [49]

155 Scandoside methylester M citrifolia quả chống hình thành melanin [49]

170 Citrifolinin A M citrifolia lá chống ung thư da Leaves UVB-induced AP-1activity [56, 58]

173 Gaertneric acid M morindoides lá hoạt tính chống vi khuẩn [59]

174 Gaertneroside M morindoides lá hoạt tính chống vi khuẩn

Trang 26

M citrifolia quả kháng viêm [43]

M citrifolia lá Chống oxi hóa [56]

197 quercetin 3-O-methyl ether M citrifolia lá Chống oxi hóa [64]

200 quercetin 3,7-O- dimethyl ether M citrifolia lá Chống oxi hóa [64]

206 kaempferol 3,4'-O-dimethyl M citrifolia lá Chống oxi hóa [64]

207 kaempferol 5, 7-O-diarabinoside M citrifolia lá Chống oxi hóa [64]

Một số hợp chất khác

210 3,3'-bisdemethylpinoresinol M citrifolia quả Chống oxi hóa [65]

Trang 27

Các hợp chất anthranquinone

Thành phần hóa học chính của rễ và quả của các loài thuộc chi Morinda là

các anthraquinone Các cấu trúc hóa học của anthraquinones này là gồm hai vòng

thơm kết nối bởi hai cacbon cacbonyl Các anthraquinone của chi Morinda có cấu trúc đa dạng với các nhóm thế khác nhau như alkyl, O - alkyl, nhóm phenolic hoặc methoxy Đặc biệt, Các anthraquinone của chi Morinda có đặc điểm chung là tại vị trí C-1, có hai loại nhóm thế chính là O-methoxy hoặc nhóm hydroxy như thấy ở

Hình 1.2 Các anthraquinone từ chi Morinda

Trang 29

Hình 1.3 Các anthraquinone glycoside phân lập từ chi Morinda

Các iridoid được phân lập từ chi Morinda và hoạt tính sinh học của chúng

được trình bày trong bảng 1.2

Các iridoid phân lập từ các loài thuộc chi Morinda có khung cấu trúc đa

dạng Về mặt cấu trúc, phần lớn các iridoid này chứa monosaccharide liên kết với C- 1 và methyl este hoặc axit cacboxylic ở C-4 Cấu trúc không gian của các iridoid

thường ở dạng cis, ngoại trừ axit geniposidic 9-epi-6α-methoxy (154) có cấu dạng

trans [49] Cấu trúc của vòng trung tâm của iridoids 174 - 186 chủ yếu là dạng

spirolactone [59-61] Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của iridoid cho thấy chúng có tác dụng chống ung thư da, chống oxi hóa, chống chống sốt rét, v/v

Các hợp chất flavonoid

Flavonoid là nhóm chất lớn trong số các hợp chất phenolic, chưa được phát

hiện nhiều ở các loài thuộc chi Morinda Theo bảng 1.4, các hợp chất flavonol

Trang 30

glycosides 189- 208 được phân lập chủ yếu từ lá của loài M citrifolia và có hoạt

tính chống oxy hóa cao

Các hợp chất khác

Các thành phần khác được tìm thấy ra trong chi Morinda các lignan,

glycoside, triterpenoid, v/v Hiện có 6 hợp chất lignan gồm americanol A (209) 3, 3'-bisdemethylpinoresinol (210), americanin A (211), americanoic axit (212),

morindolin (213) và isoprincepin (214) được phân lập từ quả loài Noni (M

citrifolia) và có tác dụng chống oxi hóa tốt [65] Năm 2018, Wen-Jian Liu và cs đã

phân lập được thêm hai hợp chất lignan mới từ quả loài Noni (M citrifolia) là (±) -

morifolia A (215-216) Hai hợp chất lignan mới đều thể hiện hoạt tính kháng viêm

ức chế sản sinh NO tốt hơn cả đối chứng dương quercetin [66] Lần đầu tiên, sáu hợp chất naphthohydroquinones glycoside gồm morindaparvins H–O (217-224) đã

Xiangming Su và cs (2018) phân lập từ phần trên mặt đất của loài M parvifolia

Ở nồng độ 50µM, các hợp chất morindaparvins H–O (217-224) đều thể hiện tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư buồng trứng A 2780 [67] Ngoài ra, một số các hợp chất khác như acid amine, steroid, terpenoid, đường, axid béo… cũng được tìm

thấy từ loài M citrifolia và M officinalis [26, 28]

Trong nước

Ở trong nước, tính đến nay có 06 loài bao gồm: Nhàu lá chanh (M citrifolia),

Ba kích (M officialis), Nhàu lông mềm (M tomentosa), Nhàu tán (M umbellata), Nhàu lá dài (M longifolia), cây Nhó đông (M longissima) đã được nghiên cứu về

mặt hóa học [68-82] Từ 6 loài trên đã phân lập được trên 50 hợp chất, trong đó có 7

hợp chất lần đầu được phát hiện trong tự nhiên

Năm 1999, Đỗ Quốc Việt và cs đã phân lập được hai hợp chất anthraquinone

là damnacanthal (108) và nor-damnacanthal (109) từ thân loài Nhàu lá chanh (M

citrifolia) [68] Từ quả Nhàu lá chanh (M citrifolia), Hoàng Việt Dũng và cs (2012)

đã xây dựng thành công phương pháp định lượng scopoletin (225) bằng HPLC

Trang 31

Năm 2013, trong đề tài nghiên cứu khoa học của Ninh Khắc Bản và cs đã

nghiên cứu thêm thành phần hóa học của 03 loài Nhàu là Nhàu lông mềm (M

tomentosa), Nhàu tán (M umbellata) và Nhàu lá dài (M longifolia) ở Việt Nam

[71-73] Từ lá loài Nhàu Nhàu lông mềm (M tomentosa), các tác giả đã phân lập

được 12 hợp chất trong đó có 2 hợp chất mới là morintoside A(229) , morintoside B (230) và 10 hợp chất đã biết là asperulosidic acid (157), daphylloside (231),

asperuloside (168), dehydroepoxymethoxygaertneroside (232), (1R,6R,9R) trihydroxy-4-megastigmen-3-one, 4-epi-borreriagenin (233), trans-phytol (234), ursolic acid lactone (235), 3β-hydroxyurs-12-en-28-al (236), ursolic acid (237) Cả

6,9,11-mười hai hợp chất trên đều thể hiện có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase, trong

đó hợp chất ursolic acid lactone (235) thể hiện hoạt tính mạnh nhất với khả năng ức

chế là 23,8 % ở nồng độ 50 µM [71] Từ lá và cành loài Nhàu tán (M

umbellata) ở Huế, các tác giả đã phân lập được 05 hợp chất, trong đó có 2 hợp chất

mới là umbellatolide A (238), umbellatolide B (239) và 03 hợp chất đã biết là

deacetylasperulosidic acid (153), 4-epi-borreriagenin (188), 1-C-syringyl-glycerol (240) [72] Từ lá và cành loài Nhàu lá dài (M longifolia) ở Huế, các tác giả đã

phân lập được 05 hợp chất, trong đó có 2 hợp chất mới là longifolide A (241), longifolide B (242) và 03 hợp chất đã biết là cerbinal (243), 5α,8α-epidioxyergosta- 6,22-dien-3β-ol (244), oleanolic acid (245) [73]

Nhó đông là cây thuốc chữa viêm gan ở tỉnh Sơn La, lần đầu tiên được nghiên cứu về thành phần hóa học bởi Nguyễn Duy Thuần và cs (2004) [74-76] Từ

thân rễ loài Nhó đông, đã phân lập được 04 hợp chất gồm scopoletin (246), emodin

(247), 1,3-dihydroxy-4-ethoxy metyl anthraquinone (250), β-sterol (251) [119-121]

Sau đó, Nguyễn Phi Hùng và cs (2017) công bố thêm 21 hợp chất anthraquinone từ thân rễ loài Nhó đông thu ở tỉnh Cao bằng Trong đó có một hợp chất mới là

modasima A (252) [77] Các hợp chất tectoquinone (86), dimethyldioxine-(5’,6’:2,3)-anthraquinone (253) và modasima A (252) được phát

1-methoxy-2’,2’-hiện có tác dụng kháng tiểu đường bằng cách kích hoạt protein AMKP (activated protein kinase) [77]

Tác dụng sinh học của cao chiết chi Nhàu (Morinda)

Các cao của các loài thuộc chi Nhàu (Morinda L.) có phổ hoạt tính khá rộng

bao gồm hoạt tính kháng ung thư, bảo vệ gan, chống oxi hóa, chống loãng xương,

Trang 32

chống tiểu đường, v/v

Tác dụng bảo vệ gan

Năm 2008, M Wang và cs đã chứng minh cao nước quả M citrifolia có tác

dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột Sprague-Dawley gây độc gan bằng CCl4 thông qua đánh giá chỉ số men gan và mô bệnh học [78]

Loài M pubescens là cây thuốc chữa bệnh gout, xương khớp và tiêu chảy ở

Ấn độ Cao etanol quả loài này ở liều 200mg/kg được chứng minh có hoạt tính bảo

vệ gan chống lại những tổn thương do d-galactosamine (d-GaIN) liều 500mg/kg gây

ra trên chuột Wistar Hơn nữa, nhóm tác giả chỉ ra rằng quả loài M pubescens và loài M citrifolia có tác dụng bảo vệ gan tương đương nhau [79]

Ở nồng độ 100mg/kg và 150 mg/kg cao nước và metanol từ lá M tinctoria

được Surendiran và cs (2011) chứng minh tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột Sprague-Dawley gây độc gan bằng paracetamol Kết quả được đánh giá dựa trên mức độ giảm của glutamic pyruvic transaminase (GPT), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), biliburin tổng số, cholesterol tổng số trong huyết thanh của chuột [80]

Tác dụng chống tiểu đường

Năm 2014, Kumaresan và cs đã công bố khả năng hạ đường huyết của cao

etanol của quả loài quả M tinctoria trên mô hình in vitro [81]

Domekouo và cs (2016) đã phát hiện cao chiết thân M lucida ở liều 50 và

500mg/kg có tác dụng kháng bệnh tiểu đường trên mô hình chuột bị gây tiểu đường

bằng streptozotocin Đặc biệt ở liều 500mg/kg, cao chiết thân M lucida có tác dụng

giảm đường huyết tốt hơn cả đối chứng dương glibenclamide ở liều 25mg/kg [82]

Năm 2017, Nitin D Jadhav và cs đã công bố dịch cao nước của loài M

citrifolia (liều 2ml/kg) có khả năng chống bệnh tiểu đường tương đương với thuốc

thương mại metformin (liều 100mg/kg) khi thử nghiệm trên chuột Swistar bị gây tiểu đường bằng alloxan Mô hình được đánh giá trên các chỉ tiêu nồng độ glucose, mức độ tăng triglycerit, lượng cholesterol và hàm lượng HDL và LDL trong máu [83]

Tác dụng chống loãng xương

Năm 2014, Li Ye và cs đã công bố tác dụng chống loãng xương của viên

nang với thành phần chính cao của M officalis cùng với 24 dược liệu khác trên mô

Trang 33

hình chuột cái Sprague-Dawley bị loãng xương và cắt bỏ buồng trứng Kết quả được đánh giá dựa trên các chỉ số nồng độ phosphatase (TRAP), phosphatase kiềm (AKP) và osteocalcin (OC) trong huyết thanh và huyết tương của chuột sau 12 tuần dùng thuốc [84]

Quả Noni (M citrifolia) được dùng để điều trị các bệnh xương khớp Năm

2016, Hussain và cs đã chứng tác dụng chống loãng xương của cao nước quả Noni

trên in vitro Ở nồng độ 200 μg / ml cao nước có tác dụng tăng sinh tế bào xương

BMSC (bone marrow derived mesenchymal stem cells) thông qua các đánh giá các chỉ số phosphatase kiềm (ALP), yếu tố phiên mã (Runx2) và biểu hiện mRNA của Osteocalcin (OCN) [85]

Năm 2018, Jintanaporn Wattanathorn và cs đã phát hiện cao lá M citrifolia

có khả năng chống loãng xương, bảo vệ tế bào thần kinh và chống nghẽn mạch máu lão Thí nghiệm chống loãng xương được tiến hành trên chuột cái Wistar bị gây loãng xương và cắt bỏ buồng trứng, sau 48 ngày dùng cao nước lá Noni với liều 2,

10, 50 50mg/kg, các chỉ số canxi, osteocalcin, và phosphatase kiềm trong máu và mật độ xương trong xương của tăng lên đáng kể [86]

Tác dụng khác

Quả Noni (M citrifolia) là đối tượng được quan tâm đặc biệt về đánh giá tác

dụng sinh học Các nhà khoa học đã công bố quả Noni có nhiều tác dụng như chống ung thư vòm họng, ung thư vú, chống Alzheirmer’s, bảo vệ tim mạch, kháng viêm, phòng tim mạch và bảo vệ tế bào thần kinh v/v [26]

1.3 Khái quát về các phương pháp thử hoạt tính sinh học trong luận án

Trong luận án đã sử dụng các phương pháp thử nghiệm sinh học bao gồm:

(1) mô hình đánh giá tác dụng kháng virus viêm gan B trên in vitro; (2) mô hình bảo

vệ gan trên chuột gây độc gan bằng paracetamol Giới thiệu tổng quan về các phương pháp thử nghiệm được trình bày như sau:

1.3 1 Khái quát về mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên động vật

Gan là cơ quan quan trọng của cơ thể khi đóng vai trò chính trong việc chuyển hóa và đào thải thuốc, các chất độc hại v.v Nhiều loại thuốc khi dùng quá liều, ngay cả khi nằm trong phạm vi điều trị vẫn có thể làm tổn thương đến gan Ngoài ra, gan bị tổn thương có thể do các vi sinh vật như virus gây viêm gan hoặc

Trang 34

do hóa chất Tổn thương gan do thuốc là nguyên nhân của trên 50% sự cố gan cấp tính Hóa chất độc hại gây ra một loạt các tổn thương gan lâm sàng và bệnh lý

Khi gan bị tổn thương, chức năng lọc thải và chuyển hóa – dự trữ đều bị ảnh hưởng, từ đó dẫn đến các bệnh về gan như viêm gan, gan nhiễm mỡ, xơ gan

Khi gan bị tổn thương gan, các tế bào gan bị hoại tử, tăng peroxid hóa lipid, giảm glutathione và tăng ALT, AST, bilirubin, cholesterol, phosphatase kiềm hơn

ba lần giới hạn trên của bình thường [87]

Gan bị tổn thương do thuốc/hóa chất là một trong số các nguyên nhân gây ra các bệnh lý khác nhau về gan Do vậy, các nhà khoa học đã sử dụng các thuốc/hóa chất để gây tổn thương gan trên động vật thí nghiệm để mô phỏng các bệnh lý về gan trên người Tác nhân gây độc gan thường được sử dụng trong nghiên cứu như paracetamol, carbon tetrachlorua (CCl4), acetaminophen, ethanol, D-galactosamine, thioacetamit, tert-butyl hydroperoxit (t-BuOOH) v/v [88] Để đánh giá hoạt tính bảo

vệ gan của các mẫu nghiên cứu, có thể được tiến hành trên động vật thực nghiệm, hay trên các tế bào gan đã được phân lập Hiệu quả bảo vệ gan của các mẫu nghiên cứu được đánh giá bằng các chỉ tiêu sinh hóa như hoạt tính của một số các enzym nội bào của huyết tương và mức độ tổn thương tế bào gan trên vi thể Hiện nay, cả

ba mô hình in vitro, ex vivo và in vivo đều được sử dụng trong các nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Tuy nhiên, trên mô hình in vitro và ex vivo nhiều thông số sinh lý

của gan không được phản ánh và xác thực Trong nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan,

mô hình in vivo được sử dụng rộng rãi Thông qua mô hình này có thể đánh giá, xác

định được khả năng bảo vệ gan, cơ chế bảo vệ gan chống lại các tác nhân gây hại của các mẫu nghiên cứu Động vật thực nghiệm được uống các mẫu nghiên cứu trước hoặc cùng thời điểm với tác nhân gây độc gan Hiệu quả gây độc và bảo vệ gan của các mẫu nghiên cứu được đánh giá bằng các thông số như hoạt tính của các enzym nội bào của huyết tương (ALT, AST), bilirubin, cholesterol, phosphatase kiềm và mô bệnh học của gan [88]

Trên mô hình in vivo, động vật thí nghiệm được gây viêm gan, gan nhiễm

mỡ và xơ gan bằng các thuốc/hóa chất với liều lượng và thời gian khác nhau [89, 90] Sau đây là một số mô hình thí nghiệm:

- Mô hình gây độc gan bằng CCl4: Tùy thuộc vào mức liều gây độc gan và thời gian gây độc có thể gây ra các mức tổn gan như tổn thương gan cấp tính, tổn thương gan

Trang 35

mãn tính và tổn thương gan mãn tính không phục hồi (xơ gan) Động vật thí nghiệm được gây độc bằng CCl4 bằng cách tiêm dưới da hoặc uống dung dịch 50% trong parafin lỏng hoặc dầu oli Sau 24h gây độc ở mức liều 1,25ml/kg, động vật thí nghiệm bị tổn thương gan cấp tính Ở mức liều 1ml/kg hai lần một tuần, sau 8 tuần động vật thí nghiệm bị tổn thương gan mãn tính Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gan gây độc lên 12 tuần, động vật thí nghiệm bị tổn thương gan mãn tính không phục hồi được và đến 24 tuần xuất hiện xơ gan

- Mô hình gây độc gan bằng thioacetamide: thioacetamide ở liều 100mg/kg gây ra tổn thương gan cấp tính sau 48 h gây độc Mức độ gây độc 3 lần trong tuần, sau 11 tuần gây độc bằng thioacetamide ở liều 150mg/kg làm xuất hiện tổn thương gan mãn tính Với liều 300mg/kg, sau 2 đến 4 tháng uống thioacetamide gây ra tổn thương gan mãn tính không phục hồi được và xuất hiện xơ hóa gan

- Mô hình gây độc gan bằng D-galactosamine: Sau 48h gây độc ở mức liều 800mg/kg gây ra tổn thương gan cấp tính trên động vật

- Mô hình gây độc gan bằng paracetamol: paracetamol được dùng gây độc gan cấp tính trên động vật Paracetamol ở liều 800mg/kg gây ra tổn thương gan cấp tính Ở liều cao 3g/kg, gây ra tổn thương gan cấp tính sau 48h gây độc

- Mô hình gây độc bằng clorofoc: colorofoc được gây độc cho gan trên động vật bằng đường hô hấp hoặc tiêm dưới da ở liều 0,4-1,5ml/kg

- Mô hình gây độc gan bằng etanol: etanol được dùng gây độc gan trên động vật bằng đường uống, tùy thuộc vào liều lượng và thời gian gây độc mà dẫn đến mức

độ tổn thương gan và nhiễm mỡ khác nhau Ở một liều duy nhất 1ml/kg gây ra hiện tượng hình thành mỡ trong gan Khi sử dụng etanol 40% ở liều 2ml/100g/ngày trong 21 ngày, gây ra gan nhiễm mỡ

Phần lớn các chất gây độc cho gan đều có liên quan tới sự peroxide hóa lipid màng tế bào gan và các stress oxi hóa Mỗi mô hình tổn thương gan đều có cơ chế đặc hiệu khác nhau [90] Trong đề tài này, chúng tôi đã chọn paracetamol làm tác nhân gây tổn thương gan do sinh ra gốc tự do gây ra peroxy hóa màng tế bào gan Ngoài cơ chế sinh ra gốc tự do tương tự như các tác nhân truyền thống gây độc cấp tính là CCl4, paracetamol còn làm suy kiệt hệ thống chống oxi hóa của cơ thể (hệ thống các chất thiol) Paracetamol sau khi vào cơ thể, một phần bị chuyển hóa bới các cytochrome P450 tạo thành N-acetyl para-benzoquiononimin (NAPQI), một gốc

Trang 36

tự do gây ra peroxy hóa lipid và sinh ra MDA dẫn đến tổn thương các tế bào gan, làm tăng AST, ALT và làm biến đổi cấu trúc gan [91]

Mô hình tổn thương gan bằng paracetamol này lần đầu tiên được xây dựng bởi Mittchen và cs (1973) [92] Cho đến nay, nhiều thiết kế thí nghiệm trên động vật khác nhau đã được xây dựng dựa trên mô hình tổn thương gan bằng paracetamol Đến năm 2012, Pei-Ju Chen và cs đã nghiên cứu tối ưu hóa mô hình gây độc gan bằng paracetamol với dòng chuột nhắt BALB/c, IRC và chuột cống Wistar, SD và ở các mức liều gây độc paracetamol khác nhau Pei-Ju Chen và cs đã chứng minh dòng chuột BALB/c liều gây độc gan tốt nhất là 400 mg/kgP [93]

Trong một công bố của Grirish và cs (2009), các thuốc thương mại (Liv 52, Livergen, Livokin, Octogen, Stimuliv và Tefroliv) đã được đánh giá tác dụng bảo

vệ gan trên mô hình gây độc gan cấp tính trên chuột bằng paracetamol Chuột Swiss được uống các thuốc nghiên cứu liên lục trong 7 ngày, đến ngày thứ 8, chuột được gây độc gan cấp tính bằng một liều duy nhất 500mg/kg và đến ngày thứ 9 chuột được lấy máu xét nghiệm AST, ALT, ALP và quan sát đại thể và vi thể gan [94]

Qua các nghiên cứu trên chúng tôi đã lựa chọn mô hình nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên chuột BALB/c để nghiên cứu các cao chiết và chất sạch như sau: chuột ở tất cả các lô được uống hoạt chất và thuốc cần nghiên cứu liên tục 7 ngày trước và 2 ngày sau khi gây độc cho gan, mỗi ngày cho uống 1 lần vào buổi sáng Ngày thứ 7 sau uống mẫu 1 giờ, nhịn đói 14-16 giờ trước đó, gây độc gan bằng cách cho uống paracetamol với liều paracetamol 400mg/kgP/1 lần duy nhất Sau 48 giờ uống paracetamol, lấy máu làm xét nghiệm hóa sinh chức năng gan qua định lượng aminotransferase (AST, ALT), cholesterol toàn phần và quan sát đại thể và vi thể mô bệnh học của gan

1.3.2 Khái quát về mô hình kháng viêm gan virus B trên in vitro

Viêm gan B là một căn bệnh khá phổ biến ở Việt Nam với khoảng 25% dân

số mắc bệnh Đây là bệnh do một loại siêu virus hướng gan gây ra có tên khoa học

là Hepatitus B Virus (HBV) gây ra Viêm gan B có khả năng lây nhiễm gấp 100 lần

so với HIV, có khả năng lây lan qua đường máu, tình dục và mẹ sang con Viêm gan B nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời sẽ dẫn đến xơ gan và ung thư gan [95]

Trang 37

Về mặt cấu trúc, HBV là một virus hướng gan và là loại virus duy nhất có cấu trúc ADN Hạt virus hoàn chỉnh có cấu trúc hình cầu gồm 3 lớp đó là lớp vỏ bọc bên ngoài (bao ngoài) là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBsAg),

vỏ capsid là một nucleocapsid được cấu tạo từ kháng nguyên lõi (HBcAg) và lớp trong cùng có chứa AND [96]

Về cơ chế gây bệnh, virus HBV vượt qua hệ thống miễn dịch cơ thể và đi vào các tế bào gan Cấu trúc đặc biệt của HBV cho phép xâm nhập và đưa vật liệu

di truyền và sao chép bên trong tế bào gan HBV xâm nhập vào tế bào gan được thực hiện bởi các phân tử protein bề mặt HBsAg Sau khi xâm nhiễm, HBV làm phá hủy cấu trúc của gan, làm xuất hiện các tổn thương gan (tổn thương gan cấp tính, tổn thương gan mãn tính và ung thư gan) [96]

Cho đến nay, việc diệt trừ hoàn toàn vi rút là cực kỳ khó khăn, việc điều trị kháng vi rút hiện nay chỉ nhằm hạn chế sự suy giảm chức năng gan và ung thư gan

và tăng thời gian sống của bệnh nhân Hiện nay, có hai loại thuốc được Cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm Mỹ (FDA) cấp phép điều trị HBV gồm thuốc miễn dịch interferon α (INF-α) và pegylated interferon α (peg-INF-α, một hợp chất do các

tế bào bị nhiễm vi rút sản sinh ra có khả năng ức chế tăng trưởng vi rút), và các hợp chất tương tự nucleotide Tuy vậy, các thuốc này chưa có hiệu quả cao vì tỉ lệ kháng thuốc, phản ứng phụ và giá thành thuốc cao [97]

Từ khi phát hiện virus viêm gan B vào năm 1960, trong suốt những năm qua các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu và phát triển các mô hình đánh giá tác dụng kháng HBV Nhờ các tiến bộ về mặt công nghệ và phương pháp, các nhà

khoa học đã tạo ra hàng loạt các mô hình sàng lọc in vitro để sàng lọc và tìm kiếm

thuốc điều trị HBV Hiện nay trên thế giới có một số nhóm mô hình sàng lọc tác

dụng kháng HBV in vitro: mô hình nghiên cứu dựa trên tế bào gan nguyên phát từ

động vật; mô hình nghiên cứu dựa trên dòng tế bào ung thư gan; mô hình nghiên cứu dựa trên tế bào gan nguyên phát của người và một số mô hình nghiên cứu khác [95]

Các tế bào gan nguyên phát của con người được coi là các tế bào lý tưởng để

nhiễm HBV Tuy nhiên, những tế bào này không ổn định về mặt hình thái trên in

vitro, dễ mất khả năng nhiễm HBV và tỷ lệ lây nhiễm thấp Tương tự, các tế bào

gan của động vật mặc dù hiệu quả lây nhiễm virus viêm gan B cao nhưng lại không

Trang 38

bền Mặt khác, dòng tế bào ung thư gan được dùng khá nhiều trong các nghiên cứu

in vitro Tuy nhiên, dòng tế bào này không cho phép nhiễm HBV Để giải quyết vấn

đề này, các nhà khoa học đã ghép một đoạn gen của virus HBV vào dòng tế bào ung thư gan Sau đó, hàng loạt các dòng tế bào ung thư gan mang bộ gen HBV đã được

tạo ra như HepG2.2.15, HepAD38, HepDE19, HepRG, v/v Mô hình thí nghiệm in

vitro đánh giá tác dụng kháng HBV dựa trên các tiêu chí như ức chế sự tiết ra

HBsAg/HBeAg/HBcrAg, HBV-DNA, cả HBsAg/HBeAg/HBcrAg và HBV-DNA

và ức chế sản sinh HBV theo các con đường khác nhau Chất đối chứng dương thường được sử dụng là lamivudine (một nucleoside) Các cao chiết, hợp chất tiềm

năng sau khi được thử nghiệm sàng lọc in vitro sẽ được thử nghiệm in vivo hoặc

trực tiếp thử trên bệnh nhân viêm gan B [95]

Trong số đó, dòng tế bào HepG2.2.15 được sử dụng trong các nghiên cứu in

vitro nhiều nhất Dòng tế bào HepG2.2.15 tạo ra bằng cách truyền bộ gen HBV vào

tế bào HepG2 [95] Về mặt cấu trúc của tế bào HepG2.2.15 có sự khác biệt rõ ràng

so với dòng tế bào HepG2 và được chỉ ra ở hình 4.1 [98] Dòng tế bào HepG2.2.15 cho phép hỗ trợ sao chép HBV ổn định và biểu hiện protein, cũng như sản xuất các

hạt virus Vì vậy, mô hình in vitro sử dụng dòng HepG2.2.15 là một mô hình lý

tưởng để nghiên cứu sự tương tác của thuốc tới virus HBV

Hình 1.4 Cấu trúc của các tế bào HepG2.2.15 và HepG2 A: Sự biến mất của Filmaia trong các tế bào HepG2.2.15 (EM × 2500); B: virut trong tế bào chất của tế bào HepG2.2.15 Mũi tên chỉ virus (EM × 15 000); C: Mũi tên chỉ ra ty thể bị thoái hóa (EM × 25 000); D: Xuất hiện nhiều Filmaia xung quanh các tế bào HepG2 Mũi tên chỉ filmaia (EM × 2500); E: Sự xuất hiện của vi sợi trong filmaia trong các tế bào HepG2 Mũi tên chỉ microfilament (EM × 25 000); F: Các bào quan trong tế bào chất của tế bào HepG2 (EM × 25 000) [98]

Trang 39

Trong quá trình xâm nhiễm HBV vào tế bào gan, HBsAg là protein đóng vai trò quan trọng trong việc vượt qua hàng rào miễn dịch của cơ thể và giải phóng virus vào trong tế bào gan Do vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế chất kháng nguyên bề mặt HBsAg là một liệu pháp ức chế sản sinh HBV [99] Các nhà khoa học đã phát hiện ra thuốc từ dược liệu có tác dụng điều trị HBV thông qua khả năng ức chế HBsAg của chúng

Năm 1996, Huang và cs đã phát hiện ra hợp chất osthole chiết xuất từ rễ cây

Angelica pubescens có khả năng ức chế mạnh sự tiết ra HBsAg trên in vitro

Osthole ở nồng độ 5-20g/ml có khả năng ức chế sự tiết ra HBsAg trong tế bào G2 và Huh-7 trong khoảng 23,5 đến 60,5% sau 3 ngày và 18,4 đến 70,1% sau 6 ngày [100]

MS-Năm 1997, 19 cặn chiết từ thực vật đã được Mehdi và cs tiến hành sàng lọc tác dụng kháng HBV Một số cặn chiết cho thấy khả năng ức chế sự tiết ra HBsAg

trên 50% trong tế bào HepG2.2.15 như cặn chiết Clerodendrum inerme (họ Verbenaceae) và Clematis sinensis (họ Ranunculaceae) với khả năng ức chế tương

ứng là 85% và 60% [101]

Năm 2005, hợp phần flavons của loài Oenanthe javanica đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự tiết ra HBsAg trên mô hình in vitro và in vivo Trên tế bào HepG2.2.15, hợp phần flavons của loài Oenanthe javanica ở nồng độ 2,28g/l

ức chế mạnh HBsAg và HBeAg Trên mô hình vịt con nhiễm HBV, hợp phần

flavons của loài Oenanthe javanica (liều 1 g/kg) làm giảm 54,3% và 64,5% nồng

độ HBV-DNA sau 5 ngày và 10 ngày điều trị [102]

Năm 2007, Wu và cs đã phát hiện hợp chất quercetin-3- O -galactoside phân lập từ hoa loài Abelmoschus manihot có hoạt tính kháng HBV thông qua mô hình in

vitro và in vivo Trên in vitro, quercetin-3- O -galactoside có tỷ lệ phần trăm ức chế

HBsAg và HBeAg của tế bào HepG2.2.15 tương ứng là 86,41% và 82,27% Trên in

vivo, quercetin-3- O -galactoside (liều 0,1g/kg) có tác dụng làm giảm 60,79% vào ngày 10 và 69,78% vào ngày 13 nồng độ HBV-DNA trong huyết thanh vịt con nhiễm HBV sau điều trị [103]

Năm 2013, Huang và cs đã công bố nhựa của loài Ficus awkeotsang có tác dụng ức chế HBV trên in vitro Nhựa của loài Ficus awkeotsang có tác dụng làm

Trang 40

giảm 80% mức độ biểu hiện HBsAg trong hai dòng tế bào Hep3B và Huh-7 mang

bộ gen HBV [104]

Năm 2017, Cui và cs đã chứng minh hợp chất luteolin-7-glucoside phân lập

từ loàiLatuca satica có tác dụng kháng HBV trên in vitro Luteolin-7-glucoside làm

giảm sự tiết ra HBsAg của tế bào HepG2.2.15 và HepAD38 mang bộ gen HBV [105]

Baicalin là một flavone glycoside, được chiết xuất từ rễ của Scutellaria

baicalensis Georgi Hai Huang và cs (2017) công bố tác dụng ức chế nhân lên của

HBV trên dòng HepG2.2.15 của baicalin thông qua ức chế HBsAg, HBeAg và HBV-DNA [106]

Năm 2018, một anthraquinone mới (-) - 1,2,4,5-tetrahydroxy-7 - ((2 R ) hydroxypropyl) anthracene-9,10-dione được phân lập từ loài nấm Penicillium sp,

-2-có tác dụng ức chế HBV trên dòng HepG2.2.15 mạnh hơn cả đối chứng dương

lamivudin thông qua đánh giá hàm lượng HBsAg và HBeAg [107]

Như vậy, qua các công trình nghiên cứu chúng ta thấy được tiềm năng thuốc điều trị HBV của các cao chiết và hợp chất từ dược liệu Mặt khác, Việt Nam có nguồn cây thuốc chữa bệnh gan phong phú Việc bước đầu nghiên cứu đánh giá tác

dụng kháng viêm gan virus B in vitro của hai cây thuốc Xáo tam phân và Nhó đông

là việc làm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

1.4 Giới thiệu sơ lược về đối tượng nghiên cứu

1.4.1 Cây Xáo tam phân

Tên khoa học: Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum

Tên đồng nghĩa: Atalantia trimera Oliv., 1861; Triphasia monophylla DC., 1824; Severinia trimera Oliv., Luvunga monophylla (DC.) Mabb

Tên Việt Nam:Xáo tam phân, Cây thần dược, cây rễ mọi, cây rễ lạ, cây thần

xạ

Công dụng: Người dân xã Ninh Vân, tỉnh Khánh Hòa dùng thân rễ cây để tăng cường và bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị xơ gan cổ trướng và ung thư gan

Phân bố và sinh thái: Cây gỗ nhỏ, bụi leo hay trườn, thân dài tới 4-5 m; có gai

nhọn, hơi cong hay ngang, dài 0.4-1.2 cm Lá mọc so le Phiến lá đơn, dày, hình bầu dục thuôn, kích thước khoảng 2.3-5 x 1,8-2 cm; đỉnh lá có khía nhỏ, gốc lá tròn, mép lá có khía ở phía trên; mặt trên xanh đậm, mặt dưới nhạt và bóng, có 8-10 đôi

Định dạng
Số trang	166
Dung lượng	4,04 MB