Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.)

MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Nấm là sinh vật không thể thiếu trong đời sống, không có nấm, chu trình tuần hoàn vật chất sẽ bị mất một mắt xích quan trọng trong việc phân hủy chất bã hữu cơ. Nấm là nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lượng chất béo ít và đó là những axit béo chưa bão hòa, giá trị năng lượng cao, giàu khoáng chất và các vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe con người. Ngoài ra, trong nấm còn chứa nhiều hoạt chất có tính sinh học, góp phần ngăn ngừa và điều trị bệnh cho con người. Ngày nay các nhà khoa học đang nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài nấm và phát hiện một số hoạt chất có dược tính mạnh đối với các căn bệnh nan y như viêm gan, ung thư, HIV.. Việc đưa vào sử dụng rộng rãi các chế phẩm được tách chiết từ nấm sẽ giúp con người khỏe mạnh và phòng chống được nhiều căn bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm. Trong khi đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam. Đến năm 2010, có khoảng 2500 loài nấm đã được ghi nhận cho lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn [3, 4, 9]. Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên rất đáng kể về nhiều mặt, có khoảng 50 loài là nấm ăn quý như: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), Nấm chàm (Boletus aff. felleus Bull.), Nấm bào ngư (Pleurotus spp.), Nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), Nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), Nấm kim châm (Flammulina velutipes) ... [4, 6]. Có khoảng hơn 200 loài nấm dùng làm dược liệu, trong đó có rất nhiều loài là dược liệu quý như: linh chi một năm (G.lucidum), linh chi sò (G.capense); cổ Linh chi (G.applanatum), nấm vân chi (Trametes versicolor), nấm phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), mộc nhĩ, ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)… [8]. Những nghiên cứu bước đầu về các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như polysaccharit, polysaccharit-peptit, lectin, các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như các flavonoit, steroit, terpenoit… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, tim mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả năng sinh enzym và một số hoạt chất quý có thể được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường. Các loài nấm độc ở Việt Nam cũng khá phong phú, những nghiên cứu bước đầu đã chỉ ra danh lục của hơn 30 loài. Trong số các loài nấm độc của Việt Nam, nhóm nguy hiểm nhất là các loài gây ngộ độc chết người như: nấm độc xanh đen (Amanita phalloides), nấm độc tán trắng (Amanita verna), nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa)... đã gây ra rất nhiều vụ ngộ độc, đặc biệt là ở các vùng núi nơi có nhiều đồng bào các dân tộc thiểu số sinh sống. Một số loài nấm độc khác gây ngộ độc thần kinh, tiêu hóa, gây ảo giác khác cũng rất nguy hiểm, như: nấm ruồi, nấm độc đỏ (Amanita muscaria), nấm độc nâu (Amanita pantherina), nấm độc rỉ sắt, nấm phân … [8]. Nghệ An là tỉnh có vườn Quốc gia Pù Mát, khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt. Đây là những vùng được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm… Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam nói chung và Nghệ An nói riêng vẫn còn là một vấn đề khá mới, chưa nhận được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học. Do vậy, việc nghiên cứu về nấm ở Nghệ An là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn quan trọng, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên của nước ta nói chung và tỉnh Nghệ An nói riêng. Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung Bộ”. 2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết từ loài nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung Bộ. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ các loài nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.). - Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất. - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được. 4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 40 0 C. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm. - Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên các pha đảo và pha silica gel. - Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: Cấu trúc hoá học các hợp chất được phân lập được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, 1 H- 1 H COSY, HSQC và HMBC đã được sử dụng. - Cấu trúc lập thể tương đối và tuyệt đối của các hợp chất này được xác định bằng các phản ứng hoá học và các phương pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY . - Thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư, kháng viêm và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. 5. Những đóng góp mới của luận án Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học quả thể nấm nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), quả thể nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở Việt Nam, chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau: 1. Từ dịch chiết quả thể nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria) đã phân lập và xác định cấu trúc 9 hợp chất: - 07 hợp chất triterpenoit: hexagonin A, hexagonin B, hexagonin C, hexagonin D, hexagonin E; hexatenuin A; axit ursolic. Trong đó hexagonin A, hexagonin B, hexagonin C, hexagonin D, hexagonin E là các hợp chất mới.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ NÂM TỔ ONG LÔNG THÔ

(HEXAGONIA APIARIA (PERS.) FRIES), LOÀI NẤM LINH CHI (GANODERMA PFEIFFERI BRES.) VÀ NẤM LINH CHI ĐEN BÓNG (GANODERMA MASTOPORUM (MONT)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

VINH- 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ NÂM TỔ ONG LÔNG THÔ

(HEXAGONIA APIARIA (PERS.) FRIES), LOÀI NẤM LINH CHI (GANODERMA PFEIFFERI BRES.) VÀ NẤM LINH CHI ĐEN BÓNG (GANODERMA MASTOPORUM (MONT)

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN ĐÌNH THẮNG

PGS TS PING CHUNG KUO

Vinh - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Vinh, ngày 15 tháng 07 năm 2015

Ký tên

LỜI CẢM ƠN

Luận án được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu cơ - khoa Hoá, phòng thí nghiệm Trung tâm Phân tích thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh, Viện Hoá học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, khoa Công nghệ sinh học, Đại học quốc gia Formosa, khoa Hóa-Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS TS Trần Đình Thắng - Trường Đại học Vinh, PGS TS Ping-Chung Kuo-Đại học quốc gia Formosa (Đài Loan) là người những thầy đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất, giúp tôi từng bước trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Hoa Du, PGS TS Hoàng Văn Lựu

đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận án Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn GS TS Tian-Shung Wu-Đại học Quốc gia Cheng-Kung, Đài Loan giúp đánh giá kết quả

PGS TS Ngô Anh khoa Sinh, Đại học Khoa học Huế giúp định danh mẫu nấm Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các phòng ban chức năng, các thầy cô, cán bộ khoa Đào tạo Sau đại học, khoa Hoá học Trường Đại học Vinh, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Vinh, ngày 15 tháng 07 năm 2015

Nguyễn Thị Bích Ngọc

MỤC LỤC

1.1.1 Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm linh chi 5 1.1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ nấm linh chi

Chương 2: Phương pháp và thực nghiệm 30

2.1.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 30

2.5.1 Thu mẫu 44 2.5.2 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các họp chất phân lập được 45

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 3.1 Các hợp chất được tách ra từ loài nấm tổ ong lông thô 50

Bảng 3.17: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng viêm 104

Bảng 3.18: Các hợp chất được tách ra từ nấm linh chi đen bóng 105

Bảng 3.19: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM1 106 Bảng 3.20: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM2 107 Bảng 3.21: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM3 108 Bảng 3.22: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM5 110 Bảng 3.23: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM6 111 Bảng 3.24: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM7 112 Bảng 3.25: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM8 113 Bảng 3.26: Tác dụng ức chế của hợp chất từ nấm linh chi đen bóng 114

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 3.10: Phổ khối lượng HR-ESI-MS của hợp chất HAM2 59

Hình 3.22: Phổ HSQC của hợp chất HAM3 68

Hình 3.25: Công thức phân tử HMBC của hợp chất 4 72

Hình 3.32: Công thức phân tử HMBC của hợp chất HAM5 77

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1 Phân lập các hợp chất từ nấm tổ ong lông thô 34

Sơ đồ 2.2 Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi 43

Sơ đồ 2.3 Phân lập các chất từ quả thể nấm linh chi đen bóng 49

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry (Sắc ký khí-khối phổ liên hợp)

CC: Column Chromatography (Sắc kí cột)

FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh)

TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng)

HPLC: High Performance Liquid Chromatography(Sắc ký lỏng cao áp)

IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)

EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron)

ESI-MS: Electron Spray Ionzation-Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phun mù electron)

HR-ESI-MS: High Relution-Electron Spray Impact Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phân giải cao phun mù electron)

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

s: singlet

br s: singlet tù

t: triplet

d: dublet

dd: dublet của duplet

dt: dublet của triplet

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Nấm là sinh vật không thể thiếu trong đời sống, không có nấm, chu trình tuần hoàn vật chất sẽ bị mất một mắt xích quan trọng trong việc phân hủy chất bã hữu cơ Nấm là nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lượng chất béo ít và đó

là những axit béo chưa bão hòa, giá trị năng lượng cao, giàu khoáng chất và các vitamin

có tác dụng tốt cho sức khỏe con người Ngoài ra, trong nấm còn chứa nhiều hoạt chất

có tính sinh học, góp phần ngăn ngừa và điều trị bệnh cho con người

Ngày nay các nhà khoa học đang nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài nấm và phát hiện một số hoạt chất có dược tính mạnh đối với các căn bệnh nan y như viêm gan, ung thư, HIV Việc đưa vào sử dụng rộng rãi các chế phẩm được tách chiết từ nấm sẽ giúp con người khỏe mạnh và phòng chống được nhiều căn bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm

Trong khi đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam Đến năm 2010, có khoảng 2500 loài nấm đã được ghi nhận cho lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn [3, 4, 9]

Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên rất đáng kể về nhiều mặt, có

khoảng 50 loài là nấm ăn quý như: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), Nấm chàm (Boletus aff felleus Bull.), Nấm bào ngư (Pleurotus spp.), Nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), Nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), Nấm kim châm (Flammulina velutipes)

[4, 6] Có khoảng hơn 200 loài nấm dùng làm dược liệu, trong đó có rất nhiều loài là

dược liệu quý như: linh chi một năm (G.lucidum), linh chi sò (G.capense); cổ Linh chi (G.applanatum), nấm vân chi (Trametes versicolor), nấm phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), mộc nhĩ, ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)… [8]

Những nghiên cứu bước đầu về các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như polysaccharit, polysaccharit-peptit, lectin, các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như các flavonoit, steroit, terpenoit… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch,

hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, tim

mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả năng sinh enzym và một số hoạt chất quý có thể được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường

Các loài nấm độc ở Việt Nam cũng khá phong phú, những nghiên cứu bước đầu đã chỉ ra danh lục của hơn 30 loài Trong số các loài nấm độc của Việt Nam, nhóm nguy

hiểm nhất là các loài gây ngộ độc chết người như: nấm độc xanh đen (Amanita phalloides), nấm độc tán trắng (Amanita verna), nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) đã gây ra rất nhiều vụ ngộ độc, đặc biệt là ở các vùng núi nơi có nhiều đồng

bào các dân tộc thiểu số sinh sống Một số loài nấm độc khác gây ngộ độc thần kinh,

tiêu hóa, gây ảo giác khác cũng rất nguy hiểm, như: nấm ruồi, nấm độc đỏ (Amanita muscaria), nấm độc nâu (Amanita pantherina), nấm độc rỉ sắt, nấm phân … [8]

Nghệ An là tỉnh có vườn Quốc gia Pù Mát, khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt Đây là những vùng được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm…

Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam nói chung và Nghệ An nói riêng vẫn còn là một vấn đề khá mới, chưa nhận được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học Do vậy, việc nghiên cứu về nấm ở Nghệ An là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn quan trọng, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên của nước ta

nói chung và tỉnh Nghệ An nói riêng Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Phân lập

và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô

(Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung

Bộ”

2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết từ loài nấm tổ ong lông thô

(Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung Bộ

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ

các loài nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont)

Pat.)

- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất

- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được

4 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 400C Việc

xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm

- Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: đã sử dụng các

phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên các pha đảo và pha silica gel

- Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: Cấu trúc hoá học các hợp chất được phân lập được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1

H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã được sử dụng

- Cấu trúc lập thể tương đối và tuyệt đối của các hợp chất này được xác định bằng các phản ứng hoá học và các phương pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY

- Thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư, kháng viêm và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

5 Những đóng góp mới của luận án

Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học quả thể nấm nấm tổ ong lông

thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), quả thể nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.)

và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở Việt Nam, chúng tôi

đã thu được một số kết quả như sau:

1 Từ dịch chiết quả thể nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria) đã phân lập và

xác định cấu trúc 9 hợp chất:

- 07 hợp chất triterpenoit: hexagonin A, hexagonin B, hexagonin C, hexagonin

D, hexagonin E; hexatenuin A; axit ursolic Trong đó hexagonin A, hexagonin B,

hexagonin C, hexagonin D, hexagonin E là các hợp chất mới

- 02 hợp chất sterol: ergosterol, ergosterol peroxit Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này

- Sáu hợp chất hexagonin A, hexagonin B, hexagonin C, hexagonin D, hexagonin

E, hexatenuin A đều có khả năng kháng viêm

2 Từ dịch chiết quả thể nấm linh chi (G pfeifferi.) phân lập được 6 hợp chất:

- 03 hợp chất triterpenoit: axit 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic;

ganodermadiol; axit 7-oxo-ganoderic Z;

- 03 hợp chất sterol: ergosterol, ergosterol peroxit, cerevisterol

- Hợp chất ergosterol có khả năng ức chế sự tạo thành NO trong khoảng nồng độ 2,5-20 μg/mL, với IC50 là 19,61 μg/mL

3 Từ dịch chiết quả thể nấm linh chi đen bóng (G mastoporum (Mont) Pat.)

phân lập được 8 hợp chất:

- 03 hợp chất triterpenoit: Δ1-lupenon, ganodermanondiol, lucidumol B;

- 05 hợp chất sterol: ergosta-7,22-dien-3β-ol; ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on; ergosterol peroxit; ergosta-7,22-dien-3-on; 3β,5-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-on;

- Các hợp chất Δ1 –lupenon, ganodermanondiol, lucidumol B, 3b-ol, ergosta -4,6,8(14),22-tetraen-3-on, ergosterol peroxit, ergosta -7,22-dien-3-on; 3β,5-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-on có khả năng ức chế sự sản sinh các

ergosta-7,22-dien-anion superoxit trên bạch cầu trung tính của người theo cơ chế tác động liên quan đến

sự ức chế con đường dẫn truyền tín hiệu của p38 MAPK

6 Cấu trúc của luận án

Luận án bao gồm 135 trang với 26 bảng số liệu, 39 hình và 3 sơ đồ với 150 tài liệu tham khảo Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phương pháp và thực nghiệm (20 trang), kết quả và thảo luận (69 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (14 trang) Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 60 phổ của một số hợp chất chọn lọc

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Ganoderma (linh chi)

1.1.1 Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm linh chi

Các loại nấm thuộc chi Ganoderma (đặc biệt là G lucidum) đã được sử dụng

trong y học cổ truyền phương Đông để điều trị và phòng ngừa một số bệnh như ung thư, cao huyết áp, viêm phế quản mãn tính, bệnh hen suyễn, thuốc bổ và thuốc an thần [78] Gần đây, đã có các chế phẩm thực phẩm chức năng làm từ sợi nấm, quả thể và

bào tử của G lucidum đã có trên thị trường nhằm bổ sung vào chế độ ăn uống hỗ trợ

điều trị kháng u, tăng khả năng miễn dịch và khả năng chống oxi hóa [91, 132, 137]

Thị trường thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ G lucidum ước tính doanh thu

khoảng 5-6 tỷ USD/năm, trong đó thị trường Hoa Kỳ tiêu thụ khoảng 1,6 tỷ USD

[154] Một số loài khác như G tsugae, G applanatum, G colossum, G concinna, G pfeifferi… cũng có tác dụng hỗ trợ điều trị và chăm sóc sức khỏe con người [47, 52,

71, 78, 91, 96, 154]

Điểm đặc biệt có ở nhóm nấm này là màng bào tử đảm 2 lớp - một dấu hiệu di truyền nổi bật, cho nên nhiều nhà khoa học đề nghị xếp chúng thành một họ độc lập là họ Linh chi (Ganodermataceae Donk) Nấm linh chi (Ganoderma) mọc trên cây gỗ sống hay

đã chết, thích hợp ở nhiệt độ thấp từ 21- 260C, ở các vùng đồi núi cao trên 1000m so với mực nước biển, như các vùng ở Tam Đảo, Pù Mát, Thừa Thiên Huế, Trường Sơn gặp nhiều vào mùa mưa (từ tháng 5 -11) [3, 8, 10, 11, 14]

Các loài nấm Linh chi được phát hiện ở Việt Nam khá sớm Dựa theo màu sắc

mũ nấm, y học phương Đông phân biệt 6 loại linh chi với tên gọi tương ứng: linh chi trắng (bạch chi hay ngọc chi), linh chi vàng (hoàng chi hay kim chi), linh chi xanh (thanh chi hay long chi), linh chi đỏ (xích chi hay hồng chi), linh chi tím (tử chi), Linh chi đen (Hắc chi hay huyền chi) Ngoài ra, còn có nhiều cách phân loại khác [10, 11,

12, 14, 16]

Ganoderma là chi nấm dược liệu Trong hơn 40 năm, các nhà khoa học đã nghiên

cứu thành phần hóa học của các loài nấm thuộc chi này, đã phân lập được 431 các hợp chất chuyển đổi bậc hai Cấu trúc của các hợp chất chuyển đổi bậc hai phân lập được bao gồm: (a) các hợp chất lanostan chứa 30 nguyên tử cacbon (axit ganoderic), (b) các hợp chất lanostan chứa 30 nguyên tử cacbon (andehyt, ancol, este, glycosit, lacton,

xeton), (c) các hợp chất lanostan chứa 27 nguyên tử cacbon (axit lucidenic), (d) các hợp chất lanostan chứa 27 nguyên tử cacbon (ancol, lacton, este), (e) các hợp chất lanostan chứa 24, 25 cacbon (f) các hợp chất triterpen pentacyclic chứa 30 cacbon (g) meroterpenoit, (h) farnesyl hydroquinon (meroterpenoit), (i) C15 các sesquiterpenoit, (j) các steroit, (k) các alkaloit, (l) prenyl hydroquinon, (m) các benzofuran, (n) các dẫn xuất

của benzopyran-4-on và (o) dẫn xuất của benzenoit G lucidum là loài được nghiên cứu

sâu và rộng về thành phần các hợp chất chuyển hóa bậc hai và hoạt tính sinh học Ngoài

ra, một số loài đã được nghiên cứu như G applanatum, G colossum, G sinense, G cochlear, G tsugae, G amboinense, G orbiforme, G.resinacem, G hainanense, G concinna, G pfeifferi, G.neojaponicum, G tropicum, G australe, G carnosum, G fornicatum, G applanatum, G mastoporum, G theaecolum, G boninense, G capense và G annulare

1.1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học đuợc phân lập từ nấm linh chi (Ganoderma lucidum)

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) là loài được nghiên cứu nhiều nhất của họ

Ganodermataceae Donk Loài nấm này được đặt tên linh chi Nhật Bản hay ling-zhi ở Trung Quốc, đã được biết đến từ thời cổ đại và đã được đề cập trong cuốn sách y khoa nổi tiếng Thần nông bản thảo (viết trong thời Đông Hán) và Bản thảo cương mục (viết

vào khoảng năm 1590 AC) Nấm linh chi (G lucidum) được dùng để điều trị nhiều loại

bệnh như: viêm gan, tăng cholesterol máu, tiểu đường, ung thư, suy giảm miễn dịch, giảm bạch cầu, xơ vữa động mạch, bệnh trĩ, mệt mỏi mãn tính, mất ngủ và chóng mặt

do suy nhược thần kinh, viêm phế quản và cao huyết áp [24, 45, 49, 56, 89, 115, 147]

Nấm linh chi (G lucidum) là chứa một lượng lớn các hợp chất đa dạng về cấu

trúc và hoạt tính sinh học Hầu hết các chất chuyển hóa bậc hai có hoạt tính sinh học

được phân lập từ G lucidum bao gồm hai nhóm chính: lanosterol (axit ganoderic và các

dẫn xuất của chúng) và các polysaccarit [35, 103] Ngoài ra, loài nấm này còn chứa các

peptit có khối lượng phân tử thấp và các protein có hoạt tính sinh học đa dạng [118,

121, 134]

Dịch chiết nước của G lucidum đặc biệt hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển

của ung thư ác tính có nguồn gốc từ mô mềm Còn các dịch chiết không phân cực là không có khả năng này, chúng có hoạt tính mạnh chống sự oxi hóa lipit, cũng như thu gom hydroxyl và các gốc tự do [67, 89]

1.1.2.1 Lanostanoit tritecpenoit

Các hợp chất triterpenoit được phân lập từ nấm linh chi (Ganoderma) có kiểu khung lanosterol Cho đến nay, có hơn 431 triterpenoit khác nhau được phân lập từ các phân đoạn không phân cực của dịch chiết nấm linh chi (Ganoderma) Hầu hết đều là dẫn xuất lanosterol với mức độ oxy hoá cao có dược tính như axit ganoderic, ganoderiol, axit ganolucidic, lucidon và axit lucidenic [35]

-CH3 -COOH

26 β-OH -H α-OH β-OMe Δ7-4

hình như axit ganodermic S (1) và R (2)

Năm 1982, Kubota T và cộng sự phân lập được axit ganoderic A (3) và B (4) từ

dịch chiết cloroform của quả thể nấm G.lucidum [74] Kể từ đó, các chất dẫn xuất

lanosterol mới từ nấm được phát hiện liên tục cho đến ngày hôm nay

Toth J và cộng sự (1983) [126] phân lập được 6 lanostanoit: axit ganoderic T

(5), V (6), W (7), X (8), Y (9) và Z (10) từ quả thể của G lucidum Shiao M S và cộng

sự [113] tách 5 hợp chất từ quả thể G lucidum bao gồm axit

lanosta-7,9(11),24-trien-3α,15α,22β-triaxetoxy-26-oic (11), axit lanosta-7,9(11), hydroxy-23-oxo-26-oic (12), axit lanosta-7,9(11),24-trien-3α, 15α-diacetoxy-23-oxo- 26-oic (13), axit lanosta-7,9(11),24-trien-3α-axetoxy-15α-hydroxi-23-oxo-26-oic (14)

24-trien-15α-axetoxy-3α-và axit lanosta-7,9(11)24-trien-3α-axetoxy-15α,22β-dihydroxy-26-oic (15)

Năm 1998, El-Mekkawy S và cộng sự đã phân lập 13 hợp chất chuyển hóa bậc 2

từ quả thể nấm G lucidum là axit ganoderic α (16), A (3), B (4), C1 (17) và H (18);

ganoderiol A (19), B (20) và F (21); ganodermanontriol (22), ergosterol (23), ergosterol peroxit (24), cerevisterol (25) và 3β-5α-dihydroxy-6β-metoxyergosta-7,22-dien (26)

Nhóm nghiên cứu này cũng tìm thấy ganoderiol F, ganodermanontriol, axit ganoderic

B, C, α và H, ganoderiol A và B, cũng như dien có hoạt tính kháng virus chống lại HIV-1 [40]

3β-5α-dihydroxy-6β-metoxyergosta-7,22-Năm 1999, González A G và các cộng sự phân lập được ergosta-7,22-dien-3-on

(27), ergosta-5,7-dien-3β-ol (28) fungisterol (29), ergosterol (23), ergosterol peroxit (24), ergosta-4,6,8 (14),22-tetraen-3-on (30), ganodermadiol (31), ganodermenonol (32); axit ganoderic DM (33), lucidadiol (34) và lucidal (35) cũng từ quả thể nấm này

[51]

Nhóm nghiên cứu Min B S và các cộng sự (2000) đã phân lập các axit

ganoderic γ (36), δ (37), ε (38), ζ (39), η (40) và θ (41), ngoài ra còn có axit ganolucidic

D (42) và C2 (43) từ các bào tử nấm G lucidum, cũng như hoạt tính gây độc tế bào đối

với các dòng tế bào khối u Meth-A và LLC [94]

Wu T.S và các cộng sự (2001) đã phân lập axit lucidenic A, C, N (44),

lucidolacton, metyl lucidenat F (45) và axit ganoderic E (46) từ quả thể nấm linh chi G

lucidum [139] Axit lucidenic A, N và axit ganoderic E cho thấy hoạt tính gây độc tế

bào đối với các dòng tế bào ung thư Hep-G2, Hep-G2.2.15 và P-388

Gao J và cộng sự (2002) cũng đã phân lập được 3 dẫn xuất lanosterol là

luciandehyd A (47), B (48) và C [49] Nhóm nghiên cứu này cũng tìm thấy

ganodermanonol (32), ganodermadiol (31), ganodermanondiol (49), ganodermanontriol (22), axit ganoderic A (3), axit ganoderic B8 (50) và axit ganoderic C1 (17)

Lucialdehyt B và C (hoặc lucidal), cũng như ganodermanonol và ganodermanondiol cho

thấy hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với các tế bào ung thư phổi Lewis, sarcoma

180, dòng tế bào khối u T-47D và Meth-A [49] Các nhà nghiên cứu cũng công bố

lucidimol B (51) và ganodermatriol (52) cho thấy hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối

các dòng tế bào ung thư phổi Lewis [48]

3 =O β-OH =O -H α-OH α-CH3 -H =O -H COOH -CH3

COOH -COOH

6 =O α-OH -H -H Α-OAc α-CH3 -H -H Δ25-26 -CH3 -COOH

33 =O =O -H -H -H α-CH3 -H -H Δ25-26 -CH3 -COOH

-CH3 -COOH

36 =O β-OH =O -H α-OH α-CH3 -H β-OH Δ25-26 -CH3 -COOH

37 =O α-OH =O -H α-OH α-CH3 -H β-OH Δ25-26 -CH3 -COOH

42 =O -H =O -H α-OH α-CH3 -H β-OH Δ25-26 -CH3 -COOH

46 =O =O =O -H =O α-CH3 -H =O -H -CH3 -COOH

48 =O -H -H -H -H α-CH3 -H =O -H COOH -CH3

49 =O α-OH =O -H α-OH α-CH3 -H -H Δ25-26 -H -CHO

50 =O α-OH =O -H α-OH α-CH3 -H =O -H -CH3 -COOH

63 =O β-OH =O -H =O α-H -H =O -H -CH3 -COOH

65 =O =O =O -H =O α-CH3 -H =O Δ25-26 -CH3 -COOH

68 =O β-OH =O -H α-OH α-CH3 -H =O -H -CH3 -COOH

76 =O β-OH =O -H α-OH α-CH3 -H =O -H -CH3 COOBu

82 =O =O =O β-Oac =O α-CH3 -H =O -H COOH COOBu

83 -OH β-OH =O -OH =O α-CH3 -H =O -H COOH -CH3

84 =O =O =O -H α-OH α-CH3 -H =O -H COOH -CH3

-CH3 -COOH

88 -OH α-OAc -H -H -H α-CH3 -H -H Δ25-26 -CH3 -COOH

O O

H H

(80)

Akihisa T M và cộng sự [19] đã phân lập được 7 triterpenoit bao gồm: axit

20(21)-dehydrolucidenic A (53), metyl-20(21)-dehydrolucidenat A (54), axit hydroxilucidenic D2 (55), axit 20-hydroxilucidenic F (56), axit 20-hydroxilucidenic E2 (57), axit 20-hydroxilucidenic N (58) và axit 20-hydroxilucidenic P (59) từ quả thể nấm

20-G lucidum

Hajjaj H C và cộng sự [56] phân lập được ganoderol A (32) và ganoderol B (31), còn được gọi là ganodermanondiol và ganodermadiol [51], ganoderal A (60) và

axit ganoderic Y (9) từ dịch chiết metanol của nấm G lucidum Các hợp chất này cho

thấy có tác dụng ức chế quá trình hình thành cholesterol trong in vitro, bằng cách ức chế

các enzym lanosterol-14α-desmetilase không cho chúng biến đổi dihydrolanosterol thành cholesterol [51]

24,25-Liu J K và đồng nghiệp [85] mô tả tác dụng ức chế các enzyme 5α-reductase,

gây ra bởi các dẫn xuất lanosterol như axit ganoderic TR (61), DM (33), A (3), B (4), C2 (62), D (63), I (64) và 5α-lanosta-7,9(11), 24-trien-15α,26-dihydroxi-3-on (120)

Nhóm nghiên cứu này còn phát hiện các hợp chất với một nhóm cacbonyl ở C-3 và một nhóm cacbonyl α, β không bão hòa ở C-26, có tác dụng ức chế đối với các enzym, có thể dùng để điều trị và phòng ngừa các bệnh liên quan đến nội tiết tố androgen như ung thư tuyến tiền liệt, hói đầu nam và mụn trứng cá [85, 86]

Guan S H và cộng sự tìm thấy 2 triterpenoit từ quả thể G.lucidum và xác định

chúng là axit 23S-hydroxy-3,7,11,15 tetraoxo-lanost-8,24E-dien-26-oic (65) và axit 12β-axetoxy-3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo-lanost-8, 20E-dien-26-oic (66) [53]

Seo H W và cộng sự [110] đã phân lập 3 steroit và 5 triterpenoit như ergosterol

(23), ergosterol peroxit (24), stella sterol còn được gọi là ergosta-7,22-dien-3β-ol (96), axit ganoderic A (3), C1 (17) và SZ (67), metyl ganoderat A (68) và axit lucidenic A

(69) từ quả thể của G lucidum

Adams M M và cộng sự [17] đã phân lập 3 lanostanoit mới và một dẫn xuất

benzofuran là axit ganoderic TR1 (70), ganoderic aldehyt TR (71), axit

23-hydroxyganoderic S (72) và ganofuran B (73) từ quả thể của G lucidum

Weng Y L và cộng sự tìm thấy 2 sterol mới là ganodermasit A (74) và B (75) có

tác dụng chống lão hóa

Lee I S và cộng sự đã phân lập 4 triterpen lanostan mới là butyl ganoderat A

(76), butyl ganoderat B (77), butyl lucidenat N (78), và butyl lucidenat A (79) tác dụng

ức chế đáng kể trên các tế bào mỡ trong 3T3-L1 từ quả thể của G.lucium Hoạt tính này

có được thông qua việc điều chỉnh giảm SREBP-1c Ngoài ra, Lee cũng phân lập được

metyl-7β, 15α-isopropylidenedioxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-e26-oat (80) và butyl 12β-axetoxy-3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oat (81) Cả hai

n-hợp chất có hoạt tính chống acetylcholinesterase [76, 77, 78]

Ngoài ra, Cole R J (2003) phân lập các axit ganoderic E (46), F (82), G (83), J

(84), K (85), L (86), Ma (87) và U (88) từ bào tử và sợi nấm của G lucidum [35]

Tất cả các axit ganoderic (GA) và các hợp chất có liên quan đều hình thành bởi con đường sinh tổng hợp mevalonat/isopren, trong đó bao gồm việc chuyển đổi farnesyl diphotpho tạo thành squalene và sau đó tạo thành 2,3-epoxysqualen Các enzym (S) 3-hydroxy-3-Metylglutaryl-CoA reductase (HMGR) xúc tác trong bước đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp isoprenoit, synthase squalen (SQS) là xúc tác enzym bước đầu tiên của con đường sinh tổng hợp isoprenoit của sterol và triterpenoit và synthase lanosterol (LS) là xúc tác tạo vòng 2,3-epoxysqualen để hình thành lanosterol, đó là bộ khung cơ bản của axit ganoderic và các hợp chất liên quan Các bước cuối cùng của con đường sinh tổng hợp của chúng là bao gồm một số acyl hóa, quá trình oxy hóa chưa được hiểu đầy đủ Tuy nhiên, lập thể của các hợp chất này thuộc loại 3α thu được từ 3β [29, 112,

142, 143]

chất chiết xuất phân cực của G lucidum Các polysaccharit hoạt tính sinh học chính

được phân lập từ loại nấm này là D-glucan với β-1-3 và β-1-6 là những liên kết glycosit

Cấu trúc cơ bản của các carbohydrat đều thuộc loại β-1-3-D-glucopyran và chuỗi bên với 1-15 đơn vị β 1-6 monoglucosyl với một trọng lượng phân tử trung bình 1.050.000

Da [116, 148]

Hoạt tính kháng u của polysaccarit linh chi là do tác động tăng cường trên hệ thống miễn dịch của người dùng, mà không phải là trực tiếp chống lại tế bào ung thư [83] Các hoạt tính sinh học được tìm thấy của các polysaccarit thu được từ các loại nấm này là điều hoà miễn dịch, bảo vệ gan, thu dọn gốc tự do, ức chế sự tăng trưởng tế bào bạch cầu, ức chế ngưng tập tiểu cầu, ức chế của sự tương tác giữa virus và màng tế bào với sự gia tăng sản xuất IL-2 [93, 103, 112, 118]

Bao X và cộng sự công bố sự xuất hiện của một polysacharit D-glucose được

gọi là PSGL-I-1A, tách ra từ dịch chiết nước của bào tử G.lucidum có tác dụng kích

thích tế bào T-lympho [24, 25] Nhóm nghiên cứu này cùng tìm thấy một polysaccarit

có tên PGL, trong đó có một cấu trúc riêng biệt với β-D (1-6), nhánh chuỗi bên glucosyl liên kết bởi những liên kết β (1-3) và β (1-4) Theo nhóm tác giả này, PGL làm gia tăng

1.1.2.3 Peptit và protein

Một protein có hoạt tính tạo phân bào tên LZ-8 được phân lập từ sợi nấm G lucidum Polypeptit này bao gồm 110 axit amin kết thúc bằng amin axetyl hoá, với

trọng lượng phân tử 12 kDa [103]

You Y H và cộng sự [147] công bố sự xuất hiện của một phức hợp polysaccarit- protein được gọi là GLPP có khả năng giảm các thiệt hại gây ra bởi các tác nhân phản ứng oxy hóa (ROS) trong các đại thực bào chuột GLPP có trọng lượng phân tử trung bình 5,13 × 105 Da và bao gồm các axit amin sau đây: ASP 8,49, 3,58 Thr, Ser 3,93, Glu 5,81, 3,50 Gly, Ala 3,84, Cys 1,06, Val 2,68, Met 5,33, Iso-Leu 0,25, 1,5 Leu, Phe 1,99, Lys 3,30, 1,21, Arg 3,94, Pro1,22 (mg/g) Các polysaccarit được tạo thành từ các tiểu phân đường ramnose, xylose, fructose, galactose và glucose với một phân tử gam của 0,549:3,614:3,167:0,556:6,89, liên kết bằng các liên kết β-glycosit

Sripuan T và cộng sự [118] phân lập được α-enzym galactosidase từ G lucidum,

có khả năng thủy phân p-nitro-α-D-galactopyranosit, cũng như melibiose, raffinose và stachyose Thêm vào đó, một peptit glycan có hoạt tính hạ đường huyết được gọi là ganoderan C cũng được phân lập từ loại nấm này Các polysacarit của phân tử này bao gồm D-glucose (69,6% của peptideglycan) và D-galactose (2,9%) Cả hai mạch cacbon

và bên chuỗi ganoderan C có chứa D-glucopyranosyl liên kết β-1-3 và β-1-6 và một liên kết α-1-6 của D-galactopyranosil

Ngoài ra, một peptit khối lượng phân tử thấp đã được tìm thấy được gọi là GLP, trong dịch chiết nước của loại nấm này được cho là yếu tố chính gây ra hoạt tính chống

oxy hóa của G lucidum GLP đã thể hiện vai trò quan trọng trong sự ức chế lipit

peroxydation trong cơ thể, kim loại tạo phức và các hoạt tính thu gom các gốc tự do [121]

Liu J và cộng sự [86] công bố việc phân lập các proteoglycan với tỷ lệ

carbohydrat của 10.4:1 từ sợi nấm trồng của G lucidum Proteoglycan này cho thấy hoạt động kháng virus chống lại herpes simplex loại virus 1 và 2 Theo nhóm nghiên

cứu này, các proteoglycan ức chế sự nhân lên của virus bằng cách can thiệp vào quá trình đầu tiên của virus bám dính và nhập vào các tế bào mục tiêu

Wang H X và cộng sự (2006) phân lập enzym ligninolytic từ quả thể tươi

G.lucidum, có tác dụng ức chế mạnh đối với quá trình sao chép ngược của HIV-1 [44]

Ngoài ra, có những công bố trước đó về việc phân lập và đặc tính của một số laccase isozyme khác [134]

Du M và cộng sự (2007) cho thấy G.lucidum có thể biến đổi sinh học selen vô

cơ thành selen hữu cơ, được lưu trữ trong một loại protein hòa tan trong nước Các nhà nghiên cứu phân lập được một protein có chứa selen, thuộc nhóm protein DIN G [39]

Protein này ở trạng thái ban đầu của nó đã được xác định như là một monomer 36.600 Da và có số lượng vượt trội trong các gốc superoxit và hydroxyl

Wang F và cộng sự (2008) đã tìm thấy triterpenoit lanostan là axit ganoderic

AP2 (106) và AP3 (107) từ quả thể của nấm G applanatum [136] Ngoài ra, các nghiên

cứu báo cáo phân lập của axit ganoderenic A (104), B (108), D (109) và G (110) Gan

K H và cộng sự phân lập từ nấm G neoaponicum các chất chuyển hóa ganoderal A

(60), ganodermadiol (31), ergosta-7,22-dien-3β-yl palmitat (111),

ergosta-7,22-dien-3-on (27), ergosta-7,22-dien-3β-ol (96), ergosta-4,6,8(14), 22-tetraen-3-ergosta-7,22-dien-3-on (30) và một steroit là 2β,3α,9α-trihydroxyergosta-7,22-dien (112) [47] Paterson (2006) công bộ 2

driman sesquiterpen được gọi là axit cryptoporic H và I đã được phân lập từ loại nấm này [103]

Kleinwätcher P., Ngô Anh và Trịnh Tam Kiệt (2001) báo cáo sự xuất hiện của 7

triterpenoit là colosolacton A (113), B (114), C (115), D (116), E (117), F (118) và G

(119) từ nấm G colossum Những colosolacton không có hoạt tính kháng sinh, nhưng

cho thấy hoạt tính gây độc tế bào vừa phải chống lại L-929, K-562 và các tế bào HeLa, với các giá trị IC từ 15-35 mg/ml Bên cạnh đó, các chất này là dehydrogenase 3α-hydroxysteroid (3α-HSD) ức chế ở nồng độ tương đương với indomethacin như một loại thuốc tiêu chuẩn, cho thấy tính kháng viêm [71]

Theo González A G và cộng sự (2002), đã phân lập 12 triterpenoit là

ganodermanonol (32), ganodermadiol (31), axit ganoderic Y (9), ganoderiol F (21), ganodermatriol (52), ganodermanontriol (22), ganoderiol A (19), ganoderiol B (20), ergosta-7,22-dien-3-one (27), fungisterol (29) và ergosterol peroxit (24) từ nấm

G.concinnum Ba chất khác được xác định là 5

-lanosta-7,9(11),24-trien-3β-hydroxy-26-al (47), 5α-lanosta-7,9(11),24-trien-15α-26-dihydroxy-3-on (120), và 8α, 4,4,14 on-trimetyl-3,7,11,15,20-pentaoxo-5α-pregnan (121) và có hoạt tính gây độc tế

9α-epoxy-bào chống lại bệnh bạch cầu dòng tủy HL-60 [52]

Trong khi đó, G australe (Cha) chứa các triterpenoit có hoại tính gây độc tế bào

như axit ganoderic Z (10), Y (9), X (8), W (7), V (6) và T (5), cũng như lucialdehydA (47), B (48) và C (35) (León F và cộng sự, 2003) Từ cùng một loại nấm Albino- Smania E va cộng sự (2007) đã tách các hợp chất 5α-ergost-7-en-3β-ol (29), 5α-ergost- 7,22-dien-3β-ol (96), 5,8-epidioxy-5α,8α-ergost-6,22-dien-3β-ol (24), axit applanoxidic

A (98), C, F, G (100) và H, cũng như axit australic (124) và methyl australate (125) Cả

hai axit australic và metyl australat có hoạt tính kháng khuẩn và nấm Bên cạnh đó,

Elissetche J P và cộng sự (2007) đã phân lập 2 enzym laccase từ G australe

Paterson R R M (2006) đã phân lập các hợp chất ergosterol (23);

5α-ergosta-7,22-dien-3β-ol (96), ergosta- 7,22-dien-3-on (27) từ nấm G lipsiense (Batsch), cũng

như axit ganoderic A (3) và D (63) và este metyl của chúng đã được phân lập Tác giả này cũng đã tách các ergosta-7,22-dien-3β-ol (96), ergosta-7,22-dien-3β-yl palmitat (111), 26,27-dihydroxy-lanosta-7,9 (11), 24-trien-3,16-dion (126), metyl oleat (127) và

glyceryl trioleat (128) từ G carnosum (Pat.) [103]

Bên cạnh đó, từ quả thể nấm G.amboinense (Lam.) đã đã phân lập các hợp chất

3β-ol (96), 3β-yl palmitat (111), 3β-yl linoleat (129), 2β,3α,9α-trihydroxy-5α-ergosta-7,22-dien (112), 5α,8α-epidioxy-

ergosta-7,22-dien-ergosta-6,9(11),22-trien-3β-ol (24), 2β-metoxyl-3α-9α-dihydroxy-ergosta-7,22-dien

(130) và axit ganoderic AM, còn được gọi là axit

3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo-lanosta-8-en-26-oic (131) [103] Bột của quả thể nấm G amboinenese cho thấy có tác

dụng phòng ngừa acetaminophen gây tổn thương gan cấp tính [59] Trong khi đó, Shen

và cộng sự (2008) đã phân lập và xác định cấu trúc sterol ergosta-4,

6,8(14),22-tetraen-3-on (30) từ G atrum (Zhao) [111]

Niu X M và các cộng sự (2006), tìm thấy 3 hợp chất prenyl phenolic mới là

fornicin A (132), B (133) và C (134) có hoạt tính gây độc tế bào trung bình trong tế bào

Hep-2 từ G fornicatum (Fr.) [100]

Nấm G tsugae (Murr.) cũng đã được sử dụng trong y học cổ truyền phương Đông giống như G lucidum, có hoạt tính chống oxy hóa cao, tăng cường hệ miễn dịch,

thu dọn gốc tự do Một số công bố về sự phân lập của các lanostanoit với hoạt tính gây

độc tế bào trong ống nghiệm của loài G tsugae, bao gồm cả axit tsugaric A (135), B

(136) và C (137), và tsugarosit A, B, C, ngoài bốn chất chuyển hóa được biết đến trước đây: axit 3β-hydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-21-oic (138), axit 3-oxo-5α-lanosta-8,24- dien-21-oic (139), ergosta-7,22-dien-3β-ol (96) và 2β, 3α, 9α-trihydroxy-5ε-ergosta- 7,22-dien (112) Mặt khác, Chen D H (2003) đã phân lập của axit ganoderic A (3), B (4), C1 (17), C5 (140), C6 (141), D (63), E (46) và G (83), cũng như axit ganoderenic D

(109), từ quả thể G tsugae [34, 91, 119]

Qiao Y và cộng sự (2007) [106] đã tách 2 triterpenoit từ G sinense (Zhao), được

xác định là ganolacton B (142) và ganoderiol A triacetat (143) [95] Sato và các cộng sự (2009) đã phân lập lanostan triterpenoit mới là ganoderic axit GS-1 (144), axit ganoderic GS-2 (145), axit ganoderic GS-3 (146), axit 20(21)-dehydrolucidenic N (147)

và axit 20-hydroxylucidenic A (148) từ quả thể của G.sinense, cùng với các hợp chất

được biết gồm 6 triterpenoit và 3 sterol Trong số này, axit ganoderic GS-2 và axit 20(21)-dehydrolucidenic N, ức chế sự suy giảm miễn dịch virut-1 protease với IC50 20 đến 40 mM

Sato N và cộng sự (2009) cũng đã phân lập 3 lanostan triterpenoit mới có nửa

hydroquinone farnesyl, tên ganosinensin A (149), B (150) và C (151) từ cùng một loại

nấm G.sinense Sau đó, Wang C F và các cộng sự (2010) cũng đã phân lập 3

triterpenoit mới là methyl ganosinesat A (152), axit ganosinesic A (153) và axit ganosinesic B (154) [135]

Welti S và cộng sự (2010) đã tách axit ganoderic FWI (155) từ G culosum

(Murr.) Theo các nhà nghiên cứu dịch chiết từ quả thể G culosum có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tốt hơn so với dịch chiết nấm G lucidum Vì nó đã được phân lập từ G culosum, axit ganoderic FWI có thể được sử dụng cũng như một dấu hiệu

phân loại nấm bằng hóa học (chemotaxonomic) [138]

Như chúng ta thấy, trong 40 năm qua, chi Ganoderma được nghiên cứu rộng rãi

để tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học mới Nghiên cứu này đã dẫn đến sự phân lập của hàng trăm các hợp chất mới có giá trị chữa bệnh, hầu hết là lanosterol (axit ganoderic và dẫn xuất) hoặc polysaccarit

Trong số các hoạt tính sinh học chính của các dẫn xuất lanosterol là gây độc tế bào đối với một số dòng ung thư, hoạt tính chống viêm, kháng virus, bảo vệ gan, cũng như ức chế sinh tổng hợp cholesterol Còn các polysaccarit có hoạt tính tăng cường hệ thống miễn dịch và thu dọn gốc tự do Tuy nhiên, chi Ganoderma là một trong những lớn nhất thuộc họ Ganodermataceae, vẫn còn rất nhiều vấn đề để nghiên cứu tiếp

1.2 Chi Hexagonia

1.2.1 Đặc điểm chung về hình thái

Hexagonia là một chi nấm thuộc họ nấm lỗ (Polyporaceae) Chi này phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới, có khoảng 16 loài bao gồm: H.apiaria, H.tenuis, H.variegata, H.dermatiphora, H.hirta, H.hydnoides, H.leprosa, H.niam-niamensis, H.nitida, H.vesparia, H.pobeguinii, H.speciosa, H.umbrinella, H.velutina, H.similis, H.zambesiana

Chi được đặc trưng bởi một hệ thống sợi trimitic với màu sợi nấm và bào tử hình trụ lớn Hầu hết các loài trong chi này đều có lỗ chân lông lục giác lớn Có những khó

khăn trong việc phân biệt nấm Hexagonia với một số loài Coriolopsis, nhưng thường chúng có một màu sắc nhẹ hơn và có các bào tử ngắn hơn Corner (1989) coi Hexagonia như một từ đồng nghĩa của Trametes chủ yếu là vì cả hai giống nhau ở điểm là cùng có

một hệ thống sợi nấm trimitic

Nấm lâu năm, thường mọc trên cây thân gỗ, gây bệnh thối trắng cho cây chủ, không cuống, chia đôi, hình bán nguyệt, luôn dai, bề mặt thường trơn tru Có lông măng, hoặc nhiều lông dài, lỗ chân lông hình lục giác, lớn Thân nấm thường mỏng, có

ba màu chủ đạo: màu nâu, tối, hoặc vàng Hệ thống sợi nấm trimitic; bào tử trong suốt, hình trụ, dài hơn 12 µm, mịn, mỏng

Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á, châu Phi, một số loài ở châu Âu Ở

Châu Á gặp ở Trung Quốc, Việt Nam, Philippin [12]

1.2.2 Thành phần hóa học

Hiện nay số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như giá trị y học của

các loài trong chi Hexagonia là rất hạn chế Các hợp chất cyclohexanoit có tính oxy

hóa, chủ yếu là epoxit, được tìm thấy nhiều trong vi khuẩn, nấm, thực vật bậc cao, và động vật thân mềm, có một loạt các hoạt tính sinh học như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng u, kháng sinh

Năm 2009, Jiang M.Y và cộng sự đã phân lập được 11 hợp chất cyclohexanoit

mới có tính oxy hóa cao bao gồm speciosin A-K (156-166) và aporpinon A (167) từ

dịch chiết etyl axetat của quả thể loài nấm H.speciosa Thử hoạt tính sinh học với các

dòng tế bào ung thư như HL-60, SMMC-7721, A-549, MCF-7 và SW480 Speciosin B

(157) cho hoạt tính kháng mạnh mẽ với các giá trị IC50 là 0,23 µM (HL-60), 0.70 µM (SMMC-7721); 3,30 µM (A-549); 2,85 µM (MCF-7); và 2,95 µM (SW480) Aporpinon

A (167) cũng có khả năng kháng một số dòng ung thư trên với giá trị IC50 ở 4,07 µM (SMMC-7721), 21,01 µM (A-549), và 10,45 µM (MCF-7) [65, 66]

O

OH

H O

O

OH H O

OH H O

O OH

OH H O

(156) Speciosin A (157) Speciosin B (158) Speciosin C (159) Speciosin D

OH

(164) Speciosin I (165) Speciosin J (166) Speciosin K (167) Aporpinone A

Năm 2011, Jiang M Y đã tiếp tục phân lập thêm 10 hợp chất mới, bao gồm 9

cyclohexanoit là speciosin L-T (168-176) và 5’-O-acetylaporpinon A (177) [61, 62]

OH

O

OCOCH3OH

(168) Speciosin L (169) Speciosin M (170) Speciosin N (171) Speciosin O

OH

OH

OH

OH OH

O O

OH

(176) Speciosin T (177) 5’-O-acetylaporpinon A

1.3 Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries)

1.3.1 Đặc điểm hình thái và phân bố

- Họ: Polyporaceae

- Chi: Hexagonia Fr

- Tên khoa học: Hexagonia apiaria (Pers.) Fries, syn Polyporus apiarius Pers., Hexagonia koenigii Berk., Hexagonia atra Lloyd, Hexagonia calignosa Lloyd

Hình 1.4: Nấm H.apiaria mặt trước và sau

Nấm một năm, mọc đơn, không có cuống, kích thước: dài khoảng 11 cm, rộng 8

cm và dày 2cm Mũ nấm tròn hoặc hình bán nguyệt, bề mặt hơi lõm, có các vòng đồng tâm, tạo thành rãnh, màu vàng Lỗ chân lông lục giác, dài khoảng 1cm, màu vàng nâu khi già có màu xám nâu, rộng 2-5 mm, thường lớn hơn ở trung tâm,

Hệ sợi có ba dạng, tạo sinh sợi nấm trong suốt, nhiều nhánh, rộng 1,5-2,2 mm Sợi nấm xương chiếm ưu thế trong quả thể

Bào tử hình trụ, trong suốt, mịn màng, kích thước 11-15 x 4,5-6 µm

Mọc trên các loài gỗ rụng lá, gây chết cây chủ

Phân bố: châu Á, được biết đến ở Ấn Độ, phía đông Trung Quốc, Philippin, và một số đảo ở Thái Bình Dương và Úc

1.3.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Hiện nay chưa có một công trình nghiên cứu nào thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng trong y học của loài nấm này

1.4 Nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi)

1.4.1 Đặc điểm hình thái và phân bố

- Họ: Ganodermataceae Donk ( hoặc Polyporales)

- Chi: Ganoderma (Fr.) Pat

- Tên khoa học: Ganoderma pfeifferi, syn: Fomes pfeifferi, Scindalma pfeifferi, Ganoderma laccatum

- Tên thông thường: Nấm linh chi châu Âu

Thể quả có dạng hình bán nguyệt, không có cuống, thường gắn trực tiếp vào cây Kích thước chiều ngang từ 10-50cm, rộng 10-30cm, dày 10-15 cm Khi còn non, bề mặt phía trên phẳng, bóng, màu trắng hoặc màu kem Vào cuối mùa thu và mùa đông, bề mặt có sự bài tiết sáp nên có màu vàng và có mùi thơm đặc trưng

Hình 1.2 G.pfeifferi non Hình 1.3 G pfeifferi lâu năm

Quả thể lâu năm trở nên cứng, thường có nhiều tầng, màu nâu sẫm, xuất hiện nhiều vết nứt cũng như các nếp nhăn trên bề mặt

Bề mặt bên dưới có các lỗ mịn hình tròn và đường kính 0,2 mm, ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, với mật độ 5-6 lỗ/ mm

Hình 1.4 Bề mặt dưới của thể quả G pfeifferi

Nấm thường mọc đơn, sống lâu năm, không ăn được Chúng ban đầu thường ký

sinh trên các cây gỗ, chủ yếu là các loài thuộc chi sồi (Fagus) và một số loài rụng lá, lá kim như Aesculus, Acer, Fraxinus, Prunus và Quercus, gây ra bệnh thối trắng, giết chết

cây chủ, sau đó hoại sinh trên gốc cây đã chết Bào tử thường có dạng hình elip (hình trứng), màu nâu, kích thước 9-12 x 6-8 m

Ganoderma pfeifferi phân bố khá phổ biến ở châu Âu, ở một số nước như CH

Séc, Đan Mạch, Đức, Hà Lan, Tây Ban Nha, Thủy Điển, Anh,… và hầu như trong thời

gian dài chỉ tìm thấy ở đây Ở Việt Nam, G pfeifferi được phát hiện vào tháng 9/2011,

tại Lâm Đồng Loài nấm này cũng được phát hiện tại Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An [12]

1.4.2 Thành phần hóa học

Hiện nay, do không phổ biến ở Việt Nam nên số lượng nghiên cứu về thành phần

hóa học loài Ganoderma pfeifferi còn rất ít

Năm 2000, Mothana A và cộng sự đã phân lập và bằng các phương pháp phổ đã

xác định được 2 farnesyl hidroquinon mới từ loài Ganoderma pfeifferi, đó là axit

2-[2-(2,5-dihidroxyphenyl) - etyliden] - 11- hidroxy-6,10-dimetyl-undeca-5,9-dien