Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Header Page of 166 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VĂN THỊ THÚY ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus spp CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC TỪ AO NI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC Mã số:604240 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH TP.HCM – 2011 Footer Page of 166 Header Page of 166 LỜI CẢM ƠN Luận văn thực Phịng Sinh học Thực Nghiệm- Viện Nghiên Cứu Ni Trồng Thủy Sản hướng dẫn TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh  Kính gửi đến TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh lời cảm ơn chân thành sâu sắc quan tâm, giúp đỡ tận tình hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận  Kính gửi đến Th.s Võ Minh Sơn lời cảm ơn chân thành quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ kinh phí lẫn kiến thức để tơi thực khóa luận  Kính gửi đến q Th ầy, Cô trường Đại học Khoa học Tự Nhiên- ĐHQG TpHCM lòng biết ơn kiến thức quý báu truyền đạt cho tơi suốt q trình học  Cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ sống Văn Thị Thúy Footer Page of 166 Header Page of 166 ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa .i Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục biểu đồ vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU Chương – TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 1.1.1 Tình trạng nhiễm mơi trường nước nuôi trồng thủy sản 1.1.2 Mối quan hệ nhân tố gây bệnh cho động vật thủy sản 1.1.3 Các loại bệnh thường gặp động vật thủy sản 1.1.4 Tác động tiêu cực việc dùng thuốc nuôi trồng thủy sản 1.2 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 12 1.2.1 Định nghĩa probiotic 13 1.2.2 Đặc điểm chung probiotic 14 1.2.3 Các chế tác động probiotic 14 1.2.4 Vai trị probiotic ni trồng thủy sản 20 1.2.5 Tình hình nghiên cứu prob iotic ứng dụng thủy sản Việt Nam giới 21 Footer Page of 166 Header Page of 166 iii 1.3 BẺ GÃY QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING – CÁCH TIẾP CẬN MỚI TRONG VIỆC KIỂM SOÁT HỆ VI SINH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 23 1.3.1 Định nghĩa trình quorum sensing 23 1.3.2 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp cận việc kiểm soát bệnh 24 1.3.3 Sự phân hủy sinh học trình quorum sensing vi khuẩn gây bệnh 25 1.4 TỔNG QUAN VI KHUẨN Bacilllus 27 1.4.1 Đặc điểm chung chi Bacillus 27 1.4.2 Dinh dưỡng sinh trưởng 28 1.4.3 Quá trình tạo bào tử Bacillus 28 1.4.4 Ứng dụng Bacillus nuôi trồng thủy sản 30 Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 31 2.1.1 Thời gian tiến hành 31 2.1.2 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 31 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Nguồn vật liệu phân lập chủng vi sinh vật kiểm định 31 2.2.2 Địa điểm thu mẫu 31 2.2.3 Mơi trường - hóa chất- thiết bị - dụng cụ sử dụng 34 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35 2.3.2 Phương pháp thu mẫu 37 2.3.3 Phương pháp phân lập 37 2.3.4 Phương pháp chọn lọc 38 2.3.5 Định danh chủng tuyển chọn 42 Footer Page of 166 Header Page of 166 iv 2.3.6 Khảo sát đặc tính probiotic khác 48 2.3.7 Khảo sát đặc tính sinh lý chủng tuyển chọn 51 2.3.8 Khảo sát khả tương thích chủng tuyển chọn 55 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 56 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 57 3.1.1 Kết thu mẫu, phân lập chọn lọc bước 57 3.1.2 Kết sàng lọc dựa vào khả sinh enzyme hemolysin 58 3.1.3 Thử khả sinh enzyme ngoại bào chủng thử nghiệm 61 3.1.4 Kết định danh chủng tuyển chọn 65 3.1.5Kết khảo sát đặc tính probiotickhác chủng tuyển chọn 67 3.1.6 Kết khảo sát số đặc tính sinh lý chủng tuyển chọn 71 3.1.7 Kết khảo sát khả tương thích chủng tuyển chọn 81 3.2 THẢO LUẬN 82 Chương 4- KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 88 4.2 ĐỀ NGHỊ 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 PHỤ LỤC PL1 Footer Page of 166 Header Page of 166 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHL N- Acyl Homoserine Lactone bp base pair CFU Colony Forming Unit CMC Cacboxyl Methyl Cellulose cs Cộng DSM Difco Sporulation Medium ĐC Đối chứng EM Effective microorganism FAO Food and Agriculture Organization HHL N- Hexanoyl- L- Homoserine Lactone PBS Phosphate Buffer Saline OD Optical Density WHO World Health Organization Footer Page of 166 Header Page of 166 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Địa điểm thời gian thu mẫu 31 Bảng 3.1: Kết thử nghiệm khả sinh hemolysin 58 Bảng 3.2: Kết thử nghiệm khả sinh enzyme ngoại bào 61 Bảng 3.3: Kết định danh phương pháp sinh hóa 66 Bảng 3.4: Tóm tắt kết định danh phương pháp sinh hóa sinh học phân tử 67 Bảng 3.5: Kết đối kháng chủng thử nghiệm với số chủng gây bệnh 67 Bảng 3.6: Tốc độ phân hủy phân tử HHL chủng tuyển chọn thời điểm 9h 24h 69 Bảng 3.7: Log (cfu/ml) chủng vi khuẩn thử nghiệm nồng độ muối khác sau 24 71 Bảng 3.8: Log( cfu/ml) chủng vi khuẩn thử nghiệm giá trị pH khác sau 24 73 Bảng 3.9: Log (cfu/ml) chủng khảo sát sau 24giờ nuôi nhiệt độ 74 Bảng 3.10: Tỷ lệ sống sót (%) chủng khảo sát nồng độ muối mật khác vào thời điểm 1giờ, 2giờ, 3giờ 6giờ 75 Bảng 3.11: Tỷ lệ sống sót (%) chủng khảo sát pH2 pH3 theo thời gian 79 Bảng 3.12: Kết tương thích chủng khảo sát 81 Footer Page of 166 Header Page of 166 vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ phần trăm số lượng enzyme chủng khảo sát 64 Biểu đồ 3.2: Mối tương quan đường kính vịng violacein Ln[HHL] 69 Biểu đồ 3.3: Tốc độ phân hủy HHL thời điểm 24 70 Biểu đồ 3.4: Log(cfu/ml) chủng thử nghiệm nồng độ muối khác sau 24 72 Biểu đồ 3.5: Log( cfu/ml) chủng vi khuẩn thử nghiệm giá trị pH4- pH10 sau 24 khảo sát 73 Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ sống sót chủng khảo sát theo thời gian nồng độ muối mật 0,5%, 1%, 2% 77 Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ sống sót chủng khảo sát theo thời gian pH2 pH3 80 Footer Page of 166 Header Page of 166 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mối quan hệ nhân tố gây bệnh Hình 1.2: Vi khuẩn Aeromonas cá tra bị xuất huyết Aeromonas Hình 1.3: Vi khuẩn Vibrio phát sáng môi trường TCBS mang tôm sú bị đen nhiễm Vibrio Hình 1.4: Vi khuẩn E.ictaluri cá tra bị bệnh nhiễm Edwardsiella Hình 1.5: Sơ đồ phương pháp bẻ gãy trình quorum sensing vi khuẩn 25 Hình 1.6: Sự phân hủy phân tử AHL enzyme 26 Hình 1.7: Mặt cắt ngang bào tử Bacillus 29 Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36 Hình 2.2 Dụng cụ thu mẫu nước bùn ao nuôi cá tra 37 Hình 2.3: Bảng đặc tính sinh hóa số chủng Bacillus 43 Hình 2.4: Phương pháp cấy vạch thẳng vng góc 49 Hình 3.1: Sự đa dạng khuẩn lạc từ mẫu phân lập môi trường DSM 57 Hình 3.2:Hình dạng khuẩn lạc môi trường DSM 57 Hình 3.3: Tế bào tạo nội bào tử tế bào sinh dưỡng 58 Hình 3.4: Kết kiểm tra enzyme catalase: catalase dương tính, catalase âm tính 58 Hình 3.5: Kết thử khả sinh hemolysin 61 Hình 3.6: Thử nghiệm khả sinh enzyme ngoại bào 65 Hình 3.7: Chủng N3.19.2 đối kháng với V.alginolyticus 68 Hình 3.8: Kết kiểm tra diện gen aiiA chủng N3.19.2 68 Hình 3.9: Đường kính vịng violacein nghiệm thức đối chứng thời điểm giờ, 24 70 Hình 3.10: Vòng violacein chủng N3.10.1 thời điểm 9h 24h 71 Footer Page of 166 Header Page 10 of 166 Footer Page 10 of 166 ix Header Page 122 of 166 PL Mẫu ĐẶC ĐIỂM KHUẨN LẠC N4C3.1 Khuẩn lạc tròn khơ bóng, nhớt MÀU SẮC KHUẨN LẠC Trắng đục CATALASE + GRAM + NỘI BÀO TỬ + N4C3.2 Khuẩn lạc tròn mọc phân lớp Trắng + + - N4.9.1 Khuẩn lạc trịn tâm nhơ, bóng ướt Trắng đục + + + N4.9.2 Khuẩn lạc tròn, mọc phân lớp, khô Trắng + + + N4.9.3 Khuẩn lạc trịn đều,bờ nhơ cao, ướt Trắng đục + + - N4.2.1 Khuẩn lạc trịn đều, tâm nhơ bóng khơ Trắng + + + N4.2.2 Rìa nhăn, xù xì, tâm nhơ, nhớt Trắng + + + N4.2.3 Rìa trịn đều, tâm nhơ,bóng khơ Vàng nhạt + + + N4.08.1 Rìa nhăn, mọc phân lớp xù xì Trắng + + + N4.08.2 Rìa trịn đều, tâm nhơ, bóng ướt Vàng nhạt + + + N4.08.3 Rìa nhăn, dẹt ướt Trắng đục + + + N4.18.1 Rìa trịn bóng khơ, tâm nhơ Trắng + + + N4.18.2 B3.22a3 Rìa trịn đều, bờ nhơ bóng Rìa trịn, bờ nhơ cao, nhớt, khô Trắng đục Trắng đục + + + + + + B3.2 Hình dạng bất định, ướt, nhơ Trắng + + + N3.4.1 Rìa nhăn, khơ, lồi Trắng đục + - N3.4.2 Rìa trịn, ướt bóng, tâm nhơ Vàng đậm + - N3.4.3 Rìa trịn, dẹp, tâm nhơ, khơ Trắng đục + + + N3.4.4 Rìa nhăn, bóng, mọc phân lớp, khô Trắng đục + + - N3.4.5 Rìa trịn đều, ướt, lồi Vàng nhạt + + + N3.4.6 Rìa nhăn, bờ nhơ cao, ướt Trắng + + - B3.11.1 Rìa trịn, tâm nhơ, khơ Trắng đục + + + B3.11.2 Rìa nhăn, ướt, tâm nhơ cao Vàng ngà + + + B3.11.3 Rìa nhăn, tâm nhơ, bóng khơ Trắng đục + + + B3.25.1 Rìa trịn, ướt, tâm nhơ Hồng nhạt + + + B3.25.2 Hình dạnh bất định, bóng, ướt Trắng + + + B3.25.3 Rìa nhăn, bóng ướt Trắng + + - B3.25.4 Rìa trịn, bờ nhơ, tâm nhơ cao, ướt Trắng đục + + + N3.14.1 Rìa nhăn, mọc phân lớp, ướt Vàng nhạt + + - N3.14.2 Rìa nhăn, lồi, hình dạng bất định Trắng đục + + + N3.14.3 Rìa trịn, tâm nhơ, ướt Vàng đậm + + - N3.14.4 Xù xì, nhơ, khơ Trắng đục + + + Ghi chú: N: thu từ mẫu nước B: Thu từ mẫu bùn Footer Page 122 of 166 Header Page 123 of 166 PL Phụ lục 3: Kết giải trình tự 16S rDNA BLAST Chủng B3.11.1 TTGGAGAGTTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATA CATGCAAGTCGAGCGGACTTGTTAGAAGCTTGCTTCTAACAAGTTAGCGGC GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGATGGGGATAACTC CGGGAAACCGGAGCTAATACCGAATAACACTTTCGCTCGCATGAGCGGAT GTTAAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAG CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTG AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCA ACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGG AAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGA AAGCCACGGCTAACTACGTGC Accession Description Bacillus sp KH2 gene for 16S AB435178 ribosomal RNA, partial sequence Bacillus koreensis strain FJ215781.2 3441BRRJ 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus sp 'Mali 21' 16S AY211115 ribosomal RNA gene, partial sequence Max score Total score Query coverage E value Max ident 941 941 100% 0.0 99% 924 924 99% 0.0 99% 922 922 100% 0.0 99% Chủng N3.19.2 GCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAC AGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT GGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATA CCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCT GTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC TCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACT GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCT TCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGG TTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAAC TGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTG Footer Page 123 of 166 PL10 Header Page 124 of 166 Total Accession Description Max score scor e Bacillus pumilus strain AIMST JF775410 KVA-F 16S ribosomal RNA gene, partial sequence HQ41822 7.1 Bacillus pumilus strain HPCR185 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus sp 34386DBRRJ 16S JF309254.1 ribosomal RNA gene, partial sequence Query coverage E value Max ident 928 928 100% 0.0 100% 928 928 100% 0.0 100% 928 928 100% 0.0 100% Chủng N3.10.1 TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATAC ATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCG GACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCC GGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAACATTTTTTCTTGCATAAGAGAAAAT TGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAG AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGA GGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGGAAGA ACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCC ACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA Accession Description Bacillus flexus strain NJY2 16S ribosomal HM595742.1 RNA gene, partial sequence Bacillus sp CULLABH8L8 16S HQ841042.1 ribosomal RNA gene, partial sequence Footer Page 124 of 166 Max Total Query E Max score score coverage value ident 987 987 99% 0.0 99% 987 987 99% 0.0 100% PL11 Header Page 125 of 166 Chủng B4.2.2 TGGAGAGTTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATAC ATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCG GACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCC GGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAACATTTTTTCTTGCATAAGAGAAAAT TGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAG AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGA GGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAG AACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAACC ACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA Accession Description Bacillus flexus strain NJY2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus sp CUL-LABH8L8 HQ841042.1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus flexus strain A10 HQ323422.1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence HM595742.1 Max Total Query E Max score score coverage value ident 981 981 99% 0.0 99% 981 981 99% 0.0 99% 981 981 99% 0.0 99% Phụ lục 4: Kết khảo sát khả phân hủy HHL mức kiểu hình Mối tương quan nồng độ HHL đường kính vịng violacein [HHL] (ppm) 1,25 2,50 5,00 10,00 Ln [HHL] 0,22 0,92 1,61 2,3 Đường kính vòng violacein (cm) 1,87 2,57 3,00 3,57 Footer Page 125 of 166 PL12 Header Page 126 of 166 Kết phân hủy HHL nghiệm thức thí nghiệm 9giờ Nghiệm thức B3.11.1 B4.2.2 ĐC1 N3.19.2 N3.10.1 ĐC2 24 Đường kính (cm) [HHL] Ln[HHL] cịn lại cịn lại Tốc độ phân Đường [HHL] Ln[HHL] hủy kính (cm) cịn lại lại (ppm/h) Tốc độ phân hủy (ppm/h) 1,57 4,81 0,101 3 3 1,57 1,57 1,57 1,57 1,57 4,81 4,81 4,81 4,81 4,81 0,101 0,101 0,101 0,101 0,101 0,142 0,142 0,139 0,133 0,105 0,105 3,2 3,2 2,1 2,1 2,1 2,9 3 3,1 3,1 1,82 1,57 1,82 0,44 0,44 0,44 1,45 1,57 1,57 1,7 1,7 6,17 4,81 6,17 1,55 1,55 1,55 4,26 4,81 4,81 5,47 5,47 1,57 4,81 Footer Page 126 of 166 0,41 0,41 0,41 0,11 0,05 0,05 1,2 1,2 1,3 1,5 2 2,9 2,8 2,8 0 0 0 3,1 -0,68 -0,68 -0,56 -0,31 0,32 0,32 1,45 1,32 1,32 -2,19 -2,19 -2,19 -2,19 -2,19 -2,19 1,57 1,7 0,51 0,51 0,57 0,73 1,38 1,38 4,26 3,74 3,74 0,112 0,112 0,112 0,112 0,112 0,112 4,806 5,473 1,57 4,806 0,205 0,205 0,205 0,205 0,205 0,205 PL Header Page 127 of 166 Phụ lục : Kết khả chịu muối mật chủng khảo sát Log mật độ vi khuẩn [log(cfu/ml)] thời điểm khảo sát Chủng T (h) LL1 B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 0.5% LL2 LL3 LL1 1.0% LL2 LL3 LL1 2.0% LL2 LL3 0h 1h 2h 3h 6.09 6.20 6.26 6.48 6.05 6.31 6.38 6.42 6.41 6.26 6.28 6.61 6.18 6.16 6.26 6.39 6.22 6.18 6.34 6.56 6.28 6.24 6.41 6.61 6.15 6.32 6.08 6.21 6.21 5.20 5.97 6.19 6.34 6.20 6.34 6.13 6h 0h 7.04 6.96 7.89 7.08 6.91 6.67 6.36 6.11 6.61 6.62 6.64 6.62 6.56 6.63 6.57 6.50 6.53 6.67 1h 2h 3h 6h 0h 1h 2h 3h 6.54 6.46 6.59 6.51 6.55 6.61 6.46 6.61 6.26 6.60 6.62 6.63 6.48 6.58 6.38 6.55 5.91 6.04 6.68 6.92 6.31 6.31 6.27 6.43 6.66 7.20 6.33 6.28 6.26 6.42 6.66 6.86 6.29 6.27 6.25 6.42 6.40 5.96 6.28 6.22 6.10 6.04 6.15 5.83 6.30 6.21 6.06 5.91 6.18 5.11 6.30 6.26 6.15 6.03 5.79 5.08 6.26 6.30 5.90 5.53 6.13 4.71 6.37 6.15 6.29 5.41 5.62 5.87 6.31 6.26 5.95 6.00 6h 0h 1h 2h 3h 6.57 6.15 6.14 6.24 6.49 6.60 6.18 6.09 6.21 6.43 6.61 6.21 6.17 6.18 6.56 5.89 6.19 6.13 6.01 5.92 5.70 6.17 6.15 5.98 5.83 5.53 6.14 6.11 6.07 5.72 5.51 6.41 6.18 5.75 4.90 4.76 6.26 6.11 5.60 5.95 4.26 6.15 6.08 6.09 5.51 6h 6.70 6.80 6.78 5.45 5.08 5.49 4.26 4.34 5.56 Footer Page 127 of 166 PL Header Page 128 of 166 Kết xử lý thống kê tỷ lệ sống sót chủng sát thời điểm khác nồng độ muối mật 0,5% Thời điểm khảo sát giờ giờ Chủng B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 Chủng khảo sát N3.19.2 B4.2.2 B3.11.1 N3.10.1 Sig Chủng khảo sát N3.19.2 B4.2.2 B3.11.1 N3.10.1 Sig Footer Page 128 of 166 Số lần lặp lại 3 3 3 3 3 3 3 3 Trung bình Độ lệch chuẩn 101,24 0,89 98,49 0,99 103,49 1,04 99,24 0,66 102,05 1,04 99,80 0,23 104,86 0,24 100,49 0,49 105,23 1,57 100,55 0,17 105,65 0,18 105,07 1,05 118,07 8,34 105,48 2,74 110,83 2,87 109,38 0,86 0,5%/ Subset for alpha = 05 N 3 98,49 99,24 99,24 101,23 0,746 0,1022 101,24 103,49 0,062 0,5%/ Subset for alpha = 05 N 3 99,8 100,49 100,49 102,05 104,86 0,53 0,05 PL Header Page 129 of 166 Chủng khảo sát N N3.19.2 B4.2.2 B3.11.1 N3.10.1 Sig Chủng khảo sát N3.19.2 B4.2.2 N3.10.1 B3.11.1 Sig N 0,5/ Subset for alpha = 05 100,55 3 1,00 0,5%/ Subset for alpha = 05 105,48 109,38 110,83 0,53 105,07 105,23 105,65 0,88 109,38 110,83 118,07 0,18 Số liệu bảng giá trị trung bình, giá trị cột khơng có khác biệt, giá trị cột khác có biệt có ý nghĩa (p < 0,05) Muối mật 1% Thời điểm khảo sát giờ giờ Footer Page 129 of 166 Chủng B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 B3.11.1 N3.19.2 N3.10.1 B4.2.2 Số lần lặp lại 3 3 3 3 3 3 3 3 Trung bình Độ lệch chuẩn 99,41 0,67 99,49 0,76 99,05 0,42 99,35 0,33 101,71 1,21 98,33 1,52 97,03 0,72 97,57 0,74 104,66 1,85 94,74 2,07 95,29 1,15 94,38 1,62 110,54 3,31 85,48 6,95 90,73 2,86 86,55 3,67 PL Header Page 130 of 166 1%/ Chủng khảo sát Subset for alpha = 05 N N3.10.1 B4.2.2 B3.11.1 N3.19.2 Sig 3 3 99,05 99,35 99,41 99,49 0,78 1%/ Chủng khảo sát Subset for alpha = 05 97,03 97,57 98,33 0,51 N N3.10.1 B4.2.2 N3.19.2 B3.11.1 Sig Chủng khảo sát N B4.2.2 N3.19.2 N3.10.1 B3.11.1 Sig Chủng khảo sát N3.19.2 B4.2.2 B3.11.1 N3.10.1 Sig 1%/ Subset for alpha = 05 94,38 94,74 95,29 0,99 101,71 104,66 1%/ Subset for alpha = 05 N 3 3 85,48 86,55 90,73 0,52 110,57 Số liệu bảng giá trị trung bình, giá trị cột khơng có khác biệt, giá trị cột khác có biệt có ý nghĩa (p