PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera)

Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập được .... thuringiensis từ một số địa phương, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tính chất của các chủng Baci

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG

DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera)

Sinh viên thực hiện : HỒ BẢO QUỐC Niên khoá : 2006 – 2010

Tháng 07/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG

DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

KS NGUYỄN VĂN LẪM

Tháng 07/2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

- TS Lê Đình Đôn, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

- Thầy Nguyễn Ngọc Hùng, người thầy đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thiện khoá luận

- KS Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập vừa qua

- Phòng Vi sinh Bộ môn Công nghệ Sinh học đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng

- Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường trường đại học Nông Lâm

đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi nghiên cứu tại viện

- Các bạn lớp DH06SH đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua

- Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Sinh viên thực hiện

HỒ BẢO QUỐC

thái khuẩn lạc xác định được 203 vi khuẩn có khuẩn lạc giống khuẩn lạc B thuringiensis Sau khi cho chúng mọc trên môi trường T3 thạch sau 48 giờ, tiến hành

quan sát 203 mẫu phân lập dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần nhằm khảo sát protein tinh thể độc tố Kết quả xác định được 9 chủng sản sinh protein tinh thể độc tố

Thử hoạt tính sinh học diệt sâu của 9 chủng B thuringiensis trên đối tượng sâu khoang (Spodoptera litura), kết quả tất cả 9 chủng đều âm tính với Spodoptera litura Sử dụng

PCR với cặp primer đặc hiệu cho gene cry1Ab đối với 9 chủng phân lập, không có chủng nào cho ra sản phẩm PCR

SUMMARY

Bacillus thuringiensis is a Gram positive, facultative anaerobic bacteria that

produces proteins toxic against different insect species This feature makes it the most widely used biological control agent in agriculture.

The aim of this study was to isolate B thuringiensis strains that produce protein toxic against Lepidoptera from different soil samples in several provinces in South

Central, South and Highland Regions of Vietnam, and to investigate their phenotypic and genotypic characterizations Total 188 soil samples in Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Kon Tum, Gia Lai, Daklak, Lâm Đồng, Tây Ninh Three thousand one hundred bacteria were isolated from these samples by sodium acetate selection and heat treatment For phenotypic characterization, 203 of these isolates were grown for

48 h and crystal protein production was observed by phase contrast microscope during

spore formation Nine of 203 the bacterial colonies were identified as B thuringiensis

Spherical type crystal morphology was mostly observed type among the others

Examine biological activity of nine B thuringiensis strains on the subject Spodoptera litura, the results, all nine B thuringiensis strains were negative for Spodoptera litura

For genotypic characterization, the cry1Ab gene content of the isolates were screened

by Polymerase chain reaction (PCR) analysis In addition, DNA analysis of 9 isolates

by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) for all isolates were also carried out All

nine B thuringiensis strains didn’t give PCR product

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Danh sách chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus thuringiensis 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện 4

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố 4

2.1.2.1 Đặc điểm phân loại 4

2.1.2.2 Sự phân bố 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái 4

2.1.4 Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 5

2.1.4.1 Đặc trưng dinh dưỡng 5

2.1.4.2 Quá trình phát triển của vi khuẩn B.t 6

2.1.4.3 Đặc tính sinh lý của vi khuẩn B.t 6

2.1.4.4 Đặc điểm sinh hoá 6

2.1.5 Tính năng di truyền của Bacillus thuringiensis 7

2.1.5 Bộ gene của Bacillus thuringiensis 7

2.1.5.1 Những Cry gene 8

2.1.5.2 Phân loại gen độc tố 8

2.1.6 Phân loại Bacillus thuringiensis 10

2.1.7 Sự khác nhau về độ độc của các biến loài B.t 10

2.1.8 Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn B.t 10

2.1.9 Chất độc của vi khuẩn B.t 10

2.1.9.1 exotoxin 10

2.1.9.2 δ-endotoxin 11

2.2 Khía cạnh an toàn của độc tố tinh thể 16

2.2.1 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người 16

2.2.2 Ảnh hưởng đến môi trường 17

2.2.2.1 Nước ngầm và hệ sinh thái đất 17

2.2.2.2 Động vật và côn trùng 17

2.3 Những phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis 18

2.4 Những phương pháp mô tả đặc tính của Bacillus thuringiensis 18

2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam 19

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 20

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian, địa điểm 21

3.1.1 Thời gian 21

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 21

3.2 Vật liệu 21

3.2.1 Nguồn gốc mẫu 21

3.2.2 Thiết bị 23

3.2.3 Dụng cụ 23

3.2.4 Hoá chất 23

3.3 Phương pháp thực hiện đề tài 24

3.3.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn 24

3.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 24

3.3.3 Thử hoạt tính sinh học diệt sâu 25

3.3.4 Phát hiện gen cry1Ab bằng kỹ thuật PCR 27

3.3.4.1 Phương pháp ly trích DNA 27

3.3.4.2 Phương pháp PCR 28

3.3.4.3 Phương pháp điện di và đọc kết quả 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Phân lập Bacillus thuringiensis 30

4.2 Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập được 34

4.3 Thử hoạt tính sinh học diệt sâu 37

4.4 Phát hiện gen cry1Ab bằng kỹ thuật PCR 38

4.4.1 Kết quả ly trích DNA 38

4.4.2 Kết quả phản ứng PCR sử dụng cặp primer TY6 và TY14 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

Tài liệu tham khảo 42 Phụ lục

EDTA : Ethyleneediamine tetraacetic acid

EDTA : Ethylenediamine tetra acetic acid

PCR : Polymerase Chain Reaction

PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7

Bảng 3.1 Danh sách mẫu đất thu thập tại một số tỉnh 21

Bảng 3.1 (tt) Danh sách mẫu đất thu thập tại một số tỉnh 22

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu 27

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR và lượng cần đủ cho một phản ứng 28

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp primer TY6 và TY14 29

Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái của các dạng khuẩn lạc thu được 31

Bảng 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 32

Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu 34

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis 4

Hình 2.2 Sơ đồ biểu diễn một cây chủng loại phát sinh 9

Hình 2.3 Cấu trúc của Cry protein 13

Hình 2.4 Cấu của Cyt protein 13

Hình 2.5 Sơ đồ biểu diễn sự chuyển hoá các tiền độc tố 15

Hình 3.1 Sơ đồ các bước phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ đất 25

Hình 3.2 Hình ảnh một nghiệm thức trong thí nghiệm 26

Hình 3.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm xác định hoạt tính sinh học 26

Hình 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc B Thuringiensis của mẫu TN2 30

Hình 4.2 Sơ đồ thể hiện kết quả phân lập 33

Hình 4.3 Vi khuẩn Bacilus thuringiensis 34

Hình 4.4 Nghiệm thức TN2 sau 1 ngày 37

Hình 4.5 Mẫu sâu chết của nghiệm thức đối chứng dương 37

Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA tổng số các chủng Bacillus thuringiensis 39

Hình 4.7 Kết quả PCR khi khuếch đại bằng cặp primer TY6 và TY14 40

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu hại cây trồng và nông sản bảo quản đã được khuyến khích, ứng dụng để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá

học, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là B.t) được dùng

rộng rãi nhất Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn này từ môi trường của nhiều nước trên thế giới với hy vọng tìm ra

những chủng B thuringiensis có phổ gây bệnh mới và khoảng vật chủ rộng hoặc nâng cao hoạt tính các chủng B thuringiensis đối với các nhóm côn trùng mới, hay tìm kiếm

nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuật di truyền tiếp theo Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là công nghệ gen đã mở ra

những tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học B thuringiensis Việc làm giàu thêm bộ sưu tập các chủng B thuringiensis phân lập ở

Việt Nam và nguồn gen quý từ những chủng này nhằm tạo ra các chủng tái tổ hợp mới

có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loài côn trùng quan trọng là rất cần thiết Với

vị thế là một trường đại học có thế mạnh về lĩnh vực nông nghiệp trường đại học Nông Lâm có nhiều công trình nghiên cứu thiết thực phục vụ cho ngành nông nghiệp Tuy

nhiên chưa có công trình chính thức nào nghiên cứu về Bacillus thuringiensis Với

mong muốn đóng góp một phần công sức nhỏ bé của mình cho ngành công nghệ sinh

học của trường chúng tôi tiến hành phân lập, phân loại các chủng B thuringiensis từ

một số địa phương, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tính chất của các

chủng Bacillus thuringiensis phân lập được nhằm tìm kiếm các chủng Bacillus thuringiensis

1.2 Yêu cầu của đề tài

Phân lập, xác định đặc tính và đánh giá khả năng diệt sâu thuộc bộ cánh vảy của

các chủng Bacillus thuringensis trong các mẫu đất từ các nguồn khác nhau của một số

tỉnh có sinh thái khác nhau ở Nam trung bộ, Tây nguyên và Nam bộ

1.3 Nội dung thực hiện

- Phân lập Bacillus thuringiensis từ đất

- Quan sát kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn Bacillus thuringiensis

- Thử hoạt tính sinh học trên sâu khoang (Spodoptera litura) để phát hiện chủng

mang gene Cry1

- Phát hiện gen cry1Ab bằng kỹ thuật PCR

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Côn trùng là nhóm sinh vật đa dạng nhất trên Trái Đất, với hơn 1 triệu loài đã được

mô tả chiếm hơn một nửa tổng số tất cả các loài sinh vật sống mà con người biết đến

Có khoảng 5.000 loài chuồn chuồn; 2.000 loài bọ ngựa; 20.000 loài châu chấu; 17.000 loài bướm; 120.000 loài hai cánh; 82.000 loài cánh nửa; 350.000 loài cánh cứng và khoảng 110.000 loài cánh màng Nhiều loài ảnh hưởng tiêu cực đến con người: Gây thiệt hại cây trồng và hoạt động như các vector truyền bệnh cho cả con người và động vật, chẳng hạn như bệnh sốt rét và sốt vàng da (Glazer và Nikaido, 1994) Vì vậy, con người mong muốn kiểm soát côn trùng Khi được phát triển song song với sự phát triển của ngành hóa học, chất hóa học đã được bắt đầu được sử dụng để kiểm soát dịch hại vào giữa năm 1800 Việc sử dụng các hóa chất vô cơ và các hợp chất asen hữu cơ

đã được theo sau bởi các hợp chất organochlorine, organophosphates, carbomates, pyrethroid và formamidines (Glazer và Nikaido, 1994) Những hóa chất này rất hiệu quả trong việc diệt và kiểm soát nhiều loài sâu hại Tuy nhiên, chúng ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến hệ sinh thái bao gồm tích lũy dư lượng chất độc trong tự nhiên, vấn đề sức khỏe của động vật có vú và sự phát triển của sâu kháng thuốc (Glazer và Nikaido, 1994) Những vấn đề liên quan với thuốc trừ sâu hóa học đã định hướng con người tìm ra những biện pháp kiểm soát dịch hai an toàn hơn và thân thiện hơn với thiên nhiên thay thế cho biện pháp kiểm soát côn trùng bào thuốc hoá học

Trong tự nhiên, một số vi sinh vật có tiềm năng để sản xuất một số tác nhân sinh học có khả năng lây nhiễm các sinh vật sống khác bao gồm cả côn trùng Nhiều loài trong số các tác nhân lây nhiễm có một phổ ký chủ hẹp, không độc hại đối với côn trùng có lợi hoặc động vật có xương sống (Glazer và Nikaido, 1994) Vì vậy, việc sử dụng các vi sinh vật gây bệnh không được phát triển như là biện pháp sinh học kiểm soát dịch hại Virus côn trùng (baculoviruses), một số nấm, động vật nguyên sinh và vi khuẩn đã được sử dụng làm tác nhân sinh học kiểm soát sâu bệnh Trong số tất cả

những tác nhân sinh học kiểm soát sâu bệnh, Bacillus thuringiensis là các vi sinh vật

quan trọng nhất với các hoạt động gây bệnh qua đường tiêu hoá chống lại nhiều loài

côn trùng

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

2.1.1 Lịch sử của Bacillus thuringiensis

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (B.t) được phân lập lần đầu tiên bỡi một nhà khoa học người Nhật S Ishiwata vào năm 1901, từ ấu trùng tằm (Bombyx mori) Năm 1911,

nhà côn trùng học người Đức phát hiện tại vùng Thuringi vùng Địa Trung Hải sau khi

phân lập trên loài sâu xám Năm 1915 được gọi là Bacillus thuringiensis

Trong thập kỷ 60 của thế kỷ 20 người ta còn phát hiện nhiều biến loài trên sâu xám, sâu róm thông, sâu xanh…và đã chế tạo ra chế phẩm B.t

Ở Việt Nam chế phẩm B.t được nghiên cứu từ năm 1971

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố

2.1.2.1 Đặc điểm phân loại

bướm đêm và bướm, cũng như trên bề mặt tối của thực vật

của chúng Giống như các thành viên khác của chi, chúng có khả năng sản xuất nội bào tử

Hình thái cá thể B.t rất đơn giản, quá trình sống có thể chia thành 3 giai đoạn

+ Thể dinh dưỡng

Thể dinh dưỡng dạng que hai đầu tù, tựu như lạp xường, kích thước 1,2 - 1,8 µm x

3 – 5 µm Lông roi mọc xung quanh, hơi động hoặc không động Chúng thường tồn tại một cá thể hay hai cá thể liền nhau Phản ứng Gram dương Thể dinh dưỡng là giai đoạn sinh sản phân chia ngang Trong thời kỳ sinh sản thường có từ 2 đến 8 thể dinh dưỡng liền nhau thành chuỗi Lúc này sinh trưởng nhanh, trao đổi chất nhiều dễ nuôi cấy trên môi trường

+ Nang bào tử

Khi cơ thể già, một đầu nào đó trong cơ thể hình thành bào mầm hình bầu dục, còn đầu kia hình thành tinh thể hình thoi Đó là giai đoạn nang bào tử Nang bào tử hình trứng dài to hơn thể dinh dưỡng Nếu dùng thuốc nhuộm fusin nhuộm màu, thì thể dinh dưỡng màu đở, tinh thể màu đỏ sẫm, bào mầm không màu, chỉ nhìn thấy một vầng chiết quang

+ Bào mầm và tinh thể

Khi nang bào tử phát triển đến một giai đoạn nào đó, chúng nứt ra, phóng bào mầm

và tinh thể Kích thước bào mầm từ 0,8 x 2 µm đến 0,9 x 2 µm Bào mầm ở dạng ngủ nghỉ có thể đề kháng với các điều kiện môi trường bất lợi Tinh thể thường có kích thước thay đổi theo biến loài, thường vào khoảng 0,6 x 2 µm; hình thoi, cũng có loại hình tròn, hình bầu dục, hình vuông theo biến loài và loại môi trường Tinh thể là một loại protein là chất diệt sâu có hiệu quả chủ yếu

2.1.4 Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

2.1.4.1 Đặc trưng dinh dưỡng

Vi khuẩn B.t có thể mọc trên các loại môi trường nuôi cấy, trên môi trường khác nhau hình thái khuẩn lạc sẽ khác nhau

Trên môi trường pepton agar bề mặt khuẩn lạc rộng, hình tròn, nuôi trong 72 giờ đường kính có thể đạt 1cm; khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt phẳng, mép hơi có dạng phóng xạ giống dạng thảm, có tuyến phóng xạ dạng sợi

Trên môi trường glucose 2,2%, agar nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 24 giờ khuẩn lạc màu vàng, sau 48 giờ có hình vòng tròn dày, đường kính 3 mm, giữa có vòng màu sẫm hơn, bề mặt màu trắng bóng, khô, thô mép uốn, sau 3 ngày đường kính đạt 2cm

2.1.4.2 Quá trình phát triển của vi khuẩn B.t

Theo Bechtel và ctv (1976), trong quá trình phát triển của vi khuẩn chúng trải qua rất nhiều biến đổi về sinh lý sinh hoá Nếu thông qua kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử ta thấy sự hình thành bào mầm trải qua 7 giai đoạn:

- Giao đoạn I (7 giờ): Sợi trục hình thành nhiễm sắc thể

- Giai đoạn II (7 giờ): Phát sinh màng tế bào hoàn thành vách tiền bào tử

- Giai đoạn III (8 – 9 giờ): Tiền bào tử tách ra từ từ trong tế bào mẹ

- Giai đoạn IV – VI (8 – 12 giờ): Xung quanh bào tử hình thành vỏ bào tử, màng ngoài và bào tử được hình thành Tinh thể xuất hiện vào đầu của kỳ VI dần dần lớn lên

- Giai đoạn VII (Sau 12 giờ): Bào tử trưởng thành

2.1.4.3 Đặc tính sinh lý của vi khuẩn B.t

- Nhiệt độ: Có thể sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ 12 - 40oC, nhiệt độ thích hợp là 27 – 32oC, 35 - 40oC sinh trưởng nhanh nhưng chóng lão hoá, nhiệt độ thấp chúng sinh trưởng rất chậm

- Nhu cầu O2: B.t là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng sống trong điều kiện thiếu O2

- Độ pH: thích hợp với điều kiện kiềm, pH thích hợp là 7,5

2.1.4.4 Đặc điểm sinh hoá

- Làm ngưng kết sữa

- Trong đường glucose, fructose, glycerin, tinh bột, maltose, trehalose sẽ hình thành acid

- Indol (-), methyl red (+), VP (+), có tác dụng hòa tan trong môi trường huyết

ngựa agar, cianat (+), nitrate (+), citric (-), sunphat (-)

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

2.1.5 Tính năng di truyền của Bacillus thuringiensis

2.1.5.1 Bộ gene của Bacillus thuringiensis

Genome của B thuringiensis có kích thước khoảng 2,4 triệu đến 5,7 triệu cặp base

(Carlson và ctv, 1994) Bản đồ di truyền được xây dựng cho B thuringiensis và đã so

sánh với bản đồ di truyền của B cereus Sự so sánh cho thấy chromosome của hai loài

tương đồng 50% (Carlson và Kostø, 1993; Carlson và ctv, 1996) Hầu hết các dòng B

thuringiensis chứa một vài plasmid DNA từ 2kb đến lớn hơn 200kb (Carlton và

Gonzalez, 1985) Chúng chiếm đến 20% tổng số DNA (Aronson, 2002) Những gene (cry gene) mã hoá cho protein tinh thể bào tử vỏ hầu hết chúng được mang trên plasmid lớn (Li và ctv, 1991) Những nghiên cứu lai trình tự cho thấy rằng những gene

cry cũng được tìm thấy trong chromosome của B thuringiensis (Carlson và ctv, 1994)

2.1.5.2 Những Cry gene

Những gene cry mã hoá cho protein tinh thể diệt côn trùng hầu hết chúng định vị trên những plasmid lớn (Gonzales và ctv, 1982) Một vài gene độc tố (cry và cyt) đã được tạo dòng và giải trình tự Hiện nay đã có 32 nhóm gene cry và 2 nhóm gene cyt với hơn 200 gene mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng (ICP) (Crickmore và ctv, 1998)

Một vài dòng B thuringiensis có thể chứa gene cry đa chức năng thường mang bên

sườn bởi yếu tố gene nhảy hoặc trình tự chèn Do đó, những dòng này có khả năng tổng hợp nhiều hơn một protein tinh thể bào tử vỏ (Thomas và ctv, 2001)

2.1.5.3 Phân loại gene độc tố

Các độc tố trừ sâu của các chủng B thuringiensis trước đây đã được chia thành 4

nhóm chính: Cry I, Cry II, Cry III, Cry IV dựa theo hoạt tính của độc tố Các protein cry I độc với côn trùng cánh vảy, Cry II độc với cả cánh vảy và hai cánh, cry III độc với côn trùng cánh cứng và Cry IV độc với côn trùng hai cánh Các protein này lại được chia thành các dưới lớp (A, B, C…) và dưới nhóm (a, b, c, ) theo trình tự của các

DNA của gen độc tố Trong những năm gần đây, khi các chủng B thuringiensis phân

lập được ngày càng tăng cũng như các gen của chúng được xác định, rõ ràng cách

phân loại đầu tiên không thể phù hợp với nhiều gen độc tố B thuringiensis mới phát

hiện Do vậy, một hệ thống phân loại mới được đưa ra Trong sơ đồ phân loại mới các

protein trừ sâu (Cry protein) B thuringiensis được phân chia dựa trên mức độ đa dạng

tiến hóa, được đánh giá bằng thuật toán nhất định

Hình 2.2 Sơ đồ biểu diễn một cây chủng loại phát sinh của các cry protein Cry1

và Cry7 có độ tương đồng nhỏ hơn 45%, Cry1A và Cry1B có mức giống nhau trong khoảng 45 - 78% và Cry1Ab và Cry1Ae có mức giông nhau trong khoảng 78 - 95%

http://mmbr.asm.org/cgi/content/full/62/3/807

2.1.6 Phân loại Bacillus thuringiensis

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis có quan hệ gần với Bacillus cereus, cho nên trong phân loại còn có nhiều tranh luận Có người cho rằng vi khuẩn B.t là vi khuẩn B cereus, nhưng có người cho nó là loài độc lập Hai loài này khác nhau ở chỗ hình

thành tinh thể hay không, không sử dụng muối citrat; muối photphat sót lại của bào

mầm của B.t nhiều gấp 10 lần so với B cereus Với 3 đặc điểm khác nhau trên B.t là

một loài và có nhiều biến loài

Vào năm 1962, Barjac và Bonnefoll đã nghiên cứu sinh hoá và huyết thanh học của

24 hệ tinh thể B.t và chia ra làm 8 biến loài

Các biến loài khác nhau có sơ đồ điện esteraza khác nhau (Norris, 1964)

Vào năm 1974, Bergey căn cứ vào kiểu huyết thanh mà chia B.t ra làm 17 biến loài,

11 kiểu huyết thanh

2.1.7 Sự khác nhau về độ độc của các biến loài B.t

Các biến loài khác nhau thì có độ độc khác nhau

Tiêu chuẩn để chọn độ độc là kiểu huyết thanh, độ độc UI/mg, độ lớn của tinh thể

2.1.8 Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn B thuringiensis

Tác dụng gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn B.t đối với côn trùng là qua thức ăn vào

cơ thể Sự sinh sản của vi khuẩn có thể làm cho côn trùng chết, nhưng chất độc do vi khuẩn sinh ra làm côn trùng chết nhanh hơn Tác dụng diệt sâu của vi khuẩn có mối quan hệ mật thiết với cơ chế gây bệnh và vật chủ

2.1.9 Chất độc của vi khuẩn B thuringiensis

Chất độc của vi khuẩn B.t được chia làm 2 loại:

- δ-endotoxin: tinh thể bào tử vỏ

- exotoxin: sản phẩm trao đổi chất tiết ra ngoài cơ thể vi khuẩn bao gồm:

α-exotoxin, β- exotoxin, γ - exotoxin

2.1.9.1 Exotoxin

a) α- exotoxin: α- exotoxin là protein bị nhiệt phá hoại (120oC trong 20 phút),

chúng được sinh ra trước khi hình thành bào mầm và tinh thể

b) β- exotoxin

Được Meconne phát hiện đầu tiên vào năm 1959

Đặc điểm của β- exotoxin

Không phải protein mà là chất adenilic, hầu hết có gốc photphatic, tỷ lệ adenine:photphatic là 1:1,06 hoặc 1:1,08; có một số nghiên cứu tỷ lệ này là 1:1 Có tính bền nhiệt (ổn định ở nhiệt độ 120oC trong 15 phút), có thể tan trong nước

Kết cấu của chất độc ngoài bao gồm 2 loại adenilic acid có tên gọi là thuringiensin A và thuringiensin B Cả 2 đều có một adenin, 1 nucleose, 1 phosphoric acid và một hợp chất cacbon chưa xác định Chất độc A là tự do, chất độc B là kết hợp thành γ - endolipoide

Được sinh ra trước khi hình thành bào mầm và tinh thể

Phạm vi và hiệu quả diệt sâu của chất độc β

Phạm vi diệt sâu rộng có thể diệt được các loài thuộc bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh cứng, bộ cánh màng, rệp và nhện (Hempei, 1967)

c) γ- exotoxin: γ- exotoxin là loại enzym chưa xác định

phương liên quan đến gene cry1 (Aranson và ctv, 1976), tinh thể hình khối liên quan

đến gene cry2 (Ohba và Aizawai, 1986), tinh thể hình vuông liên quan đến gene cry3

(Hernstadt và ctv, 1986), tinh thể hình không xác định liên quan đến gene cry4 (Federici và ctv, 1990)

b) Sự hình thành tinh thể

Dùng chất đồng vị đánh dấu chứng minh protein của tinh thể là do protein của tế bào vi khuẩn cung cấp Sự chuyển hoá đó là một quá trình, phát sinh vào thời kỳ đầu của bào mầm Protein tinh thể được tổng hợp khi xuất hiện kháng nguyên tinh thể Sự hình thành tinh thể liên hệ mật thiết với màng bào mầm (exosporium), nó được tổng hợp trên màng bào mầm, thậm chí người ta còn cho rằng sự hình thành tinh thể là do

sự sản sinh quá lượng của màng bào mầm (Donald B Bechtel và Lee A Bulla, 1976)

Sự hình thành bào mầm có quan hệ mật thiết với sự hình thành tinh thể Cơ chế của

nó là ức chế hoạt động tổng hợp enzyme phân giải guanylic acid vì thế ngăn cản sự lợi

dụng glucose của vi khuẩn phân giải ra acetic acid và chất trao đổi acetic acid rất cần thiết cho sự hình thành tinh thể độc

Nhiều nhà khoa học ủng hộ quan điểm: Silic (Si) hình thành lưới để ngưng kết

protein Morrison đã phân tích được trong tinh thể của biến loài B thuringiensis var

0,35 – 0,43% Si (trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002)

c) Thành phần chất độc của tinh thể

Tinh thể không hoà tan trong nước hoặc các chất hữu cơ (clorofooc, acetol, ether), nhưng có thể hoà tan trong dung dịch kiềm Tinh thể có thể ổn định trong các dung dịch có phạm vi pH rộng (4 - 12) Có thể bị biến đổi tính chất trong trichloroacetic acid (CCl 3 COOH), HgCl Có tính chịu nhiệt nhất định ở 65oC có thể giữ được 1 giờ,

80oC được 20 phút

Tinh thể là protein có 18 loại acid amin tổ thành, hàm lượng acid amin của tinh thể các biến loài khác nhau đều có điểm chung là tỷ lệ các acid glutamic, asparagic, leucine là nhiều nhất, các acid methionic, tryptophane là ít nhất

d) Cấu trúc của chất độc tinh thể

Trong quá trình phát sinh bào tử, B thuringiensis sản xuất một hoặc nhiều protein

lớn bao gồm thể vùi kết tinh, delta (δ) endotoxins, có thể dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi tương phản pha Có hai loại δ-endotoxins; cry (crystal) độc tố hoạt động thông qua các thụ thể đặc trưng và những độc tố cyt (cytolytic) không đặc trưng với những thụ thể không được biết đến (Höfte and Whitely, 1989; de Maagd và ctv, 2000) Cả hai được phân loại trên cơ sở trình tự amino acid tương đồng của chúng Bốn cấp bậc đã được xác định tùy thuộc vào vị trí của nó trong một cây phát sinh loài Protein ít hơn 45% trình tự amino acid tương đồng tương ứng ở cấp bậc thứ nhất, và 78% và 95% độ tương đồng là ranh giới của cấp bậc thứ hai và thứ ba (de Maagd và ctv, 2001)

Ba cấu trúc của các dạng hoạt động của các protein độc tố cry1A, cry2, cry3A và cyt2A đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật X-ray crystallography (Grochulski và ctv, 1995; Li và ctv, 1991; Li và ctv,, 1996) Cry proteins giống nhau một cách đáng chú ý, mỗi cry protein có 3 miền Đầu N của miền I bao gồm 6 vòng xoắn kép xung quanh một chuỗi xoắn lõi trung tâm và tham gia vào việc chèn màng và sự hình thành lỗ Miền II có ba phiến với ba nếp gấp đối xứng Đầu C của miền III bao gồm hai phiến đối song song ( hình 2.3) Cả miền II và miền III có liên quan đến thụ thể nhận dạng và

liên kết Ngoài ra, gần đây chức năng hình thành lỗ của miền III đã được tìm thấy (de Maagd và ctv, 2001)

Ngược lại, cyt2A protein có một miền duy nhất trong đó hai lớp bên ngoài của xoắn α quấn quanh một hỗn hợp phiến β (Schnepf và ctv, 1998) Không giống như các cry protein , cyt protein không nhận ra các thụ thể đặc trưng trên biểu mô ruột và thể hiện hoạt động tan huyết (Crickmore và ctv, 1998).

Hình 2.3Cấu trúc của Cry protein

http://www.isb.vt.edu/news/2003/news03.jul.html

Hình 2.4Cấu của Cyt protein

http://www.mitochondrial.net/ showabstract.

e) Hiệu suất gây độc của tinh thể

Khi xác định độ độc của tinh thể, người ta phát hiện protein có phân tử lượng 200.000 Da cho côn trùng ăn sẽ gây độc, nhưng tiêm lại không độc; phân tử lượng 5.000 – 10.000 Da dù tiêm hay ăn đều gây độc Gần đây người ta nghiên cứu ngoài phân tử lượng ra tinh thể phải có nhiều polypeptid Tuy thành phần không như nhau nhưng đoạn cuối phải có aspartic acid

Độ độc của tinh thể khác nhau tuỳ theo các biến loài Tinh thể có hình dạng khác nhau độ độc cũng khác nhau Những tinh thể có hình dạng gần tròn có hiệu quả đối với các loài sâu bộ cánh vảy, những tinh thể nhiều cạnh ngắn có độ độc không bằng loại tròn nhưng vẫn mạnh, còn những tinh thể nhiều cạnh dài độ độc rất kém đối với nhiều loài sâu

f) Cơ chế gây bệnh của chất độc tinh thể

Khi vi khuẩn vào ruột giữa của côn trùng không hình thành các enzyme mà gây độc chủ yếu là do chất độc tinh thể Sau khi tinh thể hoà tan trong ruột côn trùng chỉ mấy phút là côn trùng tê liệt, chỉ 55 phút là vách ruột bị vỡ, làm cho các tế bào thượng

bì ruột giữa rụng, để lộ màng đáy mỏng tạo điều kiện cho tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn xâm nhập Nghĩa là sau khi sâu ăn vi khuẩn bào mầm nảy mầm tế bào dinh dưỡng chui vào màng thực quản xâm nhập vào thượng bì ruột giữa bị phá hoại, cuối cùng tế bào dinh dưỡng chui vào màng đáy các chất trong ruột lẫn với máu sâu non sẽ chết

Heimpel (1959) chỉ rõ ruột trước của sâu non có chứa proteasa có thể phân giải protein tinh thể Tinh thể có thể bị hoà tan trong ruột các loài sâu xám nhưng không hình thành độc tố từ tiền độc tố Tinh thể không hoà tan trong ruột ngài đêm rau cải nên không hình thành chất độc, cho nên loài sâu này không nhạy cảm đối với vi khuẩn B.t Có người phân tích trong ruột sâu xanh rau cải có nhiều loại enzym, cho nên người ta cho rằng protease làm cho tinh thể bị phân giải là phân tử có tác dụng gây độc

Hình 2.5 Sơ đồ biểu diễn sự chuyển hoá các tiền độc tố thành độc tố hoạt động

dưới tác dụng của kiềm yếu (pH 7,5 – 8).

Sau khi sâu non bộ cánh vảy ăn chất độc tinh thể căn cứ vào các phản ứng khác nhau mà chia ra 4 loại:

• Sau khi sâu non ăn chất độc chỉ mấy phút là ruột giữa bị tê liệt, 1 – 7 giờ màng ruột vỡ, các chất kiềm lẫn vào trong xoang làm pH tăng lên, làm cho toàn thân bị bại liệt Những loài này bao gồm tằm nhà, tằm sồi, ngài trời thuốc lá

• Sau khi sâu non ăn chất độc chỉ mấy phút làm tê liệt ruột giữa, nhưng thức ăn không vào xoang, pH máu không đổi, thân không bị bại liệt, sau 2 – 4 ngày mới chết Hầu hết sâu non bộ cánh vảy thuộc loài này

• Sau khi ăn 2 – 4 ngày mới chết, không có hiện tượng bại liệt, nhưng phải ăn cùng với bào tử và tinh thể mới có thể chết Sâu non sâu xám đốm phấn, ngài độc thuộc loại này

• Sâu non không nhạy cảm với chất độc tinh thể như ngài đêm rau cải, nhưng nếu tăng thêm số bào tử và tinh thể tỷ lệ chết có thể ở mức thấp 22 – 39%

Cơ chế gây độc của chất độc ngoài ß khá phức tạp và chậm chạp, chỉ khi lột xác và biến thái mới nhìn thấy Khi một lượng nhỏ vi khuẩn vào cơ thể sâu non phát dục hoá nhộng tuy không vũ hoá nhưng vẫn có một số biến thành sâu trưởng thành có cánh không đầy đủ Nếu lượng vi khuẩn cao hoá nhộng không bình thường, nếu cao nữa thì sâu non lột xác đã chết

Ngoài ra chúng còn biểu hiện dị dạng nhộng hoặc sâu trưởng thành, biểu hiện rõ nhất là miệng co thắt lại, mất râu môi dưới, đỉnh lưỡi dài ra…

Khi lột xác hoặc biến thái côn trùng là thời kỳ đỉnh cao của tổng hợp RNA, cho nên lúc đó tác dụng RNA trong cơ thể côn trùng bị chất độc B.t ß gây nhiễu Rõ ràng chất độc ngoài B.t ß đã có tác dụng ức chế enzym tổng hợp RNA Tác dụng ức chế này

là cạnh tranh ATP Nếu thêm vào ATP thì sẽ có tác dụng ngược lại Khi tiêm chất độc vào sâu đo lập tức miệng biến dạng, tiêm vào tế bào sâu xám hại bông tế bào sinh trưởng rất chậm đó là do sự ức chế sự tổng hợp RNA

2.2 Khía cạnh an toàn của độc tố tinh thể

2.2.1 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Tính đặc hiệu của độc tố B.t đối với côn trùng đích là một trong những tính trạng khiến B.t trở thành thuốc trừ sâu sinh học lý tưởng Trên thực tế, các chủng B.t khác nhau sản sinh ra các protein độc đối với một số loài côn trùng nhất định Độc tố của protein B.t tương tác trực tiếp với thụ thể Có nghĩa là đối với những côn trùng bị ảnh hưởng bởi protein B.t, trong ruột chúng phải có các vị trí thụ thể đặc trưng để protein

có thể kết bám May mắn là người và đại đa số các côn trùng có ích không có các thụ thể này Trước khi được đưa ra thị trường, cây trồng B.t phải trải qua rất nhiều thử nghiệm quản lý nghiêm ngặt trong đó bao gồm các nghiên cứu độc tính và khả năng gây dị ứng

Cục Bảo vệ Môi trường Hoa kỳ (US Environmental Protectin Agency US-EPA) đã triển khai những đánh giá độc tố và thậm chí các protein B.t đã được thử ở liều lượng cao hơn Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốc trừ sâu ở một số trường đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 người mỗi ngày ăn 1 gram B.t thương mại trong vòng 5 ngày, và trong các

ngày liên tục hoàn toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh” Hơn nữa, ở mức phân tử

protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày (trong điều kiện phòng thí nghiệm) (Extoxnet, 1996)

2.2.2 Ảnh hưởng đến môi trường

2.2.2.1 Nước ngầm và hệ sinh thái đất

Protein B.t tồn tại tương đối bền trong đất và được phân loại vào dạng bất động vì

nó không có khả năng di chuyển hoặc thấm qua nước ngầm Protein này không bền vững trong điều kiện đất axit, và bị phân hủy nhanh chóng khi phơi dưới ánh sáng mặt trời, dưới tác động của tia UV

Các chuyên gia đã tiến hành những nghiên cứu độc lập nhằm điều tra các ảnh hưởng của cây trồng B.t đối với sinh vật đất và các loài côn trùng khác được xem là có ích trong nông nghiệp Kết quả cho thấy, chúng không gây ra ảnh hưởng bất lợi đối với các sinh vật đất không phải là đích tấn công của chúng, thậm chí ngay cả khi các sinh vật này được xử lý B.t với liều lượng cao hơn nhiều so với thực tế có thể xảy ra trong điều kiện trồng trọt cho thấy không có sự thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh đồng có nguyên liệu thực vật B.t và cánh đồng có nguyên liệu thực vật truyền thống (Donegan và ctv, 1995), cũng như không quan sát thấy sự khác biệt giữa các cánh đồng trồng cây B.t và cây không chuyển gen B.t (Donegan và ctv,

1996 )

2.2.2.2 Động vật và côn trùng

Các thử nghiệm tiến hành trên chó, chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giông và chim cho thấy protein B.t không gây ra những ảnh hưởng có hại Cũng cần nhấn mạnh rằng, độc tố cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến các loài côn trùng có ích hoặc động vật ăn thịt như ong mật và bọ cánh cứng (Extoxnet, 1996)

Năm 1999, có một báo cáo về ảnh hưởng có hại của hạt phấn từ cây ngô B.t đến ấu trùng của loài bướm Monarch Báo cáo này đã gây ra mối quan tâm và lo ngại về những rủi ro mà thực vật B.t có thể gây ra đối với sinh vật không cần diệt Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy ngô B.t gây ảnh hưởng không đáng kể đối với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng Nỗ lực nghiên cứu hợp tác giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấp những thông tin để xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về ảnh hưởng của ngô B.t đối với quần thể bướm Monarch Họ đi đến kết luận rằng, hầu hết các giống lai thương mại, protein B.t được biểu hiện với nồng độ

thấp trong hạt phấn và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như trên cánh đồng cho thấy mọi mật độ hạt phấn đều không gây ảnh hưởng có hại trên đồng ruộng

2.3 Những phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis

B thuringiensis có thể hiện diện trong nhiều môi trường sống khác nhau, trong

những môi trường này còn chứa các dạng bào tử của các loài vi khuẩn khác Một số kỹ

thuật chọn lọc để phân lập B thuringiensis từ các môi trường Phương pháp chọn lọc

sử dụng acetate được phát triển bởi Travers và ctv, 1987 đã được sử dụng rộng rãi bởi

các nhà nghiên cứu cho việc phân lập B thuringiensis (Martin and Travers, 1989;

Carrozi và ctv, 1991; Ben-Dov và ctv, 1997; Bravo và ctv, , 1998; Hongyu và ctv,

2000.) Sodium acetate ở nồng độ 0,25 M ức chế sự nảy mầm của bào tử của B thuringiensis và một số loài có họ hàng với B thuringiensis Sau một thời gian tăng

trưởng của vi khuẩn, các tế bào sinh dưỡng được loại bỏ bằng cách xử lý nhiệt và chỉ

có dạng bào tử còn sống Sau đó chúng được cấy trên môi trường dinh dưỡng không

có acetate Sau một thời gian ủ, những khuẩn lạc của B thuringiensis có thể được phân

biệt từ những khuẩn lạc của những vi khuẩn khác bởi hình thái khuẩn lạc và quan sát kính hiển vi

Một phương pháp phân lập B thuringiensis được dựa trên sự chọn lọc bằng kháng

sinh Yoo và ctv, (1996) sử dụng các thuốc kháng sinh polymyxin B sulfate và penicilin G trong việc phân lập để loại bỏ các tế bào mà không kháng với các kháng sinh Tuy nhiên phương pháp này không được sử dụng thường xuyên như phương pháp chọn lọc bằng acetate

2.4 Những phương pháp mô tả đặc tính của Bacillus thuringiensis

Các đặc tính của chủng B thuringiensis rất quan trọng Nó có thể giúp để phân tích

sự phân bố của các gen cry và hiểu được vai trò của B thuringiensis trong tự nhiên

Hơn nữa, nó cũng rất quan trọng trong việc đánh giá tiềm năng độc hại của các chủng B.t chống lại các giống côn trùng

Điểm chính trong việc thành lập các bộ sưu tập chủng B thuringiensis là có một

phương pháp mô tả đặc tính nhanh chóng và chính xác Đến nay, nhiều phương pháp

khác nhau đã được phát triển để mô tả đặc điểm cho các chủng B thuringiensis Một

trong số những phân tích độc tính của các protein diệt côn trùng được gọi là bioassay

Nó là cần thiết để kiểm tra mỗi phân lập cho tất cả côn trùng côn trùng đích, vì thế nó

nhiên (Ceron và ctv, 1994) Kỹ thuật Southern blot được sử dụng để tìm kiếm các gen tương đồng (Kornstad and Whiteley, 1986) và phương pháp phân tích phản ứng giữa các kháng thể đơn dòng khác nhau (Höfte và ctv, 1988) đã được sử dụng để mô tả đặc

điểm của B thuringiensis phân lập mới Kiểu huyết thanh kháng nguyên lông roi (H) được thành lập để phân loại các chủng B thuringiensis trong cùng loài (de Barjac và

Bonnefoi, 1973) Tuy nhiên, chúng dự đoán không chính xác hoạt động diệt côn trùng, đồng thời chúng là các phương pháp đắt tiền và tốn nhiều thời gian cho việc xác định các độc tố mới Ngoài ra, xét nghiệm sinh hóa, DNA fingerprinting, sử dụng các đầu

dò oligonucleotide đặc biệt cho các gen độc tố B thuringiensis là khả thi, nhưng chúng

là những phương pháp rất đắt tiền và tốn thời gian (Bourque và ctv, 1993)

Việc sử dụng PCR đã đánh dấu một mốc quan trọng để phân tích các bộ sưu tập

chủng B thuringiensis (Carozzi và ctv, 1991) PCR rất nhạy, tương đối nhanh và có

thể dễ dàng sử dụng trên một thủ tục căn bản (Ceron và ctv, 1994) PCR đã được sử dụng để dự đoán các hoạt động diệt côn trùng (Carozzi và ctv, 1991), để xác định kiểu gen cry (Bourque và ctv, 1993; Glaeve và ctv, 1993; Ceron và ctv, 1994, 1995.), để xác định sự phân bố của các gen cry (Chak và ctv, 1994.) và phát hiện gen cry mới (Kalman và ctv, 1993; Kuo và Chak, 1996) Gần đây, nhiều phương pháp dựa trên nền tản phương pháp PCR đã được phát triển cho việc mô tả thêm các đặc tính của giống, chẳng hạn như PCR-RFLP, E-PCR và RT-PCR

Mặc dù Bioassay vẫn như một công cụ cần thiết để xác định chính xác hoạt động diệt côn trùng, các phương pháp khác như serotyping, phân tích DNA hay protein vẫn

còn cần thiết cho việc phân loại loài phụ của các chủng B thuringiensis

2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hoa Kỳ, Argentina, Canada, Ấn Độ, Brazil, Trung Quốc là những nước đứng đầu thế giới về diện tích cây trồng biến đổi gen trong đó có cây trồng được chuyển gen B.t phổ biến là bắp, bông vải, đậu nành

Chỉ trong vòng 13 năm từ 1995 đến 2008, diện tích canh tác các loại cây nông nghiệp biến đổi gen đã tăng vọt từ 1,6 triệu ha lên 125 triệu ha Trong đó nhiều nhất là Hoa Kỳ (63%), Argentina (21%), Canada (6%), Ấn Độ (8%), Brasil (4%), Trung Quốc (4%) và Nam Phi (1%)… Ở Hoa kỳ nông dân đã sử dụng rất nhiều giống cây biến đổi gen, ví dụ như đậu tương, chiếm 89% tổng diện tích canh tác, bông vải (83%), cải dầu