PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : HỒ BẢO QUỐC Niên khoá : 2006 – 2010 Tháng 07/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ ĐÌNH ĐƠN HỒ BẢO QUỐC KS NGUYỄN VĂN LẪM Tháng 07/2010 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: - Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho suốt trình học trường - TS Lê Đình Đơn, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp - Thầy Nguyễn Ngọc Hùng, người thầy tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực tập hồn thiện khoá luận - KS Nguyễn Văn Lẫm giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực tập vừa qua - Phòng Vi sinh Bộ môn Công nghệ Sinh học cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu phòng - Viện Nghiên cứu Cơng nghệ sinh học Môi trường trường đại học Nông Lâm cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu viện - Các bạn lớp DH06SH bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ thời gian thực tập suốt năm học vừa qua - Cha mẹ, bậc sinh thành sinh nuôi dưỡng tôi, anh chị em gia đình ln quan tâm, ủng hộ tơi học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Sinh viên thực HỒ BẢO QUỐC i TÓM TẮT Bacillus thuringiensis trực khuẩn G+, hiếu khí khơng bắt buộc, sinh protein tinh thể độc tố chống lại nhiều loại trùng khác Dựa vào đặc tính người ta sử dụng B thuringiensis làm tác nhân kiểm sốt sinh học nơng nghiệp cách rộng rãi Mục đích nghiên cứu để phân lập chủng B thuringiensis sinh độc tố diệt sâu thuộc cánh vảy (Lepidoptera) từ mẫu đất khác số tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, xác định đặc tính đánh giá độc lực chủng phân lập Tổng cộng có 188 mẫu đất thu thập Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, KonTum, Gia Lai, DakLak, Lâm Đồng, Tây Ninh 3100 vi khuẩn phân lập từ mẫu đất thu thập phương pháp phân lập sử dụng mơi trường T3 lỏng có chứa 0,25 M sodium acetate xử lý nhiệt 80oC Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc xác định 203 vi khuẩn có khuẩn lạc giống khuẩn lạc B thuringiensis Sau cho chúng mọc môi trường T3 thạch sau 48 giờ, tiến hành quan sát 203 mẫu phân lập kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần nhằm khảo sát protein tinh thể độc tố Kết xác định chủng sản sinh protein tinh thể độc tố Thử hoạt tính sinh học diệt sâu chủng B thuringiensis đối tượng sâu khoang (Spodoptera litura), kết tất chủng âm tính với Spodoptera litura Sử dụng PCR với cặp primer đặc hiệu cho gene cry1Ab chủng phân lập, khơng có chủng cho sản phẩm PCR ii SUMMARY Bacillus thuringiensis is a Gram positive, facultative anaerobic bacteria that produces proteins toxic against different insect species This feature makes it the most widely used biological control agent in agriculture The aim of this study was to isolate B thuringiensis strains that produce protein toxic against Lepidoptera from different soil samples in several provinces in South Central, South and Highland Regions of Vietnam, and to investigate their phenotypic and genotypic characterizations Total 188 soil samples in Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Kon Tum, Gia Lai, Daklak, Lâm Đồng, Tây Ninh Three thousand one hundred bacteria were isolated from these samples by sodium acetate selection and heat treatment For phenotypic characterization, 203 of these isolates were grown for 48 h and crystal protein production was observed by phase contrast microscope during spore formation Nine of 203 the bacterial colonies were identified as B thuringiensis Spherical type crystal morphology was mostly observed type among the others Examine biological activity of nine B thuringiensis strains on the subject Spodoptera litura, the results, all nine B thuringiensis strains were negative for Spodoptera litura For genotypic characterization, the cry1Ab gene content of the isolates were screened by Polymerase chain reaction (PCR) analysis In addition, DNA analysis of isolates by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) for all isolates were also carried out All nine B thuringiensis strains didn’t give PCR product iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố 2.1.2.1 Đặc điểm phân loại 2.1.2.2 Sự phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Đặc tính sinh vật học vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2.1.4.1 Đặc trưng dinh dưỡng 2.1.4.2 Quá trình phát triển vi khuẩn B.t 2.1.4.3 Đặc tính sinh lý vi khuẩn B.t 2.1.4.4 Đặc điểm sinh hoá 2.1.5 Tính di truyền Bacillus thuringiensis 2.1.5 Bộ gene Bacillus thuringiensis 2.1.5.1 Những Cry gene 2.1.5.2 Phân loại gen độc tố 2.1.6 Phân loại Bacillus thuringiensis 10 2.1.7 Sự khác độ độc biến loài B.t 10 2.1.8 Cơ chế gây bệnh vi khuẩn B.t 10 2.1.9 Chất độc vi khuẩn B.t 10 2.1.9.1 exotoxin 10 2.1.9.2 δ-endotoxin 11 2.2 Khía cạnh an tồn độc tố tinh thể 16 2.2.1 Ảnh hưởng đến sức khỏe người 16 2.2.2 Ảnh hưởng đến môi trường 17 2.2.2.1 Nước ngầm hệ sinh thái đất 17 2.2.2.2 Động vật côn trùng 17 2.3 Những phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis 18 2.4 Những phương pháp mơ tả đặc tính Bacillus thuringiensis 18 2.5 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 19 2.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 19 2.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thời gian, địa điểm 21 3.1.1 Thời gian 21 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Vật liệu 21 3.2.1 Nguồn gốc mẫu 21 3.2.2 Thiết bị 23 3.2.3 Dụng cụ 23 3.2.4 Hoá chất 23 3.3 Phương pháp thực đề tài 24 3.3.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn 24 3.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 24 3.3.3 Thử hoạt tính sinh học diệt sâu 25 3.3.4 Phát gen cry1Ab kỹ thuật PCR 27 3.3.4.1 Phương pháp ly trích DNA 27 3.3.4.2 Phương pháp PCR 28 3.3.4.3 Phương pháp điện di đọc kết 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Phân lập Bacillus thuringiensis 30 4.2 Hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis phân lập 34 4.3 Thử hoạt tính sinh học diệt sâu 37 4.4 Phát gen cry1Ab kỹ thuật PCR 38 4.4.1 Kết ly trích DNA 38 4.4.2 Kết phản ứng PCR sử dụng cặp primer TY6 TY14 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 41 Tài liệu tham khảo 42 Phụ lục DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT B thuringiensis : Bacillus thuringiensis B.t : Bacillus thuringiensis Cry : Crystal CTAB : Cethyltrimethylammonium bromide Cyt : cytolytic Da : Dalton (1Da = 1,66005380782(83) × 10−24 g) DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethyleneediamine tetraacetic acid EDTA : Ethylenediamine tetra acetic acid G+ : Gram dương ICP : Insecticidal crystal protein kb : Kilo base KDa : Kilodalton mM : Milimolar PCR : Polymerase Chain Reaction PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis sp : Species TAE : Tris Acetate EDTA TE : Tris EDTA U : Unit UV : Ultra Violet μl : Microliter μM : Micromolar vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hoá vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bảng 3.1 Danh sách mẫu đất thu thập số tỉnh 21 Bảng 3.1 (tt) Danh sách mẫu đất thu thập số tỉnh 22 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu 27 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR lượng cần đủ cho phản ứng 28 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp primer TY6 TY14 29 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái dạng khuẩn lạc thu 31 Bảng 4.2 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 32 Bảng 4.3 Kết thí nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu 34 viii DL3 DL5 PM10 MY3 KR1 36 4.3 Thử hoạt tính sinh học diệt sâu Kết thử hoạt tính sinh học chủng có tinh thể hình cầu chủng có tinh thể hình tròn nhỏ đối tượng sâu khoang (Spodoptera litura), kết cho thấy khơng có chủng diệt spodoptera litura (bảng 4.3) Tơi cho chủng phân lập không mang gen cry1 mang gen cry1 không nằm plasmid mà nằm genome dạng bất hoạt nên khơng có khả diệt sâu khoang (Spodoptera litura) Hình 4.4 Nghiệm thức TN2 sau ngày Hình 4.5 Mẫu sâu chết nghiệm thức đối chứng dương 37 Bảng 4.4 Thí nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu cánh vảy đối tượng sâu khoang (Spodoptera Litura) STT Nghiệm thức Số lần lặp lại Lần Lần Lần TN1 0 TN2 0 TN3 0 TN9 0 TN14 0 TS12 0 DL3 0 DL5 0 MY3 0 10 DC- 0 11 DC+ 80% 70% 80% Kết xử lý thống kê cho ta thấy có hai nhóm nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa xếp theo hoạt tính diệt sâu từ thấp đến cao B, A, đó: Nhóm B: Giữa nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 (đối chứng âm) khơng có khác biệt có khác biệt so với nghiệm thức 11 ( đối chứng dương) (Bảng phụ lục 2) 4.4 Phát gen cry1Ab kỹ thuật PCR 4.4.1 Kết ly trích DNA tổng số Q trình ly trích DNA vi khuẩn có vai trò quan trọng nghiên cứu DNA thu phải đáp ứng yêu cầu hàm lượng độ tinh Sau tiến hành tách chiết theo quy trình 11 mẫu vi khuẩn (9 mẫu phân lập mẫu chế phẩm Biocine 16 WP), tiến hành điện di gel agarose 1% hiệu điện 100V/15 phút dung dịch TAE 0,5X, µl mẫu/giếng để kiểm tra DNA tổng số, kết ly trích thể (hình 4.5) Kết điện di gel agarose 1% cho ta thấy DNA tổng số thu 38 Nguyên nhân thu lượng DNA tổng số do: - Nhiệt độ miền nam tháng mùa khô tương đối cao (34 – 38oC), nhiệt độ tối ưu cho Bacillus thuringiensis phát triển 27 – 32oC, điều kiện nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn - Thời gian nhiệt độ ủ chưa đủ để phá vỡ vách bào tử - Sự phân lớp chưa tốt bước ly tâm Hình 4.6 Sản phẩm ly trích DNA tổng số chủng Bacillus thuringiensis phân lập 1: TN1, 2: TN2, 3: TN3, 4: TS12, 5: B.t1, 6: B.t2, 7: DL3, 8: DL5, 9: PM10, 10: MY3, 11: KR1 4.4.2 Kết phản ứng PCR sử dụng cặp primer TY6 TY14 Tiến hành khuếch đại dòng phân lập dòng B thuringiensis chế phẩm Biocine 16WP Điện di gel agarose 1% hiệu điện 100V/20 phút dung dịch đệm TAE 0,5X, µl mẫu/giếng Kết điện di gel agarose cho thấy khơng có dòng cho sản phẩm PCR Ngun nhân khơng có sản phẩm PCR là: - Tất chủng khơng mang gen cry1Ab - Chưa tìm quy trình chuẩn cho phản ứng PCR sử dụng cặp primer TY6 TY14 39 Hình 4.7 Kết PCR khuếch đại cặp primer TY6 TY14 1: TN1, 2: TN2, 3: TN3, 4: TS12, 5: B.t1, 6: B.t2, 7: DL3, 8: DL5, 9: PM10, 10: MY3, 11: KR1 40 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã phân lập chủng Bacillus thuringiensis từ 188 mẫu đất số tỉnh thuộc Nam Trung Bộ, Tây Ngun, Đơng Nam Bộ, có chủng có tinh thể hình cầu, chủng có tinh thể hình tròn nhỏ Trong chủng B thuringiensis phân lập chế phẩm Biocin 16 WP có tinh thể hình thoi - Tiến hành thử nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu cánh vảy đối tượng sâu khoang (Spodoptera litura), kết chủng âm tính với sâu khoang (Spodoptera litura) 5.2 Đề nghị - Cần phân lập thêm nhiều chủng Bacillus thuringiensis từ nhiều nguồn khác (đất, xác bã thực vật, côn trùng chết ngồi mơi trường, …) để làm phong phú sưu tập làm sở cho nghiên cứu sau - Cần xác định gene cry chủng phân lập 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bernard R Glick Jack J Pasternak 2007 Thuốc trừ sâu vi sinh Công nghệ sinh học phân tử nguyên lý ứng dụng DNA tái tổ hợp Nhà xuất khoa học kỷ thuật Hà Nội, 525 – 553 Trần Văn Mão 2008 Sử dụng vi sinh vật có ích - tập 2: Ứng dụng nấm cộng sinh sinh vật phòng trừ sâu hại Nhà xuất Nơng Nghiệp Tài liệu nước ngồi 10 11 12 13 14 Apaydin 2004 Isolation And Characterization Of Bacillus thuringiensis Strains From Different Grain Habitats Master Of Science, Biotechnology And Bioengineering, Izmir Institute Of Technology, Turkey Aronson 2002 Sporulation and δ -endotoxin synthesis by Bacillus thuringiensis Cellular and Molecular Life Sciences, 59, 417-425 Ben-Dov, E., Wang, Q., Zaritsky, A., Manasherob, R., Barak, Z., Schneider, B., Khamraev, A., Baizhanov, M., Glupov, V., Margalith, Y 1999 Multiplex PCR screening to detect cry9 genes in Bacillus thuringiensis strains Applied and Environmental Microbiology, 65, 3714-3716 Bravo A, Sarabia S, Lopez L, Ontiveros H, Abarca C, Ortiz A, Ortiz M, Lina L, Villalobos FJ, Peña G, Nez-Valdez ME, Soberón M, Quintero R 1998 Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection Appl Environ Microbiol, 64(12):4965-72 Carlson, Johenson, Lecadet and Kolstø 1996 Genomic organization of the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis subsp berliner 1715, Microbiology, 142, 1625-1634 Carlson CR, Caugant DA, Kolstø AB 1994 Genotypic Diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Strains Appl Environ Microbiol 60(6): 1719-25 De Maagd, Bravo and Crickmore 2001 How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world Trends in Genetics, 17, 193- 199 Donalld B Bechtel and Lee A Bulla 1976 Electron Microscope Study of Sporulation and Parasporal Crystal Formation in Bacillus thuringiensis American Society For Microbiology 1472-1481 E Ben-Dov, A Zaritsky, E Dahan, Z Barak, R Sinai, R Manasherob, A Khamraev, E Troitskaya, A Dubitsky, N Berezina and Y Margalith 1997 Extended screening by PCR for seven cry-group genes from field- collected strains of Bacillus thuringiensis Appl Environ Microbiol., 4883-4890, Vol 63, No 12 E Schnepf, N Crickmore, J Van Rie 1998 Pesticidal Crystal Proteins Bacillus thuringiensis and Its Microbiol Mol Biol Rev 62(3):775-806 Gonzales, J.M and Carlton 1980 Patterns of plasmid DNA in crystalliferous strains of B thuringiensis Plasmid, 3, 92-98 Gonzales, J.M., Brown, B.J., Carlton 1982 The transfer of Bacillus thuringiensis plasmid coding for δ -endotoxin among the strains of Bacillus 42 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 thuringiensis and Bacillus cereus Proceedings of National Acad Sci USA, 79, 6951- 6955 Grochulski P, Masson L, Borisova S, Pusztai-Carey M, Schwartz JL, Brousseau R and Cygler M 1995 Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation Journal of molecular biology, 254(3):447-64 H Höfte and H R Whiteley 1989 Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis Microbiol Mol Biol Rev 53(2):242-255 Hernstand, Soares, Wilcox and Edwards 1986 A new strain of Bacillus thuringiensis with activity against coleopteran insects Bio/Technology, 4, 305-308 Chak, Chao and Tseng 1994 Determination and Distribution of cry -Type Genes of Bacillus thuringiensis Isolates from Taiwan Applied And Environmental Microbiology 60(7):2415-2420 Kuo, W.-S and Chak 1996 Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA, Appied and Environmental Microbiology, 62, 1369-1377 Li JD, Carroll J, Ellar DJ 1991.Crystal structure of insecticidal -endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Å resolution Nature, 31;353(6347):815-21 Mahillon, Rezsöhazy, Balet and Delcour 1994 IS231 and other Bacillus thuringiensis transposable elements Genetica, 93, 13-26 N B Carozzi, V C Kramer, G W Warren, S Evola and M G Koziel 1991 Prediction of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains by polymerase chain reaction product profiles Appl Environ Microbiol, 57(11): 3057-3061 Phyllis A W Martin and Russell S Travers 1989 Worldwide Abundance and Distribution of Bacillus thuringiensis Isolates Appl Environ Microbiol 55(10):2437-2442 Russell s Travers, phyllis a W Martin, and charles f Reichelderfer 1987 Selective Process for Efficient Isolation of Soil Bacillus spp Applied And Environmental Microbiology, P 1263-1266 S Kalman, K L Kiehne, J L Libs, and T Yamamoto 1993 Cloning of a novel cryIC-type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp galleriae Appl Environ Microbiol, 59(4): 1131–1137 Sue Kalman, Kristine L Kiehne, John L Libs, And Takashi Yamamoto 1993 Cloning Of A Novel Cryic-Type Gene From A Strain Of Bacillus thuringiensis Subsp galleriae Applied And Environmental Microbiology, P 1131-1137 Thomas, Morgan, Whipps and Saunders 2001 Plasmid transfer between Bacillus thuringiensis subsp israelensis strains in laboratory culture, river water and dipteran larvae Appied and Environmental Microbiology, 67, 330338 43 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng phụ lục Các dạng khuẩn lạc thu trình phân lập STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Mẫu đất (1) TS1 TS2 TS5 TS7 TS11 TS12 TS13 TS14 VT1 VT2 VT3 VT4 VT5 VT6 VT7 VT8 AN1 AN2 AN3 AN4 AN5 AN6 AN7 TP1 TP2 TP3 TP4 TP5 TP6 TP7 TP8 TP9 TP10 TP11 Địa điểm thu thập (2) Bình Tường - Tây Sơn - Bình Định Bình Tường - Tây Sơn - Bình Định Bình Tường - Tây Sơn - Bình Định Bình Tường - Tây Sơn - Bình Định Bình Thành - Tây Sơn - Bình Định Bình Thành - Tây Sơn - Bình Định Bình Thành - Tây Sơn - Bình Định Bình Thành - Tây Sơn - Bình Định Định Quang - Vĩnh Thạnh - Bình Định Định Quang - Vĩnh Thạnh - Bình Định Định Quang - Vĩnh Thạnh - Bình Định Định Quang - Vĩnh Thạnh - Bình Định Vĩnh Thịnh - Vĩnh Thạnh - Bình Định Vĩnh Thịnh - Vĩnh Thạnh - Bình Định Vĩnh Hòa - Vĩnh Thạnh - Bình Định Vĩnh Quang - Vĩnh Thạnh - Bình Định Nhơn Hòa - An Nhơn - Bình Định Nhơn Hòa - An Nhơn - Bình Định Nhơn Hòa - An Nhơn - Bình Định Nhơn Tân - An Nhơn - Bình Định Nhơn Tân - An Nhơn - Bình Định Nhơn Tân - An Nhơn - Bình Định Nhơn Thọ - An Nhơn - Bình Định Phước Sơn - Tuy Phước - Bình Định Phước Sơn - Tuy Phước - Bình Định Phước Sơn - Tuy Phước - Bình Định Phước Lộc - Tuy Phước - Bình Định Phước Lộc - Tuy Phước - Bình Định Phước Thuận - Tuy Phước - Bình Định Phước Thuận - Tuy Phước - Bình Định Phước Thắng - Tuy Phước - Bình Định Phước Thắng - Tuy Phước - Bình Định Thị trấn Tuy Phước - Tuy Phước - Bình Định Thị trấn Tuy Phước - Tuy Phước - Bình Định Các dạng khuẩn lạc thu (3) A, F, H, J A, B, D, G, J C, E, F, G, K A, G D, H, I C, G A, H F, H, J C, F, H, J A, H, I C, F , H D, F, H H, I A, C, H, I H, K H, I, K H D, H H, I, K A, H, I A, F, H H, J H D, F, H A, C, D, H F, H, I A, F, H F, H, I F, H C, H A, H H, J H, K D, H, I Bảng phụ lục (tt) Các dạng khuẩn lạc thu trình phân lập (1) (2) (3) 35 PC1 Cát Nhơn - Phù Cát - Bình Định A, D, H 36 PC2 Cát Nhơn - Phù Cát - Bình Định H, J, K 37 PC3 Cát Nhơn - Phù Cát - Bình Định E, H, J 38 PC4 Cát Nhơn - Phù Cát - Bình Định E, H 39 PM1 Thị trấn Bình Dương - Phù Mỹ - Bình Định H 40 PM2 Thị trấn Bình Dương - Phù Mỹ - Bình Định C, H 41 PM3 Thị trấn Bình Dương - Phù Mỹ - Bình Định F, G 42 PM4 Thị trấn Bình Dương - Phù Mỹ - Bình Định A, H, J 43 PM6 Thị trấn Bình Dương - Phù Mỹ - Bình Định C, F, H 44 PM8 Thị trấn Bình Dương - Phù Mỹ - Bình Định H, I 45 PM10 Thị trấn Bình Dương - Phù Mỹ - Bình Định H, G 46 PM11 Thị trấn Phù Mỹ - Phù Mỹ - Bình Định D, H, K 47 PM12 Thị trấn Phù Mỹ - Phù Mỹ - Bình Định D, H 48 PM13 Thị trấn Phù Mỹ - Phù Mỹ - Bình Định C, F, H 49 PM14 Thị trấn Phù Mỹ - Phù Mỹ - Bình Định F, H 50 QN1 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi H 51 QN2 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi H, I 52 QN3 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi B, H 53 QN4 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi A, F, H 54 QN5 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi H, J 55 QN6 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi H, L 56 QN7 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi D, H 57 QN8 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi A, H 58 QN9 Thị trấn Sơn Tịnh - Sơn Tịnh - Quảng Ngãi A, H 59 NH1 Hành Thiện - Nghĩa Hành - Quảng Ngãi F, H 60 NH4 Hành Thiện - Nghĩa Hành - Quảng Ngãi A, H, J 61 SH1 Hòa Thắng - Sơn Hòa - Phú Yên H Bảng phụ lục (tt) Các dạng khuẩn lạc thu trình phân lập 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 (1) SH2 SH3 SH7 SH8 SH9 SH10 TN1 TN2 TN3 TN5 TN6 TN9 TN12 TN13 TN15 TN16 TN17 TN18 BL1 BL2 BL3 BL5 BL6 DL2 DL3 DL5 DTr11 DTr13 DTe2 DTe3 KR1 KR5 KR6 KR8 KR9 (2) Hòa An - Sơn Hòa - Phú Yên Hòa Quang - Sơn Hòa - Phú Yên Hòa Thắng - Sơn Hòa - Phú Yên Hòa An - Sơn Hòa - Phú Yên Hòa Thắng - Sơn Hòa - Phú Yên Hòa Thắng - Sơn Hòa - Phú Yên Thị xã Tây Ninh - Tây Ninh Hòa Thành - Tây Ninh Dương Minh Châu - Tây Ninh Tân Biên - Tây Ninh Tân Biên - Tây Ninh Dương Minh Châu - Tây Ninh Dương Minh Châu - Tây Ninh Dương Minh Châu - Tây Ninh Hòa Thành - Tây Ninh Trảng Bàng - Tây Ninh Trảng Bàng - Tây Ninh Thị xã Tây Ninh - Tây Ninh Lộc Thắng - Bảo Lâm - Lâm Đồng Lộc Thắng - Bảo Lâm - Lâm Đồng Lộc Thắng - Bảo Lâm - Lâm Đồng Lộc Thắng - Bảo Lâm - Lâm Đồng Lộc Thắng - Bảo Lâm - Lâm Đồng Tân Châu - Di Linh - Lâm Đồng Tân Châu - Di Linh - Lâm Đồng Tân Châu - Di Linh - Lâm Đồng Phú Hội - Đức Trọng - Lâm Đồng Phú Hội - Đức Trọng - Lâm Đồng Đà Tẻ - Lâm Đồng Đà Tẻ - Lâm Đồng Ea Bông - K Rông Ana - DakLak Băng A Đrênh - K Rông Ana - DakLak EaNa - K Rông Ana - DakLak Quảng Điền - K Rông Ana - DakLak Bình Hòa - K Rơng Ana - DakLak (3) D, H H, I F, H, I H, K C, H H, J G, H, J G, J C, G E, H D, H F, H, I H, J F, G, J J, K F, K F, H, K D, H, J C, K H, J D, G H, I D, F G, K G, H A, H H, I H, I I, J H, J D, G B, H E, H F, J D, I, J Bảng phụ lục (tt) Các dạng khuẩn lạc thu trình phân lập 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 (1) CM2 CM4 CM5 CM6 CM7 MY3 MY6 MY7 MY8 AK1 AK4 DT2 DT3 DT4 DT5 (2) H' CưMgar - DakLak H' CưMgar - DakLak H' CưMgar - DakLak H' CưMgar - DakLak H' CưMgar - DakLak Đèo Mang Yang - Mang Yang - Gia Lai Pleibong - DakYa - Mang Yang - Gia Lai Trạm 219 - H'Ra - Mang Yang - Gia Lai Trường cấp I - H'Ra - Mang Yang - Gia Lai An Khê - Gia Lai An Khê - Gia Lai Dak To - Kon Tum Dak To - Kon Tum Dak To - Kon Tum Dak To - Kon Tum (3) H, L D,H, L E, G, K C, E, H H G, I B, J D, H, I C, D, H H, I D, H H, J E, H D, F, H H, I Bảng phụ lục Kết thí nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu sau chuyển đổi số liệu Nghiệm thức Mã hoá nghiệm thức Kết phân hạng TN1 0.7071 B TN2 0.7071 B TN3 0.7071 B PM10 0.7071 B TS12 0.7071 B DL3 0.7071 B DL5 0.7071 B MY3 0.7071 B KR1 0.7071 B DC- 10 0.7071 B DC+ 11 8.780 A Số liệu xử lý phần mềm MSTATC Chuyển đổi số liệu: y=(x+0,5)1/2, y số liệu sau chuyển đổi, x số liệu thô A A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 10 177.750 17.775 1769.828 0.0000 Within 22 0.221 0.010 Total 32 177.971 Coefficient of Variation = 6.95% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 10 3.00 2.121 0.707 0.00 0.06 11 3.00 26.341 8.780 0.33 0.06 -Total 33.00 47.554 1.441 2.36 0.41 Within 0.10 B Kết trắc nghiệm phân hạng mức 0,01 Case Range : 50 - 60 Variable : tilechet Function :RANGE Error Mean Square = 0.01000 Error Degrees of Freedom = 22 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.2819 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 11 = = = = = = = = = = = 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 8.780 Ranked Order B B B B B B B B B B A Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 11 10 = = = = = = = = = = = 8.780 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 0.7071 A B B B B B B B B B B Phụ lục 2.1 50 X TAE 242 g Tris base is dissolved in deionized water, 57,1 ml glacial acetic acid and 100ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) are added Volume is adjusted to 1000 ml with deionized water C X TAE 20 ml of 50X TAE buffer is taken and the volume is adjusted to 1000 ml with deionized water to obtain 1000 ml 1X TAE buffer 2.2 1X TE (pH 8.0) 10 mM Tris (pH 8,0), 1mM EDTA 2.3 Tris-HCl (1 M, pH 8.0) 121,1 g Tris base is dissolved in 800 ml of deionized water pH is adjusted to 8,0 with concentrated HCl Volume is adjusted to 1000 ml with deionized water The solution is sterilized by autoclaving 2.4 Sodium Acetate (3M, pH 5,2) 408,1 g sodium acetate (3 H2O) is dissolved in 800 ml deionized water and pH is adjusted to 5,2 by glacial acetic acid Volume is brought to 1000 ml The solution is sterilized by autoclaving 2.5 EDTA (0.5 M, pH 7.5, 8.0 and 9.5) 186,1 g of EDTA is dissolved in 800 ml of deionized water and pH is adjusted to desired value with 10 N NaOH Volume is brought to 1000 ml with deionized water The solution is sterilized by autoclaving 2.6 Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol (25:24:1) Equal volume of phenol and chloroform isoamyl alcohol (24:1) solutions are mixed The solution is stored in a light-tight bottle at +4°C for periods up to month 2.7 Ethidium Bromide (10 mg/ml) g of ethidium bromide is dissolved in 100 ml of deionized water by strring for several hours The solution is stored in a dark bottle at room temperature 2.8 Phương pháp nhuộm tinh thể protein Vật liệu, hố chất: • Dung dịch nhuộm: ml dung dịch Fuchsin bão hoà bão hoà (xem nhuộm carbolic fuchsin) trộn với 100 ml dung dịch acid carbolic 5% nước Khi dùng pha lỗng 10 lần Các bước tiến hành: • Làm vết bơi, cố định vết bơi • Nhuộm phút, rửa nước, hong khơ • Soi kính: dùng vật kính dầu Kết quả: Tinh thể bắt màu đỏ Bào tử tách rời có vòng màu đỏ ... nhiều loại enzym, người ta cho protease làm cho tinh thể bị phân giải phân tử có tác dụng gây độc 14 Hình 2.5 Sơ đồ biểu diễn chuyển ho tiền độc tố thành độc tố ho t động tác dụng kiềm yếu (pH... độc tố Thử ho t tính sinh học diệt sâu chủng B thuringiensis đối tượng sâu khoang (Spodoptera litura), kết tất chủng âm tính với Spodoptera litura Sử dụng PCR với cặp primer đặc hiệu cho gene cry1Ab... Trong năm gần nhà khoa học có nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn từ môi trường nhiều nước giới với hy vọng tìm chủng B thuringiensis có phổ gây bệnh khoảng vật chủ rộng nâng cao ho t tính chủng