Phân lập các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose

Mục đích của nghiên cứu là phân lập các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose. 21 chủng có khả năng phân giải cellulose được phân lập từ các mẫu đất và gỗ khác nhau như lá, rơm và gỗ mục thu thập trên địa bàn thành phố Hà Nội và phân thành 6 nhóm màu khuẩn lạc: tím, hồng, trắng, xanh lá, xám và vàng.

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 140 (2020) 065-070 Phân lập chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose Isolation of Cellulose-Degrading Actinomycetes Nguyễn Liêu Ba*, Hoàng Thị Phương Anh, Phạm Thu Hiền, Lê Thị Hồng Hậu Trường Đại học Bách khoa Hà Nội - Số 1, Đại Cồ Việt, Hai Bà Trưng, Hà Nội Đến Tòa soạn: 16-12-2018; chấp nhận đăng: 20-01-2020 Tóm tắt Mục đích nghiên cứu phân lập chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose 21 chủng có khả phân giải cellulose phân lập từ mẫu đất gỗ khác lá, rơm gỗ mục thu thập địa bàn thành phố Hà Nội phân thành nhóm màu khuẩn lạc: tím, hồng, trắng, xanh lá, xám vàng Khả sinh enzyme cellulase xác định xuất vòng halo mơi trường với nguồn chất CMC xung quanh thỏi thạch chứa khuẩn lạc, sử dụng thuốc thử lugol Hoạt tính cellulase chủng phân lập xác định định tính cách đo đường kính vòng halo Chủng G1, D4 G3 thể vòng phân giải lớn với đường kính vòng halo 40mm, 40mm 39mm Khả sử dụng nguồn cellulose tự nhiên (rơm, bã mía) chủng mở triển vọng ứng dụng vào nông nghiệp Từ khóa: phân lập, xạ khuẩn, phân giải cellulose Abstract The aim of this study is to isolate cellulose-degrading Actinomycetes Twenty one isolates of cellulolytic Actinomycetes were isolated from different soil and woody habitats such as, leaves, straws and rotted wood collected in Hanoi and were divided into six color groups of colony: purple-violet, pink, white, green, grey and yellow Cellulase production was indicated by the appearance of a pale halo on agar medium containing CMC as substrate around the agar piece with colony on using lugol as an indicator Cellulase activities of isolates were determined qualitatively by measuring the diameters of halo zones G1, D4 and G3, exhibited the maximum zones of halo around the agar piece with diameter of 40mm, 40mm and 39mm respectively The abilities of degrading natural cellulose (straw, sugarcane bagasse) of these three strains open up potential application in agriculture Keywords: Isolation, Actinomycetes, cellulose-degrading enzyme cellulase xạ khuẩn enzyme ngoại bào chúng có khả tương tác với cellulose tương tự enzyme hệ cellulase nấm [8] Đặt vấn đề Xạ* khuẩn nhóm vi khuẩn thật thuộc lớp Actinobacteria, Actinomycetales Phần lớn xạ khuẩn vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh Chúng phân bố rộng rãi tự nhiên, thường thấy môi trường đất, nước vi sinh vật đóng vai trò quan trọng việc tái chế nguồn chất từ phế phẩm nơng nghiệp [1,3] Đặc biệt, xạ khuẩn có khả phân giải cellulose - thành phần cấu tạo thành tế bào thực vật [8] Thực tế, đất nơi cư trú xạ khuẩn nhiều loài vi sinh vật khác Sự phát triển chậm xạ khuẩn so với vi sinh vật đất khiến cho việc phân lập xạ khuẩn từ đất trở nên khó khăn [5] Do đó, tìm kiếm chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose mang ý nghĩa quan trọng Bài báo trình bày kết phân lập xạ khuẩn có hoạt tính cellulase từ mẫu đất, lá, rơm, gỗ mục thu thập địa điểm khác thành phố Hà Nội cho mục đích tuyển chọn sơ để ứng dụng xử lý cellulose tự nhiên Cellulose nguồn carbon hữu dồi tự nhiên tích tụ hàng năm với lượng lớn nông nghiệp, công nghiệp, lâm nghiệp phế phụ phẩm ngành kinh tế [7] Hầu hết nghiên cứu enzyme cellulase vi sinh vật phân lập từ đất thường hướng nấm, khả phân giải cellulose xạ khuẩn ý [6] Tuy nhiên, số nghiên cứu cho thấy, hệ Vật liệu phương pháp 2.1 Thu thập mẫu Mẫu đất, rơm, khô, gỗ mục thu thập Hà Nội, sau giữ túi nhựa vơ trùng bảo quản điều kiện khô * Địa liên hệ: Tel: (+84) 947121115 Emai: ba.nguyenlieu@hust.edu.vn 65 Tạp chí Khoa học Công nghệ 140 (2020) 065-070 ngày Khuẩn lạc riêng rẽ cấy ria sang đĩa petri chứa môi trường ISP4 để làm 30 °C 4-7 ngày [9] 2.2 Dụng cụ hóa chất Các dụng cụ, thiết bị sử dụng thuộc phòng thí nghiệm Bộ mơn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Hóa chất sử dụng thí nghiệm hóa chất hãng Merck (Đức), Himedia (Ấn Độ) từ Trung Quốc 2.3.2 Phương pháp tuyển chọn dựa khả phân giải cellulose Các thỏi thạch có đường kính 6mm lấy từ đĩa cấy ria chủng xạ khuẩn sau đặt lên đĩa thạch chứa sẵn mơi trường ISP4 thay nguồn carbon CMC ủ 30°C Sau ngày lugol nhỏ lên đĩa thạch để quan sát khả phân giải CMC Nếu thuốc thử lugol không bắt màu quanh thỏi thạch tức xạ khuẩn có khả phân giải CMC [10] 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn Các mẫu thu thập cắt nghiền nhỏ 1g mẫu cho vào bình tam giác vơ trùng chứa sẵn 99ml nước cất vơ trùng, sau lắc nhiệt độ 30°C với tốc độ 150 vòng/phút 30 phút Sau đồng nhất, dịch huyền phù pha loãng đến độ pha loãng 10-12 dung dịch nước muối sinh lý Với độ pha loãng từ 10-8-10-12, 0,1ml dịch pha loãng trải lên đĩa petri chứa sẵn môi trường ISP4 (Tinh bột tan 10g/L, K2HPO4 1g/L, NaCl 1g/L, MgSO4.7H2O 1g/L, CaCO3 2g/L, (NH4)2SO4 2g/L, MgCl2.7H2O 0,001g/L, ZnSO4.4H2O 0,001g/L, FeSO4 0,001g/L; pH 7) có bổ sung cycloheximide (50µg/mL) sau đem ủ nhiệt độ 30°C -7 2.3.3 Phương pháp xác định số đặc điểm hình thái chủng phân lập Các chủng phân lập nuôi lỏng môi trường ISP4 môi trường cám gạo (môi trường ISP4 thay nguồn carbon cám gạo) ngày máy lắc tốc độ 150 rpm 30°C Quan sát đặc điểm canh trường pellet tạo thành Sử dụng canh trường làm tiêu nhuộm tế bào quan sát duới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần Hình 1: Khuẩn lạc chủng phân lập 66 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 140 (2020) 065-070 2.3.4 Phương pháp xác định khả phân giải nguồn cellulose tự nhiên Kết thảo luận 3.1 Phân lập sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose Rơm cắt thành đoạn dài 3cm bã mía từ Nhà máy đường Lam Sơn sấy khô 60°C 50g rơm bã mía khơ loại ngâm 1L NaOH 1% (w/v) điều kiện phòng 24h sau rửa nước sấy khô đến khối lượng không đổi [4] Từ mẫu đất, gỗ mục, lá, nhóm nghiên cứu phân lập 23 chủng có đặc điểm hình thái khác (hình 1) Màu sắc khuẩn lạc, màu sắc mặt khuẩn lạc, kết cấu bề mặt sắc tố hòa tan thể khác chủng phân lập Màu sắc khuẩn lạc phân thành nhóm: tím, hồng, trắng, xanh lá, xám đen, vàng; đa số chủng có hệ sợi khí sinh màu xám đen (7 chủng) màu trắng (6 chủng) Màu sắc mặt khuẩn lạc đa dạng phần lớn có ánh vàng cam Các chủng phân lập có kết cấu bề mặt khuẩn lạc chủ yếu nhung, số có kết cấu vơi, bột trơn Chỉ có số chủng phân lập sinh sắc tố hòa tan làm thay đổi màu môi trường màu sắc tố hòa tan khác chủng (Bảng 1) Các chủng xạ khuẩn thể khả phân giải CMC cao tuyển chọn để tiếp tục kiểm tra khả phân giải nguồn cellulose tự nhiên Sau hoạt hóa, chủng tuyển chọn ni lỏng (thể tích giống cấp 4%) môi trường ISP4 thay nguồn carbon rơm bã mía 30°C với tốc độ lắc 150 rpm Lượng bã mía rơm lại sau 4, 12 ngày rửa dung dịch acid acetic/acid nitric (80% acetic acid, 68% nitric acid (10/1, v/v)), sau rửa lại nước lọc qua rây có kích thước 0,03mm Phần cellulose sau xử lý sấy khô đến khối lượng không đổi Môi trường không cấy xạ khuẩn sử dụng làm mẫu kiểm chứng [2], [4] Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc chủng phân lập Màu khuẩn lạc Hệ sợi khí sinh Mặt K1 Xám đen Vàng kem Mẫu đất K4 Hồng cam Mẫu đất DE2 Xám đen Tím hồng X1 Vàng nâu Trắng Mẫu đất X5 Trắng Vàng cam X6 Trắng Vàng cam D1 Trắng Trắng ngà Mẫu đất D4 Xám đen Xám nhạt D5 Trắng Vàng cam G1 Phớt hồng Đỏ tím Mẫu gỗ G3 Trắng Vàng cam mục G4 Xám đen Nâu cam G7 Phớt hồng Cam G8 Trắng Tím hồng Mẫu G9 Xanh xám Xanh nhạt G10 Trắng Vàng kem G11 Trắng xanh Kem G13 Xám trắng Vàng Mẫu G14 Xám đen Vàng chanh G16 Xám đen Cam P1 Xanh Trắng xanh Mẫu P4 Xanh đen viền trắng Nâu vàng Mẫu rơm XK3 Hồng xám Nâu đen - : khơng sinh sắc tố hòa tan Nguồn Chủng 67 Kết cấu bề mặt Sắc tố hòa tan Nhung Trơn Nhung Nhung Nhung Vôi Nhung Vôi Nhung Nhung Vôi Nhung Vôi Nhung Nhung Vôi Nhung Nhung Nhung Nhung Bột Bột Nhung Vàng nhạt Tro nhạt Xám nhạt Vàng nhạt Nâu cam đậm Cam vàng Nâu nhạt Tro nhạt Xám nhạt Xám xanh nhạt Vàng chanh Cam nhạt - Đường kính vòng halo (mm) 22,3 1,2 31,7 1,5 34,0 1,7 33,0 1,0 25,7 1,2 21,3 1,2 26,7 0,6 40,3 0,6 36,0 1,0 40,3 1,5 39,3 0,6 20,0 1,0 32,3 2,1 26,0 1,0 17,3 0,6 26,0 1,0 17,0 0,0 25,0 1,0 23,0 1,7 25,7 0,6 39,0 0,0 39,0 1,7 25,3 0,6 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 140 (2020) 065-070 Hình 2: Khả phân giải CMC chủng phân lập Tiến hành kiểm tra khả phân giải CMC chủng phân lập phương pháp thỏi thạch sử dụng thuốc thử lugol thấy xuất vòng thủy phân chất xung quanh thỏi thạch (hình 2) Hầu hết chủng phân lập vi khuẩn gram dương, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nấm khơng có vách ngăn, kích thước tế bào tương tự vi khuẩn (hình 3) Đây đặc điểm hình thái đặc trưng xạ khuẩn Chủng P1 P4 có đường kính vòng phân giải CMC lớn hình dạng kích thước tế bào giống nấm nên không đưa vào sưu tập chủng xạ khuẩn Kết thí nghiệm cho thấy tất 23 chủng phân lập có khả phân giải chất CMC (hình 2, bảng 1) Số liệu khả chủng G9 G11 không lớn chủng có nguồn gốc (đường kính 17mm), G1, D4, G3, P1, P4 tạo vòng phân giải CMC lớn gấp 2,4 lần vòng phân giải CMC G9 G11 Có thể nhận định sơ khả chủng G1, G3 D4 tốt số chủng phân lập 3.2 Đặc điểm hình thái chủng phân lập Nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng phân lập thể qua hình dạng tế bào, chuỗi bào tử đặc điểm sinh trưởng mơi trường lỏng chủng Hình 3: Hình dạng tế bào chủng G14 kính hiển vi với hệ số phóng đại 1000 Hình Bào tử số chủng xạ khuẩn phân lập có dạng xoắn chi Streptomyces kính hiển vi với hệ số phóng đại 100 68 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 140 (2020) 065-070 Qua hình dễ thấy chủng D4, DE2, G9, G11, G14, K1, K4 có hình dạng chuỗi bào tử xoắn đặc trưng chi Streptomyces thay đổi không theo quy luật Sự khác biệt rõ rệt quan sát từ kết chủng G1 G8 Pellet môi trường cám gạo chủng G1 G8 có màu sắc tím tím đậm mơi trường ISP4, chủng tạo pellet có màu trắng vàng sáng (hình 5) Xạ khuẩn có khả sản sinh sắc tố hòa tan khuếch tán vào dịch canh trường Đối với mơi trường khác nhau, lồi xạ khuẩn lại sinh sắc tố hòa tan với màu sắc khác Đây đặc điểm quan trọng việc phân loại định danh xạ khuẩn [1] Màu sắc pellet, màu dịch canh trường nuôi chủng phân lập môi trường lỏng ISP4 mơi trường cám gạo thể qua hình mơ tả chi tiết bảng Sự hình thành pellet tổng hợp sắc tố chủng xảy đồng thời sau 3-4 ngày nuôi cấy Đối với số chủng X6, D4, G3, G4, G10, G14, XK3, màu pellet gần với màu dịch nuôi Một số chủng khác màu pellet không tương đồng với màu sắc tố tạo thành điển hình chủng G8, K1, D5, DE2 mơi trường ISP4 (bảng 3) Khi ni mơi trường có thành phần khác nhau, màu sắc pellet màu canh trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn khác khác Hình Màu sắc dịch canh trường pellet chủng G1 G8 môi trường (a) ISP4 (b) cám gạo Bảng 3: Màu sắc pellet dịch nuôi xạ khuẩn môi trường ISP4 môi trường cám gạo Chủng Môi trường cám gạo Màu pellet K1 Nâu xám K4 Hồng nâu DE2 Hồng X1 Nâu sáng X5 Vàng xám X6 Nâu đậm D1 Trắng ngà D4 Nâu đậm D5 Nâu nhạt G1 Tím G3 Vàng nhạt G4 Nâu nhạt G7 Vàng nhạt G8 Tím đậm G9 Nâu xám G10 Vàng G11 Xanh xám G13 Nâu cam nhạt G14 Cam G16 Nâu cam đậm XK3 Vàng nâu nhạt - : không sinh sắc tố hòa tan ISP4 Màu mơi trường Vàng nhạt Ánh vàng Vàng nhạt Nâu cam Vàng xám Nâu cam Vàng xanh nhạt Vàng nâu nhạt Vàng nâu nhạt Vàng tím nhạt Vàng nhạt Cam nâu đậm Vàng Nâu nhạt Vàng xám nhạt Vàng Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng chanh Nâu Vàng nâu nhạt 69 Màu pellet Cam đậm Trắng ngà Hồng nhạt Nâu cam Trắng ngà Nâu cam đậm Trắng Nâu đậm Vàng nâu nhạt Trắng Nâu đồng Cam nâu Nâu nhạt Vàng sáng Đen xám Vàng chanh đậm Vàng xám Cam đậm Trắng vàng Cam đậm Trắng Màu môi trường Trắng Trắng Cam nâu Trắng Nâu Trắng Cam nâu Nâu đỏ đậm Vàng Xám đen nhạt Vàng chanh đậm Xám nhạt Vàng nhạt Vàng chanh nhạt Nâu nhạt - Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 140 (2020) 065-070 3.3 Khả phân giải nguồn cellulose tự nhiên chủng G1, G3, D4 tạo vòng phân giải CMC cao; đặc biệt chủng G3 D4 phân hủy nguồn cellulose tự nhiên rơm bã mía tốt mở tiềm ứng dụng vào nông nghiệp Các chủng G1, G3 D4 với đường kính vòng phân giải CMC cao tiến hành kiểm tra khả sử dụng nguồn cellulose tự nhiên rơm bã mía Tài liệu tham khảo Bảng 4: Tỷ lệ khối lượng chất cellulose lại so với khối lượng ban đầu sau 4, 12 ngày xử lý (%) Bã mía Rơm 12 ngày 12 ngày G1 98,3 0,0 92,9 0,1 90,5 0,1 98,7 0,0 95,7 0,0 91,3 0,0 G3 32,5 0,3 26,8 0,4 10,5 0,3 30,3 0,1 22,5 0,3 13,0 0,2 D4 50,8 0,4 20,5 0,3 11,3 0,3 37,0 0,2 22,5 0,1 10,5 0,1 Kết cho thấy chủng tiêu thụ nguồn chất Tuy nhiên, khả xử lý không rõ nét chủng G1, sau 12 ngày, khối lượng rơm bã mía lại 91,3% 90,5%; G3, D4 thể khả tốt Sau 12 ngày, khối lượng rơm lại chủng G3 D4 13,0% 10,5% khối lượng ban đầu; khối lượng bã mía giảm 10,5% 11,3% Chủng G1 có vòng phân giải CMC lớn khả sử dụng nguồn cellulose tự nhiên giải thích việc phân giải cellulose cách hiệu cần có hoạt động kết hợp enzyme hệ cellulase endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase việc phân giải CMC đĩa thạch xác định định tính khả sinh enzyme endoglucanase Hơn nữa, cellulose, nguồn chất tự nhiên rơm bã mía cấu tạo từ nhiều thành phần khác mannan, xylan, lignin… ngồi việc xác định định lượng hoạt độ enzyme hệ cellulase, khả sinh tổng hợp xylanase hay ligninase cần kiểm tra để tuyển chọn chủng có khả phân giải nguồn chất từ phế thải nông nghiệp tốt Kết luận [1] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, 39-42, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, 2012 [2] Bian, Jing & Peng, Feng & Peng, Xiao-Peng & Pai, Peng & Xu, Feng & Sun, Run-Cang, Acetic acid enhanced purification of crude cellulose from sugarcane bagasse: Structural and morphological characterization BioResources 7(4) (2012),46264639 [3] Chaudhary, B.S., A R Shrivastava, S Shrivastava, Diversity and versatility of actinomycetes and its role in antibiotic production Journal of Applied Pharmaceutical Science, 3(8) (2013), 83-94 [4] Hongyan Zhao, Hairu Yu, Degradation of Lignocelluloses in Rice Straw by BMC-9, a Composite Microbial System, J Microbiol Biotechnol., 24(5) (2014), 585–591 [5] Jeffrey, L S H, Isolation, characterization and identification of actinomycetes from agriculture soils at Semongok, Sarawak African Journal of Biotechnology, 7(20) (2008), 3700-3705 [6] Malherbe, S.C., Thomas, Lignocellulose biodegradation: Fundamentals and applications Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, (2002), 105-114 [7] Mandels, M Microbiological source of cellulase Biotechnology and Bioengineering symposium (1975), 81-105 [8] McCarthy, A.J., Lignocellulose-degrading Actinomycetes FEMS Microbiology Letters, 46(2) (1987), 145-163 [9] Ravi Ranjan Kumar, V.J.J., Isolation of Actinomycetes: A Complete Approach International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 5(5) (2016), 606-618 [10] Swati Deep, Pratibha Sharma, Niranjan Behera, Optimization of extracellular cellulase enzyme production from Alternaria brassicicola, International Journal of Current Microbiology and Applied Science 3(9) (2014), 127-139 Nhóm nghiên cứu phân lập 21 chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose Căn theo khóa phân loại Bergey dựa vào hình dạng chuỗi bào tử, chủng D4, DE2, G9, G11, G14, K1, K4 sơ nhận định thuộc chi Streptomyces 70 ... để quan sát khả phân giải CMC Nếu thuốc thử lugol không bắt màu quanh thỏi thạch tức xạ khuẩn có khả phân giải CMC [10] 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn Các mẫu thu... nhung, ngồi số có kết cấu vơi, bột trơn Chỉ có số chủng phân lập sinh sắc tố hòa tan làm thay đổi màu mơi trường màu sắc tố hòa tan khác chủng (Bảng 1) Các chủng xạ khuẩn thể khả phân giải CMC cao... (2020) 065-070 Hình 2: Khả phân giải CMC chủng phân lập Tiến hành kiểm tra khả phân giải CMC chủng phân lập phương pháp thỏi thạch sử dụng thuốc thử lugol thấy xuất vòng thủy phân chất xung quanh