Phân lập, tuyển chọn một số chủng bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu hại rau tại thái nguyên

Phương pháp xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập được .... Xác định hoạt tính diệt sâu của các chủng vi khuẩn có tinh thể độc ...

- -

HOÀNG VĂN CHUYỀN

Tên đề tài:

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS HURINGIENSIS

CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU HẠI RAU TẠI THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2011 – 2015

Thái Nguyên, 2015

HOÀNG VĂN CHUYỀN

Tên đề tài:

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS HURINGIENSIS

CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU HẠI RAU TẠI THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2011 – 2015 Giảng viên hướng dẫn: 1 GS Nguyễn Quang Tuyên

2 Th.S Lương Thị Thu Hường

Khoa CNSH - CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng tất cả quý thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có được kiến thức như ngày hôm nay

Và tôi xin đặc biệt cảm ơn GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Tuy thời gian làm đề tài có hạn nhưng nhờ thầy đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, để tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Lương Thị Thu Hường đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận

Tuy nhiên, do thời gian thực tập có hạn, trình độ kinh nghiệm còn chưa nhiều nên tôi không tránh khỏi thiếu sót và hạn chế Kính mong nhận được sự đóng góp của thầy cô và các bạn để bài khóa luận được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2015

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Phân loại gene cry của Bt 6

Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.2: Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh học

của các chủng vi khuẩn phân lập được 28

Bảng 4.2: Kết quả thử khả năng di động của các chủng sau 24h 34

Bảng 4.3: Kết quả thử phản ứng catalaza 35

Bảng 4.4: Kết quả thử phản ứng Voges – Proskauer (V – P) 36

Bảng 4.5: Số lượng bào tử/ml dung dịch lên men sau 24h 37

Bảng 4.6: Hoạt lực diệt sâu của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10

Hình 2.2: Vòng đời sâu tơ 14

Hình 2.3: Rau bắp cải bị sâu hại 14

Hình 4.1: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C2 32

Hình 4.2: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C6 32

Hình 4.3: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C9 32

Hình 4.4 Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C12 32

Hình 4.5: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C13 33

Hình 4.6: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C16 33

Hình 4.7: Khả năng di động của các chủng 34

Hình 4.8: Phản ứng catalaza của các chủng (a) Chủng C2, (b) Chủng C6, (c) Chủng C9, (d) Chủng C12, (e) Chủng C13, (f) Chủng C16 35

Hình 4.9: Khả năng lên men glucose của các chủng 36

Hình 4.10: Hoạt lực diệt sâu của 2 chủng C6 và C16 39

Hình 4.11: Biểu đồ thể hiện tốc độ diệt sâu của các chủng theo thời gian 39

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

Phần I MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 1

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa trong khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Đại cương về Bacillus thuringiensis 3

1.1.1 Đặc điểm sinh lý của Bt 3

1.1.2 Đặc điểm sinh hoá của Bt 4

1.1.3 Đặc điểm phân loại của Bt 4

1.1.4 Phân loại gene độc tố của Bt 5

1.1.5 Các loại độc tố của Bt 7

1.1.6 Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng 9

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc 10

1.2 Côn trùng thử nghiệm 12

1.3 Tinh hình nghiên cứu và ứng dụng B thuringiensis 15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng B thuringiensis trên thế giới 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng B thuringiensis ở Việt Nam 17

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 20

3.1.1 Đối tượng 20

3.1.2 Vật liệu hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 20

3.1.3 Phạm vi nghiên cứu 22

3.2 Địa diểm và thời gian nghiên cứu 22

3.2.1 Địa điểm 22

3.2.2 Thời gian 22

3.3 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 Các phương pháp tiến hành thí nghiệm 22

3.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt 22

3.4.2 Phương pháp xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập được 24

3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 27

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

4.1 Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis từ các mẫu 28

4.2 Kết quả xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

phân lập được 33

4.2.1 Kết quả thử nghiệm khả năng di động 33

4.2.2 Kết quả thử phản ứng catalaza 35

4.2.3 Kết quả thử phản ứng Voges – Proskauer (V – P): 36

4.3 Xác định hoạt tính diệt sâu của các chủng vi khuẩn có tinh thể độc 37

4.4.1 Kết quả xác định số lượng bào tử trong 24h nuôi cấy 37

4.4.2 Kết quả đánh giá hoạt lực diệt sâu 38

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Phần I

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay tại các vùng trồng rau chuyên canh ở nước ta đã áp dụng nhiều

kỹ thuật tiến bộ mới, làm cho năng suất rau không ngừng được nâng lên Tuy nhiên càng thâm canh thì sâu bệnh hại rau xuất hiện ngày lại càng nhiều lên

Để đảm bảo năng suất người nông dân đã sử dụng nhiều biện pháp như: lạm dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học, phân bón hoá học thiếu chọn lọc và không đúng phương pháp, điều đó đã khiến môi trường xung quanh bị ô nhiễm và rau xanh có lượng độc tố vượt quá ngưỡng cho phép

Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng sử dụng thuốc vi sinh vật giữ được quần thể sâu hại phát triển ở mức thấp nhất và không thể phát triển được thành dịch, bảo vệ được các loại côn trùng và các vi sinh vật có ích khác, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng rau, bảo vệ môi trường sống và sức khoẻ cộng đồng Các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học được nghiên cứu từ vi

khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được ứng dụng ngày càng phổ biến Việc

tìm ra các chủng Bt mới thực sự có giá trị, ý nghĩa và tiềm năng ứng dụng to lớn là cơ sở để bảo tồn nguồn gen quý và tạo ra các chế phẩm sinh học phục

vụ trong nông nghiệp Xuất phát từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực

tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài "Phân lập, tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu hại rau tại Thái Nguyên"

1.2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn được một số chủng Bacillus thuringiensis có khả năng tiêu diệt sâu tơ (Plutellidae xylostella) tại Thái Nguyên

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn được 1 - 2 chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt sâu

cao nhất từ các chủng vi khuẩn sinh tinh thể độc phân lập được

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa trong khoa học

- Đánh giá mức độ đa dạng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis được

phân lập từ các mẫu đất khác nhau tại địa bàn tỉnh Thái Nguyên

- Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt sâu tơ

(Plutella xylostella) cao

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về Bacillus thuringiensis

1.1.1 Đặc điểm sinh lý của Bt

Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh

vật gây bệnh cho côn trùng Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que, kích thước 3 - 6µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi Bt hô hấp

hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào (Nester E.W và cs, 2002) [15], (Theiry và cs, 1997) [16]

Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8 - 10µm Một số chủng Bt xuất hiện

chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt

màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt (Theiry và cs, 1997) [16]

1.1.2 Đặc điểm sinh hoá của Bt

Bt không lên men sinh axid trong môi trường chứa arrabinorase, xylose,

manitol, nhưng tạo axit ở môi trường chứa glucose Có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrate thành nitrite, phát triển được ở môi trường chứa 0,001%

lysozyme, 7% NaCl với pH 5,7 có phản ứng với lòng đỏ trứng gà Bt không

có khả năng khử amine ủa phenilalanin, không sử dụng axid citric, không khử muối sulfate (www.phenyl alanine tailieu.vn)

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45 oC Nhiệt độ tối ưu là 28 - 32oC (Ngô Đình Bính và cs, 2000) [3]

Bt không mẫn cảm với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH=7

Bt có khả năng oxy hóa hydrocarbon đến axid hữu cơ và dioxide carbon theo

chu trình Embden-Meyerhoff-Panas (Ngô Đình Bính và cs, 2002) [2], (Ngô Đình Bính và cs, 2005) [4]

1.1.3 Đặc điểm phân loại của Bt

Có rất nhiều phương pháp phân loại B thuringiensis khác nhau: Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus,

1958) Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên -H Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể Phân loại theo loại hình enzym lipase

Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn chế

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại

mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 type huyết thanh chính

có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp Phương pháp phân loại theo type huyết thanh - H được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao Phương

pháp phân loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng Số lượng các type huyết thanh và các chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập được Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69

typee huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của B

thuringiensis

Bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế B

thuringiensis đặt tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các

phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 và có 69 type huyết thanh H

1.1.4 Phân loại gene độc tố của Bt

Kích thước hệ gene của B thuringiensis vào khoảng 2,4 - 5,7 triệu bp

Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa

có hình dạng nhất định và được gọi là vùng nhân Khi nhuộm màu tế bào bằng Feulgen có thể thấy nhân hiện màu tím Trong vùng nhân có 1 NST duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi DNA xoắn kép Thể nhân chứa đựng thông tin di

truyền của Bt Hầu hết các chủng B thuringiensis phân lập mang các nhân tố

di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu

trúc gene tự nhiên cho một số chủng B thuringiensis

Năm 1982, Held và cộng sự đã sử dụng chữ viết tắt "cry" (bắt nguồn từ chữ crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu Các chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố chính là Cry, Cyt, Vip do các gene

cry, cyt, vip mã hóa

Những nghiên cứu của Carlton và Gonzalez trên 21 loài phụ Bt đã cho thấy số

lượng plasmid dao động từ 2 - 12 trong các chủng nghiên cứu (Đặng trọng lượng và cs, 1999) [9], [14]

Theo công bố mới nhất trên website:

http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/NeilCrickmore/Bt/toxins2.html: đã phát hiện tới hơn 759 gene thuộc 73 họ gene cry của Bt

Sau đây là các họ gene mã hóa cho protein tinh thể độc diệt một số bộ côn trùng gây hại phổ biến ở Việt Nam:

Bảng 2.1: Phân loại gene cry của Bt

cry1A- cry1L Lưỡng tháp 130 – 138 Cánh vảy

cry2A- cry2C Cầu 69 – 71 Cánh vảy, hai

cánh

cry3A- cry3C Lập phương 73 – 74 Cánh cứng

cry4A- cry4D Cầu 73 – 74 Hai cánh

cry5 Lưỡng tháp 81 Tuyến trùng

Gene vip

Gene vip mã hóa cho các độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) Độc tố Vip được Estruch và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm 1996, bao gồm Vip3A và Vip3B

Độc tố Vip đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học do khả năng diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chưa phát hiện được côn trùng kháng độc tố này Các nhà khoa học đã phát hiện được

85 gene vip thuộc 4 nhóm khác nhau, trong đó đáng chú ý là gene vip3A mã hóa protein 88 kDa có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon, Spodoptera fugipera, Spodoptera exigua Khi côn trùng ăn phải độc tố, Vip3A

là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa (Ngô Đình Bính, 2005)[4]

1.1.5 Các loại độc tố của Bt

Bacillus thuringiensis có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố:

Ngoại độc tố α(α - exotoxin), ngoại độc tố β(β - exotoxin), ngoại độc tố γ(γ -

exotoxin), nội độc tố δ(δ - endotoxin) Trong đó nội độc tố δ có tác dụng diệt

côn trùng mạnh nhất (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [6]

Ngoại độc tố α

Có khối lượng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong nước, tích tụ trong pha logarit của một vài loài phụ và được giải phóng ra môi

trường khi tế bào tan rã Ngoại độc tố α có bản chất là một enzyme gọi là

phospholipase hoặc leucithinase, có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá đặc

biệt là ong Tenthre dineda Tác dụng độc của ngoại độc tố α có liên quan tới

sự phân huỷ phospholipid ở mô của côn trùng (nghiên cứu này được phát hiện bởi Toumanoff - năm 1953)

Ngoại độc tố α có tác dụng tiêu diệt Galleria mellonella Ngoài ra còn có hiệu lực với các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng

Ngoại độc tố β

Độc tố này được Halt và Arkawwa (1959) tìm ra khi nuôi ấu trùng ruồi

nhà bằng thức ăn có chứa B thuringiensis Độc tố β có khối lượng phân tử cao 707 - 850 kDa, bền nhiệt, tan trong nước Ngoại độc tố β có tác dụng kìm

hãm nuclease và RNA-polymease dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA Ngoại

độc tố β có phổ hoạt tính rộng, kháng côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng

thuộc bộ cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh (Ngô Đình Bính, 2005) [4], (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [6]

Ngoại độc tố β rất có hiệu quả trong việc chống sâu non của côn trùng mẫn

cảm, gây trì trệ trong việc chuyển hóa lột xác và có tác động đối với sâu trưởng thành phát triển từ các ấu trùng đã ăn phải độc tố dưới ngưỡng gây chết

Qua nghiên cứu Federici và Wu cho thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử dụng ngoại độc tố β thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu

bổ sung thêm nội độc tố δ thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%

Ngoại độc tố γ

Có khối lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không khí, có khả năng tan trong nước Độc tố này thuộc nhóm phospholipase, có tác dụng lên phospholipid và giải phóng ra acid béo, rất mẫn cảm với nhiệt

Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: carbohydrate, tuy nhiên cũng có thể carbohydrate chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong

quá trình hình thành bào tử Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố δ chứa chủ

yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn Nguyên tố P hầu như không có (Ngô Đình Bính và

cs, 2010) [6]

Nội độc tố δ: có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ

tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt Khi đun ở 65o

C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 100oC trong

30 - 40 phút thì tinh thể bị mất tính độc Mặc dù tinh thể độc có thể tan ở pH kiềm, nhưng không phải pH kiềm nào cũng thích hợp Qua nghiên cứu các nhà khoa học nhận thấy rằng, pH quá cao hay quá thấp cũng đều ảnh hưởng tới độc tính của tinh thể Tuy nhiên lúc mới tách ra khỏi bào tử, nó có thể hòa tan trong pH rất kiềm Sự tổng hợp tinh thể độc và bào tử xảy ra gần như đồng thời trong khoảng 3 giờ sau pha cân bằng (Ngô Đình Bính và cs, 2005) [4]

1.1.6 Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng

Cơ chế hoạt động của protein tinh thể của B thuringiensis liên quan tới

sự hòa tan tinh thể trong ruột giữa của côn trùng Khi sâu ăn phải protein tinh thể của Bacillus thurigiensis, dưới tác động của men protease có tính kiềm (pH>10) trong ruột sâu, tinh thể độc tố bị hòa tan, và một nhân độc tố có khối lượng phân tử 60–65 kDa được hình thành và hoạt hóa Độc tố đã hoạt hóa bám vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành ruột sâu Sự gắn kết này ở ruột sâu làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành các lỗ rò (kênh ion) Do đó phá hủy cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế bào, làm cho tế bào phồng lên, bị phân hủy dẫn đến sâu chết (Nester E.W và

cs, 2002) [15]

Hình 2.1: Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử và tinh thể độc, đóng một vai trò vô cùng quan trọng và có tác động mạnh tới hiệu quả

của quá trình lên men sản xuất chế phẩm Bt Nhiều nhà nghiên cứu đã nhận thấy rằng các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng phát triển của Bt đều

ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp độc tố (Ngô Đình Bính, 2005)[4]

Nhiệt độ: Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ

20 - 40 oC Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng Bt là 28 - 32oC Nếu nhiệt độ dưới 20 oC và trên 32 oC đều có ảnh hưởng lên quá trình hình thành bào tử Nếu nuôi cấy ở 20 oC thì chu kì phát triển cần 64 giờ, trong khi đó nuôi cấy ở 35 oC thì thời gian cần cho chu kì phát triển giảm xuống còn 27 giờ

và số bào tử tăng lên Khi nuôi cấy Bt trên môi trường thạch ở nhiệt độ trên 40

o

C thì Bt vẫn có khả năng phát triển nhưng bào tử lại không được hình thành

Thêm vào đó nhiệt độ cũng có ảnh hưởng lớn tới quá trình hình thành tinh thể độc, ở nhiệt độ dưới 14 o

C sau 360 giờ nuôi cấy không quá 10% tinh thể được hình thành, nhưng ở nhiệt độ 160C sau 168 giờ nuôi cấy lượng tinh thể tăng lên đạt tới 15%

pH: pH là một trong số các yếu tố có ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng

Bt, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, ảnh hưởng đến điện tích màng tế bào

và sự hấp thu chất dinh dưỡng, ảnh hưởng tới khả năng cho nhận chất dinh dưỡng trong môi trường và tính độc của các vật chất có hại Do đó pH quá

cao hoặc quá thấp đều có hại tới Bt Với pH dao động trong khoảng 5,8 - 8,5

không gây ảnh hưởng tới sự hình thành tinh thể độc Tuy nhiên sự thay đổi

lớn yếu tố pH lại làm thay đổi số lượng bào tử Thường thì Bt phát triển tối ưu

ở pH=7 (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2000) [8]

Oxy: Bt là vi khuẩn hô hấp hiếu khí cho nên oxy là yếu tố không thể

thiếu trong quá trình sinh trưởng Bt Tùy từng giai đoạn sinh trưởng mà hàm

lượng oxy cần cung cấp khác nhau Ở các giai đoạn đầu của quá trình sinh

trưởng, Bt cần nhiều không khí, do vậy không khí được cấp càng nhiều thì

lượng sinh khối càng tăng và số lượng bào tử sẽ tăng Tuy nhiên, ở các giai đoạn sau (giai đoạn logarit cho đến trở về sau) nếu cứ tiếp tục tăng hàm lượng không khí thì nó sẽ tác động lên quá trình sống của tế bào làm tế bào sớm tự phân giải, dẫn tới số lượng tinh thể độc giảm

Các nguồn dinh dƣỡng: Bulla và Arcas và cộng sự đã nghiên cứu và

nhận thấy rằng các hợp chất amonium vô cơ như (NH4)2SO4 không có hiệu

quả trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng của Bt Trong khi đó các nguồn

nitơ hữu cơ như cao thịt, bột cá, bột đâụ tương, là yếu tố thúc đẩy quá trình

sinh trưởng Các chủng Bt khác nhau cần các amino acid khác nhau Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nguồn nitơ có ảnh hưởng rất lớn tới sinh khối Bt

và các protein tinh thể độc Ngoài ra các ion khoáng như Ca, Mg, K, cũng

được coi là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng Bt

Amino acid: một số amino acid như leucine, isoleucine có tác dụng ức

chế sự sinh trưởng của Bt cũng như sự hình thành tinh thể độc, nhưng khi cho

thêm axit amin valine vào thì sự ức chế bị mất đi Ngoài ra, nếu bổ sung riêng

rẽ threonine hoặc serine vào trong môi trường nuôi cấy Bt thì gây ức chế sự

hình thành tinh thể độc nhưng nếu đưa cả hai loại đó vào trong môi trường thì

sự ức chế bị mất Tác dụng ức chế của amino acid serine cũng bị mất đi nếu như có mặt axit amin methionine Acid α – picoline và acid flucoacetate cũng

ức chế việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể độc Chất kháng sinh erythromycine ở nồng độ thấp không đủ để ức chế việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể độc (Ngô Đình Bính, 2005)[4]

1.2 Côn trùng thử nghiệm

Sâu tơ

Sâu tơ (Plutella xylostella) thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài

rau (Plutellidae) hay còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhẩy dù

Sâu tơ phá hoại hầu hết các loại lá: xu hào, cải bắp, đậu tương Chúng được đánh giá là một loại sâu hại nghiêm trọng và có tính kháng thuốc trong nhiều nghiên cứu Sâu tơ phân bố rộng rãi, tính đến năm 1982 có tới

128 nước và vùng lãnh thổ đã công bố thấy xuất hiện loài sâu này Sâu tơ sinh sản cao, vòng đời ngắn, tính kháng thuốc nhanh Thiệt hại hàng năm

do sâu tơ gây ra khoảng 30 - 50% năng suất, chi phí phòng trừ chiếm 20 - 40% tổng chi phí đầu tư nhất là trên bắp cải (Hoàng Thị Lợi, 2003) [10]

Đặc tính sinh học và hình thái của sâu tơ

Tùy theo nhiệt độ mà sâu tơ có chu kỳ sinh trưởng khác nhau, ở nhiệt

độ 20 – 30o

C thì vòng đời của chúng là 20 - 30 ngày, ở nhiệt độ 15–20oC thì vòng đời là 40 ngày Đây là loài biến thái qua 4 pha: Trứng – sâu non –

nhộng – trưởng thành

Thời trứng 2 - 3 ngày, hình bầu dục, màu vàng nhạt dài 4 - 5mm, đường kính 0,3 - 0,5mm.Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân chính và nở trong vòng 3 – 4 ngày.Thời kỳ sâu non 8 - 10 ngày, hình ống, màu xanh nhạt, dài 8 - 10mm, đầu có màu nâu nhạt, trên các đốt có lông tơ Sâu non phát triển qua 4 tuổi.Tuổi 1: Thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2 - 1,5 mm Tuổi 1 phát triển từ 2 - 4 ngày.Tuổi 2: Mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục Sâu dài từ 1,5 - 3,5 mm Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1 - 3 ngày.Tuổi 3: Mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5 - 5,5 mm và phát triển từ 1 -

3 ngày.Tuổi 4: Sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5 - 9

mm, phát triển từ 1 - 4 ngày Giai đoạn này sâu có màu xanh nhạt, hình ống với nhiều đốt, mỗi đốt đều có nhiều lông nhỏ Đầu màu nâu vàng có các phiến cứng, trên đó có các chấm mầu nâu nhạt Trên mảnh cứng của lưng ngực có những chấm xếp thành hình chữ U

Thời kỳ nhộng 3 4 ngày, nhộng có màu xanh hoặc vàng nhạt, dài 6 7mm được bao bọc trong kén mỏng màu trắng xốp nằm dưới mặt lá

-Thời kỳ trưởng thành 5 - 7 ngày, sâu trưởng thành (bướm) thân dài

6 - 10mm, sải cánh trung bình 15mm, cánh màu nâu xám, mép cánh trước có

ba dấu hình tam giác màu nâu nhạt ngả trắng và có lông nhỏ dài mịn, khi đậu cánh sát thân Bướm ít bay mà thường di chuyển theo gió, hoạt động nhiều từ chập tối đến nửa đêm, mỗi con cái đẻ từ 50 - 400 trứng Trứng được đẻ riêng rẽ trên bề mặt của lá Sâu non có 4 tuổi, sâu mới nở đục lá tạo thành rãnh, tuổi lớn ở mặt dưới của lá

Hình 2.2: Vòng đời sâu tơ

Đặc điểm gây hại

Sâu tơ thường gây hại cho các loại cây trồng thuộc họ cải Sâu non ăn

lá, khi mật độ cao nó sẽ ăn thủng lá làm cho lá xơ xác, lá bị tổn thương mất khả năng quang hợp và giữ nước, cây phát triển kém và chết Sâu tơ phá hoại toàn bộ lá của cây, đặc biệt quan trọng khi sâu tấn công ở giai đoạn mới trồng, sâu non nở đục tạo thành rãnh, ở tuổi sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì phiến lá sẽ bị thủng lỗ chỗ Sâu tơ gây hại quanh năm và gây hại nhiều nhất là vào vụ Đông xuân

Hình 2.3: Rau bắp cải bị sâu hại

Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâu tơ là loại sâu hại nghiêm trọng có khả năng kháng thuốc cao Trong cơ thể sâu tơ có loại men có thể phân giải thuốc thành chất không độc, đó là hệ men vi thể (microsonal enzyme system) Khi cơ thể sâu tiếp xúc với hóa chất độc, hệ men vi thể được kích thích hoạt động tăng 100 - 200 lần (Hoàng thị Lợi, 2003) [10]

1.3 Tinh hình nghiên cứu và ứng dụng B thuringiensis

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng B thuringiensis trên thế giới

B thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học

Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn

thuộc chi Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto (Ngô Đình Bính, 2005) [4]

Năm 1911, Berliner (Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây bệnh

từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã đặt

tên là Bacillus thuringiensis năm 1915

Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục

thân ở Châu Âu

Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa

mì tại Pháp

Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất là protein

Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với

khối lượng lớn từ chủng B thuringiensis subsp kurstaki Năm 1956, Angus

đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [4] Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới

cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh

Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra

chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao

Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dưới loài Bt var

israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh Phát hiện này đã

chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy (Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera).

Năm 1981, Schnepf và Whiteley lần đầu tiên đã phân lập và tách dòng

gene độc tố mã hóa diệt sâu của chủng Bt subsp kurstaki HD-1 gọi là gene

cry1 và cho biểu hiện gene này ở E coli Từ đó một số lượng lớn các gene đã

được tách dòng và nghiên cứu đặc tính (Schnepf E và cs, 1998) [17]

Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại được nâng lên khi Krieg và cộng sự phát hiện ra dưới loài Bt subsp tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera) Chủng này được phân lập từ bọ cánh cứng Tenebrio molitar Sau đó, công ty Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự Bt subsp morrisoni đặt tên là Bt subsp Sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gene độc tố của chúng

Năm 1985, gene cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến năm

1995 các cây chuyển gene đầu tiên đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng

Từ năm 1987 - 1992, người ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ

Hymenoptera Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu về các

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và được sử dụng để sản xuất có tính thương mại cao (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [5], (Ngô Đình Bính và cs, 2003) [7]

Năm 1995, cây chuyển gene thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản

xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp –

cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gen (Đặng Trọng Lương

và cs, 1999) [9]

Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có

khả năng diệt tế bào ung thư (Lê Thị Minh Thành và cs, 2005) [11]

Năm 2005, Ohba và N.Đ Bính đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt

phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung ở người (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [5], (Ngô Đình Bính và cs, 2003) [6]

Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu và được sử dụng

để sản xuất có tính thương mại cao

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng B thuringiensis ở Việt Nam

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam

được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác giả như Nguyễn Công Bình , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người

đầu tiên mở đường nghiên cứu về B thuringiensis tại Việt Nam (Ngô Đình

Bính và cs, 2010) [5]

Thời kỳ mở đầu nghiên cứu

Các công bố khoa học về nghiên cứu B thuringiensis ở thời kỳ này còn rất ít Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B

thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí

nghiệm sử dụng các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus

thuringiensis var thuringiensis, B thuringiensis var kurstaki Các chế phẩm

B thuringiensis này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã

thu được các kết quả tốt Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm

B thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm B thuringiensis sản xuất ra có

chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ

Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984 - 1994)

Ở thời kỳ này, các chế phẩm B thuringiensis sản xuất theo phương pháp

dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có giá thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng Sau đó, một số đơn vị thuộc