Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập và ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytohormone. Nhóm đã phân lập được sáu chủng vi khuẩn (được ký hiệu từ M1 đến M6) thuộc chi Bacillus có khả năng ứng dụng trong nông nghiệp sạch, các thử nghiệm in vitro cho thấy các chủng trên đều có khả năng sinh IAA và phân giải lân, đặc biệt là chủng M2 có khả năng sinh IAA mạnh đạt nồng độ 111 µg/ml trên môi trường NB. Mời các bạn cùng tham khảo!
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH PHYTOHORMONE ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP SẠCH Phạm Thị Diễm Trinh, Hồng Cơng Minh*, Nguyễn Tấn Khoa Viện khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD: TS.Nguyễn Hồi Hương TĨM TẮT PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria) vi khuẩn phân bố tự đất, bề mặt rễ cộng sinh bên rễ, có khả thúc đẩy tăng trưởng thực vật ức chế bệnh thực vật Mục tiêu nghiên cứu phân lập ứng dụng chủng vi khuẩn có khả sinh phytohormone Nhóm phân lập sáu chủng vi khuẩn (được ký hiệu từ M1 đến M6) thuộc chi Bacillus có khả ứng dụng nông nghiệp sạch, thử nghiệm in vitro cho thấy chủng có khả sinh IAA phân giải lân, đặc biệt chủng M2 có khả sinh IAA mạnh đạt nồng độ 111 µg/ml mơi trường NB, chủng M4 với hàm lượng lân hịa tan mơi trường Pikovskaya đạt 21 mg/L sau ngày nuôi cấy, bên cạnh phần lớn chủng có khả cố định đạm, điều cho thấy tiềm chúng nâng cao suất trồng theo hướng hữu Từ khóa: Cố định đạm, IAA, PGPR, phân giải lân, phytohormone GIỚI THIỆU Hiện nông nghiệp Việt Nam đứng trước nhiều thách thức biến đổi khí hậu, khơ hạn, xâm nhập mặn, nơng sản thiếu đầu ổn định… Không việc lạm dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học chất sinh trưởng tổng hợp hóa học cịn phổ biến, gây nhiều hậu lâu dài ô nhiễm đất canh tác, nguồn nước, phá hủy hệ sinh thái, gián tiếp gây nên nhiều bệnh hiểm ngèo cho người Bên cạnh đó, việc sản xuất phân bón hố học góp phần làm cạn kiệt nguồn tài ngun khơng tái sinh dầu mỏ khí tự nhiên (được sử dụng để sản xuất phân bón) gây mối nguy hiểm cho người môi trường [1] Đứng trước thực trạng trên, kiến thức thuộc chuyên ngành công nghệ sinh học học được, nhóm nảy ý tưởng sử dụng vi sinh vật có khả sinh phytohormone, cố định đạm phân giải lân nhằm cải thiện suất trồng, nâng cao độ phì nhiêu đất, PGPR bật gồm thành viên chi Arthrobacter, Azoarcus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Pseudomonas,…[1] Hơn nữa, ứng dụng PGPR làm giảm việc sử dụng phân hoá học tiết kiệm mặt kinh tế, đem lại lợi ích mơi trường giảm chi phí sản xuất [1, 2] 327 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn phân lập: Mẫu đất quanh rễ cỏ Lào (Eupatorium odoratum L) Lựa chọn khỏe mạnh có phần gốc lớn, rễ sâu, khơng bị bệnh Nhóm tiến hành thu mẫu vườn chè Bảo Lộc vào đầu tháng 10, tức cuối mùa mưa, lúc phát triển mạnh chuẩn bị hoa 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh IAA Mẫu đất pha loãng theo dãy thập phân, trang môi trường TWA, ủ 30 oC 24 Ria khuẩn lạc riêng rẽ môi trường TWA, lặp lại thu khuẩn lạc khiết Cấy khuẩn lạc khiết vào mơi trường TWB, lắc 150 vịng/phút ngày nhiệt độ phịng Sau thời gian ni cấy định tính khả sinh IAA thuốc thử Salkowski, lấy ml dịch nuôi cấy cho vào ml thuốc thử Salkowski, kết dương tính xuất màu đỏ, so sánh với đối chứng âm 1ml môi trường TWB không cấy khuẩn cho vào ml thuốc thử Salkowski Nhuộm gram chủng có khả sinh IAA tiến hành giữ giống cách cấy vào môi trường thạch nghiêng TWA 2.2.2 Khảo sát đặc điểm có lợi vi khuẩn u kiện in vitro Xác định khả cố định đạm xác định phương pháp nuôi cấy vi khuẩn môi trường Thompson-Skerman Agar [3] ngày nhiệt độ 30 oC, lựa chọn khuẩn lạc có khả mọc riêng lẻ mơi trường Xác định khả sinh phytohormone IAA cách nuôi cấy môi trường NB, lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng ngày, sau ta ly tâm dịch ni cấy 10000 vòng/phút 15 phút, Sau ngày, sản sinh IAA dịch nuôi cấy phát định lượng phương pháp so màu với thuốc thử Salkowski ước sóng 530 nm [4-5], hút lấy phần dịch sử dụng thuốc thử Salkowski đường chuẩn IAA để xác định nồng độ IAA (µg/ml) sinh mơi trường NB Xác định khả phân giải lân cách nuôi cấy môi trường Pikovskaya ngày, lắc tốc độ 150 rpm nhiệt độ phòng, sau thời gian nuôi cấy ta tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 3000 rpm 15 phút, ta hút lấy dịch xác định hàm lượng lân hịa tan mơi trường ni cấy (PO43-) (mg/L) phương pháp đo quang KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn khảo sát khả cố định đạm Từ mẫu đất quanh rễ cỏ Lào, chủng vi khuẩn phân lập Sáu chủng phát triển tốt môi trường TWA, hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào đặc điểm sinh hóa nhóm nghiên cứu khảo sát Các chủng phát triển tốt môi trường TWA chứa amino acid 328 tự bao gồm tryptophan, cho phép nghi ngờ chủng có khả chuyển hóa tryptophan, mà kết chuyển hóa phytohormone IAA (Bảng 1) Bảng 1: Hình thái chủng phân lập môi trường TWA kết khảo sát môi trường Thompson-Skerman Mọc mơi trường ThompsonSkerman Stt Ký hiệu chủng M1 Trịn, lồi, trắng đục, iên Gram (+), hình que ngắn + M2 Dẹt, lồi, nâu nhạt, iên không Gram (+), hình que ngắn - M3 Trịn, lồi, vàng đục, iên Gram (+), hình que + M4 Trịn, mọc tràn, trắng đục, biên khơng Gram (+), hình que ngắn - M5 Hình thoi, nâu nhạt, mọc tràn, biên Gram (+), hình que ngắn + M6 Tròn, nâu đậm, mọc tràn, iên Gram (+), hình que dài + Hình thái khuẩn lạc mơi trường TWA Hình thái tế bào +: Có mọc môi trường Thompson-Skerman - : Không mọc môi trường Thompson-Skerman Qua bảng ta thấy trong số chủng vi khuẩn chủng M1, M3, M5, M6 có khả mọc mơi trường Thompson-Skerman môi trường không chứa N, dùng để phân lập vi khuẩn cố định đạm Điều chứng tỏ bốn chủng M1, M3, M5 M6 có khả cố định đạm, thể tiềm việc nâng cao hàm lượng đạm, góp phần nâng cao suốt trồng giảm thiểu việc sử dụng phân bón hóa học 3.2 Tuyển chọn chủng phân lập dựa khả sinh IAA Để khẳng định tuyển chọn khả sinh IAA chủng phân lập, nuôi cấy chúng môi trường NB ngày đo lượng IAA sinh thuốc thử Salkowski Hình 1: Hàm lượng IAA tạo thành vi khuẩn mơi trường NB (µg/ml) sau ngày ni cấy 329 Từ Hình ta thấy có nhiều chủng vi khuẩn có khả tổng hợp lên lượng IAA đáng kể môi trường NB sau ngày nuôi cấy, đặc biệt chủng M2 có hàm lượng IAA đạt 111 µg/ml Các chủng tổng hợp IAA mạnh M2, M3 với nồng độ IAA 111 µg/ml 110 µg/ml, chủng tổng hợp IAA trung bình M1, M4, M5, M6 với nồng độ IAA từ 33 đến 53 µg/ml Kết khả quan so với 10 chủng Pseudomonas khảo sát Kamble cộng (2015) có khả sản sinh IAA khoảng từ 21,5– 81,8 µg/ml [7] Điều cho thấy tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn nơng nghiệp với vai trị kích thích phát triển trồng 3.3 Tuyển chọn chủng phân lập dựa khả hòa tan lân vơ khó tan Hình 2: Hàm lượng lân hịa tan mơi trường Pikovskaya (mg/L) sau ngày ni cấy Từ Hình ta thấy có nhiều chủng vi khuẩn có khả phân giải lân đáng kể chủng khác, đặc biệt chủng M4 với hàm lượng lân hịa tan mơi trường Pikovskaya đạt 21 mg/L sau ngày nuôi cấy Các chủng có khả phân giải lân mạnh chủng M1, M2, M4 với hàm lượng lân hòa tan đạt 19 đến 21 mg/L, chủng cịn lại khơng có có khả phân giải lân khơng đáng kể với nồng độ lân hòa tan đạt 10 mg/L, kết thấp báo cáo Jayadi cộng (2013) với lượng phosphorus hòa tan cao lên đến 87,59 μg/ml [6], điều cho thấy tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn nơng nghiệp với vai trị phân giải lân khó tan thành lân dễ tan giúp dễ hấp thụ KẾT LUẬN Trong chủng vi khuẩn có khả sinh phytphormone phân lập mơi trường TWA, nhóm thực thử nghiệm in vitro thu kết khả quan khả sinh IAA, phân giải lân cố định đạm Trong bật chủng M2, M3 với nồng độ IAA 111 µg/ml 110 µg/ml sau ngày ni cấy mơi trường NB, M3 vừa sinh IAA vừa cố định đạm; chủng M1, M2, M4 với khả hịa tan lân vơ khó tan, với hàm lượng lân hịa tan mơi trường Pikovskaya đạt 19 đến 21 mg/L sau ngày ni cấy, M2 vừa hòa tan lân vừa sinh tổng hợp nhiều IAA Nghiên cứu hoàn thiện 330 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] G Gupta, S.S Parihar, N.K Ahirwar, S.K Snehi, V Singh, ‚Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Current and future prospects for development of sustainable agriculture‛, Journal of Micribial & Biochemical Technology, vol 07, no 02, pp 096–102, 2015 [2] M.Ahemad,M.Ki ret,‚Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria:Current perspective‛, Journal of KingSaud University - Science, vol 26, no 1, pp 1–20, 2014 [3] Y Bashan, G Holguin, R Lifshitz, ‚Isolation and characterization of plant growth-promoting rhizo acteria‛, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pp 331–345, 1993 [4] A Wahyud, R Astuti, ‚Screening of Pseudomonas sp isolated from rhizosphere of soybean plant as plant growth promoter and biocontrol agent‛, American Journal of Agricultural and Biological Science, vol 6, no 1, pp 134– 141, 2011 [5] B Sasirekha, S Shivakumar, S.B Sullia, ‚Statistical optimization for improved indole-3-acetic acid (IAA) production by Pseudomonas aeruginosa and demonstration of enhanced plant growth promotion‛, Journal of Soil Science and Plant Nutrition, vol 12, no 4, pp 863–873 (2012) [6] M Jayadi, ‚In vitro Selection of Rock Phosphate solubility by microorganism from ultisols in South Sulawesi,Indonesia‛, American Journal of Agriculture and Forest, vol 1, no 4, pp 68– 73, 2013 [7] K.D Kamble, D.K Galerao, ‚Indole acetic acid ‚16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study‛, Journal of Bacteriology, vol 173, no 2, pp 697– 703, 1991 331 ... cho thấy tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn nông nghiệp với vai trị phân giải lân khó tan thành lân dễ tan giúp dễ hấp thụ KẾT LUẬN Trong chủng vi khuẩn có khả sinh phytphormone phân lập mơi trường TWA,... 3.1 Phân lập vi khuẩn khảo sát khả cố định đạm Từ mẫu đất quanh rễ cỏ Lào, chủng vi khuẩn phân lập Sáu chủng phát triển tốt mơi trường TWA, hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào đặc điểm sinh. .. dùng để phân lập vi khuẩn cố định đạm Điều chứng tỏ bốn chủng M1, M3, M5 M6 có khả cố định đạm, thể tiềm vi? ??c nâng cao hàm lượng đạm, góp phần nâng cao suốt trồng giảm thiểu vi? ??c sử dụng phân bón