Khảo sát hóa học phân đoạn có tác dụng bảo vệ gan của cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume.

11 Bảng 1.6 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm, thử nghiệm ức chế sự phát triển của rễ cây củ cải Raphanus sativa và bẫy gốc tự do DPPH● của 6 hợp chất cô lập t cao metanol của cây vằng sẻ

PHAN HỒNG SƠN

KH O S T H A HỌC PH N ĐOẠN

C T C NG O V GAN C A C V NG S

JASMINUM SUBTRIPLINERVE BLUME

Chuyên ngành: HÓA LÝ THU ẾT VÀ H A LÍ

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hồ Thị Cẩm Hoài, Bộ môn Hóa

lý - Khoa Hóa học trường Đại học khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh TS Huỳnh Ngọc Thụy, Bộ môn Dược Liệu – Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM, những người thầy đã tận tình theo dõi, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này Tôi đã học tập được rất nhiều kinh nghiệm cũng như kiến thức khoa học

và phương pháp làm việc

Xin chân thành cảm ơn chân thành đến các Thầy, Cô bộ môn Hóa lý và Khoa Hóa trường Đại học khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến các Thầy, Cô trong Bộ môn Dược Liệu – Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này

Xin cảm ơn các bạn Ngân, Thiên Hương, Hoán, các em trong phòng Hóa lý hữu cơ, Hóa Phân tích đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Con xin gửi lời biết ơn đến Bố Mẹ, người đã sinh thành, dưỡng dục cho con

có được ngày hôm nay và mai sau Em xin cảm ơn các anh, chi của em đã động viên và giúp đỡ em

Cảm ơn em, người vợ yêu thương của anh, đã luôn ở bên và động viên anh hoàn thành tốt luận văn này

Xin cảm ơn Trường THPT Trần Đại Nghĩa đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và làm việc

Xin cảm ơn và gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả mọi người

Phan Hồng Sơn

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn MỤC LỤC ii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vẽ, sơ đồ vii

MỞ ĐẦU viii

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 CHI JASMINUM ( CHI NHÀI HAY LÀI) 2

1.2 CÂY VẰNG SẺ JASMINUM SUBTRIPLINERVE BLUME 2

1.2.1 Phân bố sinh thái của cây vằng sẻ 3

1.2.2 Mô tả thực vật 3

1.2.3 Phân biệt vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume với các cây cùng chi 4

1.2.4 Thành phần hoá học của cây vằng sẻ trong các nghiên cứu đã công bố 6

1.2.5 T ng quan hoạt tính sinh học của cây vằng sẻ 9

1.3 MÔ HÌNH GAN NHIỄM ĐỘC TRONG THỬ NGHIỆM IN VIVO 17

1.3.1 Cơ chế gây độc của CCl4 17

1.3.2 Mô hình in vitro và in vivo 18

1.4 CHẤT CHUẨN 19

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 22

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 22

2.2.1 Qui trình trích ly 24

2.2.2 Khảo sát hoạt tính sinh học của các cao và các phân đoạn 25

2.2.3 Qui trình tách chiết, cô lập các hợp chất 31

2.2.4 Khảo sát tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột nhiễm độc CCl4 (in vivo) 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN VITRO 43

3.1.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá của các phân đoạn 43

3.1.2 So sánh hoạt tính kháng oxi hoá giữa các cao và các phân đoạn 47

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ NHẬN DANH CÁC HỢP CHẤT 47

3.2.1 Hợp chất VS3.1 47

3.2.2 Hợp chất VS3.2 49

3.2.3 Hợp chất VS3.3 51

3.2.4 Hoạt tính kháng oxi hóa của các hợp chất cô lập được 56

3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN VIVO 57

3.3.1 Khảo sát nồng độ gây độc của CCl4 57

3.3.2 Kết quả khảo sát khả năng bảo vệ gan của cao chiết EA 58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 62

4.2 ĐỀ NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 71

PHỤ LỤC 72

1H-NMR: Ph cộng hưởng t hạt nhân proton

EA: Etyl axetat

Ed: Ete dầu hỏa

EDTA: Etylendiamintetraaxetic axit

EtOH: Etanol

GOT: Glutamat Oxaloaxetat Transaminase

GPT: Glutamat pyruvat transaminase

GSH: Glutathione (dạng khử)

HPLC: High-performance liquid chromatography

HMBC: Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy HSQC: Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy IC: Inhibitory concentration (Nồng độ ức chế)

LDH: Lactat dehydrogenase

MS: Mass spectroscopy

NAD: Nicotinamid adenin dinucleotid

NADPH: Nicotinamid adenin dinucleotid photphat

NO: Nitric oxit

OD: Optical Density

SRB: Sulforhodamine B

SKC: Sắc kí cột

TLG: Tỉ lệ giảm

Blume với một số cây khác cùng chi Jasminum 5 Bảng 1.2 Đặc điểm nhận diện giữa cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve

Blume và cây lá ngón Gelsemium elegans Benth 5

Bảng 1.3 Các hợp chất tinh khiết trong cao ete dầu và cloroform cây vằng sẻ

Jasminum subtriplinerve Blume 9

Bảng 1.4 So sánh kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của cây vằng sẻ

Jasminum subtriplinerve Blume 10 Bảng 1.5 Tác dụng kháng sinh của vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume

lên một số chủng vi khuẩn 11 Bảng 1.6 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm, thử nghiệm ức chế sự phát triển

của rễ cây củ cải Raphanus sativa và bẫy gốc tự do DPPH● của 6

hợp chất cô lập t cao metanol của cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume 13 Bảng 1.7 Phần trăm tế bào sống sót và IC 50 thu được t khảo sát độc tính tế

bào của các cao vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume trên 3

dòng tế bào ung thư Hep-G2, RD, LU 16 Bảng 1.8 Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của các cao vằng sẻ

Jasminum subtriplinerve Blume bằng phương pháp bẫy gốc tự do

Jasminum subtriplinerve Blume 43

Bảng 3.2 Phần trăm bẫy gốc tự do DPPH● của các phân đoạn cao etyl axetat 44

Bảng 3.4 Phần trăm ức chế gốc tự do NO của các phân đoạn cao etyl axetat 46

Bảng 3.5 Giá trị δH của VS3.1 và hợp chất axit 3,4-dihidroxibenzoic 49

Bảng 3.6 So sánh độ dịch chuyển trong ph 13C của hợp chất VS3.1 và hợp chất axit 3,4-dihidroxibenzoic 49

Bảng 3.7 Giá trị δC của axit gallic và hợp chất VS3.2 50

Bảng 3.8 Giá trị δH của axit gallic và hợp chất VS3.2 51

Bảng 3.9 Bảng so sánh ph 13C của hợp chất VS3.3 và verbascosid 53

Bảng 3.10 Bảng so sánh ph 1H-NMR của hợp chất VS3.3 và verbascosid 54

Bảng 3.11 Phần trăm bẫy gốc tự do DPPH● của các hợp chất cô lập được t cao EA 56

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát nồng độ gây độc của CCl4 đối với các lô chuột 58

Bảng 3.13 Tác dụng hạ men gan của cao etyl axetat và chất chuẩn silymarin 59

Cam Lộ, tỉnh Quảng Trị 4

Hình 1.2 Hoa cúc gai và một số dạng thương phẩm của Silymarin 20

Hình 2.1 Các dụng cụ nuôi chuột 22

Hình 2.2 Phản ứng trung hoà gốc DPPH 26

Hình 2.3 Các thao tác cho chuột uống thuốc 38

Hình 2.4 Các bước lấy máu chuột 39

Hình 3.1 Hợp chất VS3.1 48

Hình 3.2 Hợp chất VS3.2 50

Hình 3.3 Tương quan HMBC của hợp chất VS3.3 52

Hình 3.4 Hợp chất VS3.3 55

Hình 3.5 Cơ chế bẫy gốc tự do DPPH● của các polyphenol 56

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ***** Sơ đồ 2.1 Sơ đồ ly trích các cao vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume 25

Sơ đồ 2.2 Quy trình khảo sát khả năng bẫy gốc tự do DPPH• 27

Sơ đồ 2.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO● 30

Sơ đồ 2.4 Sơ đồ tách các phân đoạn t cao EA thô 32

Sơ đồ 2.5 Sơ đồ tách các phân đoạn t phân đoạn VS3 32

Sơ đồ 2.6 Sơ đồ cô lập các hợp chất t phân đoạn VS3.A 33

Sơ đồ 2.7 Sơ đồ cô lập các hợp chất t phân đoạn VS3.B 34

Sơ đồ 2.8 Sơ đồ cô lập các hợp chất t phân đoạn VS3.G 35

phục vụ cho cuộc sống hàng ngày mà còn mang lại những thực phẩm b dưỡng cho con người Trong đó không thể quên đi vai trò quan trọng của các loại thảo dược đã được người dân t xa xưa sử dụng và lưu giữ thành các bài thuốc gia truyền có khả năng chữa nhiều bệnh

Việt Nam có nguồn thảo dược rất phong phú, chủ yếu mọc hoang, chưa được quy hoạch để trồng với quy mô lớn Với nguồn dược liệu phong phú như vậy, việc nghiên cứu, tìm ra các chất chống oxi hoá có nguồn gốc thiên nhiên có ý nghĩa quan trọng: Thứ nhất, các chất chống oxi hoá có nguồn gốc t thiên nhiên có lợi cho sức khỏe mà ít gây tác dụng phụ; Thứ hai, có thể dễ dàng quy hoạch trồng với

số lượng lớn Do đó, việc sản xuất các chế phẩm thuốc chống oxi hoá có nguồn gốc thiên nhiên sẽ kinh tế hơn, an toàn hơn rất nhiều so với chất chống oxi hoá

t ng hợp

Trong nhiều bài thuốc c truyền Việt Nam có nhiều loại thảo dược có chứa flavonoid, antocyanosid, tannin, các polyphenol…được dùng làm thức ăn, nước uống b dưỡng, giải độc hằng ngày có thể có khả năng chống oxi hoá, chống lại gốc tự do T lâu, nhân dân ta đã biết được tác dụng của lá vằng và đã hái lá phơi khô sắc nước uống dùng cho phụ nữ sau khi sinh và người già Theo kinh nghiệm dân gian ở một số vùng, lá vằng tươi nấu nước gội đầu sẽ làm mịn tóc và chữa được nấm tóc Có một số vùng người ta sử dụng lá vằng làm nước uống hàng ngày nhằm kích thích tiêu hóa, ăn ngon miệng, ngủ ngon

Mặc dù tác dụng chữa bệnh và tăng cường sức khỏe của chè vằng đã được biết đến nhiều trong các bài thuốc c truyền dân gian nhưng thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nó hầu như chưa được quan tâm nghiên cứu Hiện nay mới chỉ có rất ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

một số phân đoạn cao trích t thân và lá vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume,

chưa có công trình nào nghiên cứu hoạt tính của nó trên cơ thể động vật Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài này với mục đích tìm hiểu sơ bộ thành phân hóa học

phân đoạn có tác dụng bảo vê gan của cây vằng sẻ - Jasminum subtriplinerve

Blume

subtriplinerve Blume cho thấy, hoạt tính kháng oxi hóa của phân đoạn etyl axetat

là cao nhất Nhận thấy phân đoạn etyl axetat có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của cây vằng sẻ, và với tham vọng khẳng định hoạt tính kháng oxi hóa của phân đoạn etyl axetat và tác dụng của nó trên cơ thể động

vật nên chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát hóa học phân đoạn có tác dụng bảo

vệ gan của cây vằng sẻ - Jasminum subtriplinerve Blume.” với các mục tiêu cụ

thể sau:

- Trích ly các cao chiết và các phân đoạn t cây vằng sẻ

- Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết và các phân đoạn thu được bằng các phương pháp bẫy gốc tự do DPPH● và ức chế gốc tự do NO●

- Cô lập, tách chiết và định danh các chất thu được t các phân đoạn của cao

etyl axetat

- Thử hoạt tính kháng oxi hóa của các chất thu được bằng phương pháp bẫy gốc

tự do DPPH●, so sánh hoạt tính với chất chuẩn quercetin

- Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết etyl axetat trên mô hình gan chuột nhắt trắng bị nhiễm độc CCl4 (in vivo), so sánh hoạt tính bảo vệ gan với chất chuẩn

silymarin

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN

1.1 CHI JASMINUM ( CHI NHÀI HAY LÀI)

Chi Jasminum có 200 loài, là một trong 20 chi thuộc họ Oleaceae, bộ Lamiales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta, giới Plantae

Cây thuộc chi này là các cây bụi, có khi leo, cao 0.5 - 3m, có nhiều cành mọc xoè ra Lá hình trái xoan bầu dục, bóng cả hai mặt, có lông ở dưới, ở kẽ những gân phụ Cụm hoa ở ngọn, thưa hoa Lá bắc hình sợi Hoa màu trắng, thơm ngát Quả hình cầu, màu đen bao bởi đài tồn tại, có 2 ngăn [13]

Cây có nguồn gốc ở Ấn Độ, được trồng làm cảnh khắp nơi Hoa thường dùng để ướp trà hoặc để làm thơm thức ăn Vào dịp thu đông, đào lấy rễ, rửa sạch, thái nhỏ, phơi hay sấy khô Lá thu hái quanh năm Hoa thu hái vào hè thu, khi mới nở, dùng tươi hay phơi khô

Thành phần hoá học: trong hoa có chất béo thơm, hàm lượng 0,08% Thành phần chủ yếu của chất béo này là parafin, este fomic-axetic-benzoic-linalyl, este anthranylic metyl và indol Các loại hợp chất được phân lập và xác định cấu tr c từ

các loài thuộc chi Jasminum chủ yếu là các hydrocacbon, chất thơm, flavonoid,

terpenoid, hợp chất chứa nitơ…và đặc bi t là hợp chất iridoid [52]

Hoa và lá có vị cay và ngọt, tính mát, có tác dụng trấn thống, thanh nhi t giải biểu, lợi thấp Rễ có vị cay ngọt, tính mát, hơi có độc, có tác dụng trấn thống, gây

tê, an thần

1.2 CÂY VẰNG SẺ JASMINUM SUBTRIPLINERVE BLUME [13]

Tên khoa học: Jasminum subtriplinerve Blume

Giới (regnum): Plantae

Ngành (division): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Họ (familia): Oleaceae

Chi (genius): Jasminum

Loài (species): Jasminum subtriplinerve

Tên Vi t nam thường gọi: vằng, vằng sẻ, chè cước man, dây cẩm văn, cây dâm trắng, dây vằng….Một số tên gọi khác râm ri, râm leo, lài ba gân, mỏ sẻ, mỏ quả…

Theo dân gian có 3 loại vằng: vằng lá nhỏ (vằng sẻ) dùng tốt hơn cả, vằng lá to (vằng trâu) cũng được dùng, còn vằng n i không dùng làm thuốc

1.2.1 Phân bố sinh thái của cây vằng sẻ [1],[13]

Vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume phân bố phổ biến và khá tập trung ở

khu vực các nước Đông Nam Á, Nam Á, các tỉnh phía nam Trung Quốc và đảo Hải Nam

Ở Vi t Nam, vằng sẻ mọc rải rác ở hầu hết các tỉnh thuộc vùng n i thấp, trung

du và cả đồng bằng, có nhiều từ Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Ph , Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Ngh An, qua Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam - Ðà Nẵng tới Khánh Hòa Không thấy cây mọc ở vùng n i cao trên 1500 m

Vằng sẻ là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, nhất là thời kì cây còn nhỏ, thường mọc lẫn trong các lùm bụi ở ven đồi, bờ nương rẫy và quanh làng bản Cây mọc nơi đất ẩm sinh trưởng mạnh hơn cây ở vùng đồi khô hạn Chỉ có những cây mọc trùm lên các bụi cây khác, được chiếu sáng đầy đủ mới thấy có nhiều hoa quả Trong tự nhiên thường gặp nhiều cây con mọc từ hạt xung quanh gốc cây mẹ Sau khi bị chặt phá nhiều lần, phần thân, cành còn lại của vằng sẻ đều có khả năng tái sinh nhiều chồi Do tính chất phân bố rộng rãi, điều ki n sống và phát triển dễ dàng nên vằng sẻ là một nguồn thảo dược đáng được quan tâm khai thác

1.2.2 Mô tả thực vật [1],[13]

Vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume có dạng cây nhỏ, mọc thành bụi Thân

cây cứng, chia thành từng đốt, vươn dài 15-20 m, đường kính thân không quá

6 mm, phân nhánh nhiều cành Vỏ thân và cành đều nhẵn màu xanh lục

Lá mọc đối hơi hình mác, phía cuống tù hay hơi tròn, mũi nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, mặt trên bóng, dài 4-7.5 cm, rộng 2- 4.5 cm, những lá phía trên nhỏ hơn lá phía dưới, có ba gân chính nổi rõ ở mặt trên, mép nguyên Lá vằng sẻ có

3 gân dọc, trong đó 2 gân bên uốn cong theo mép lá rõ r t Cuống lá nhẵn, dài từ

3 - 12 mm

Hoa vằng sẻ mọc thành xim nhiều hoa (chừng 7-9 hoa), cánh hoa màu trắng, đài hoa có ống ngắn, 8-10 thuỳ rất hẹp và nhọn, tràng có ống dài phình lên ở đầu, nhị đính ở họng tràng, bầu tù Hoa thường nở vào tháng 3 - tháng 4 Quả chín vào tháng

5 - tháng 6 hàng năm Quả vằng sẻ hình cầu cỡ hạt ngô đường kính 7-8 mm, khi chín màu đen, có một hạt rắn chắc Xem hình 1.1

(a): Thân cây (b): Bụi cây (c): Lá - mặt trước (d): Lá - mặt sau (e): Quả xanh – quả chín (f): Hoa

Bộ phận dùng: cành lá thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô

1.2.3 Phân biệt vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume với các loại cây khác

Bảng 1.1 So sánh đặc điểm thực vật giữa vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume với một

số cây khác cùng chi Jasminum [7],[14]

Thân

Cành con kéo dài,

nhẵn

Cành con rất mảnh, nhẵn

Cành con có lông vàng như bụi, hơi mảnh

Cành con kéo dài phủ lông ngắn và mềm

Cành con kéo dài, khoẻ, không có lông

Lá

Hình bầu dục mũi

mác, gần tù hay tròn ở gốc Hai mặt

gần như cùng màu

Hình mác tù, gốc hình nêm, mặt trên bóng

Hình tam giác, gân cụt ở gốc, mặt trên bóng

Hình trái xoan, gốc tròn hình tim, có lông ở cuống lá và 2 mặt lá

Hình trái xoan rộng, gốc hình nêm, láng bóng mặt trên

3-5 gân, ở gốc nổi rõ ở mặt dưới

5 gân ở gốc nổi rõ ở mặt dưới

5 gân ở gốc, gân bên nổi rõ

ở mặt dưới

Cụm hoa

Cánh hoa liền nhau, có từ 7-9 hoa

1-3 hoa ở nách

lá và ngọn cành

Hoa ở ngọn không cuống dày đặc

3 hoa trên đầu, cành con ngắn

Nhiều hoa ở ngọn

Ngoài ra vằng sẻ dễ nhầm lẫn với lá ngón Gelsemium elegans Benth (một loại

cây gây độc chết người) vì hình dạng bên ngoài, thân, cành tương đối giống nhau

Cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume có thể phân bi t với cây lá ngón nhờ

vào một số đặc điểm lá, hoa và quả [14] Xem bảng 1.2:

Bảng 1.2: Đặc điểm nhận di n giữa cây vằng sẻ và cây lá ngón [14]:

Có nhiều cặp gân Lá mọc đối, không lông, hình trứng hay hình trứng mũi mác, đầu nhọn, xanh nhẵn bóng, mép lá nguyên, dài 7-12 cm

Hoa Màu trắng với 10 cánh hoa Mọc thành chùm, phân nhánh nhiều lần (2 - 3 lần) màu

1.2.4 Thành phần hoá học của cây vằng sẻ trong các nghiên cứu đã công bố

Từ rất lâu, nhân dân nhiều địa phương đã biết dùng vằng sẻ để chữa nhiều b nh, làm thức uống hằng ngày Tuy nhiên, chỉ có rất ít tài li u nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như thành phần hoá học của cây vằng sẻ Năm 1984 nhóm Bác sỹ Nguyễn Thị Ninh Hải cùng các đồng nghi p Vi n Dược li u - Bộ Y tế công bố công trình nghiên cứu về thành phần hoá học ban đầu và thử tác dụng sinh học của các nhóm hoạt chất cây chè vằng Trong đó, dựa theo phương pháp chiết xuất hoá sinh thực vật của các tác giả Ấn Độ và Nhật Bản đã bước đầu xác định được thành phần hóa học của cây vằng sẻ gồm 4 nhóm hợp chất chính là: terpenoid, glycosid đắng, flavonoid, và phần nhựa chứa syringin [6-7]

Năm 2002, W.Kraus cùng cộng sự [32] là nhóm đầu tiên phân lập phân lập được

6 hợp chất terpen glycosid trong cây vằng sẻ Bằng phương pháp phân tích HPLC với nguyên li u vằng sẻ ở Thái Nguyên được phơi khô và ngâm chiết trong dung môi metanol, các tác giả đã khẳng định trong thành phần chiết suất có 6 hợp chất

terpen glycosid (1-6)

6’’’ – epi- Anatoliosid (1) Chevangin A (2)

Chevangin B (3) 6-epi-Chevangin B (4)

Chevangin B (3), 6-epi-Chevangin B (4) và Chevangin C (5) Chất còn lại có phân

tử lượng thấp nhất 492 đvC do mất đi một nhóm linalool là Chevangin D (6)

Trong năm 2007-2008 nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hương đã công

bố thêm 4 bài báo [8-11],[28] dựa trên kết quả phân lập và xác định cấu tr c của tám hợp chất trong phân đoạn etyl axetat của cây vằng sẻ, gồm ba flavonol glycosid

là Rutin (7), Astragalin (8) và Isoquercitrin (9) (Xem hình 1.3) và 5 hợp chất phenyletanoid glycosid là Verbascosid (10), Isoverbascosid (11), Apioverbascosid (12), Isooleoverbascosid (13) và 6’-O-Menthiafoloyl-verbascosid (14) Trong đó (14) là hợp chất mới lần đầu tiên được cô lập

Rutin (7) Astragalin (8) Isoquercitrin (9)

6’-O-Menthiafoloyl-verbascosid (14)

Cùng trong năm 2008, nhóm hóa lý hữu cơ, Khoa Hóa, trường ĐH KHTN Tp HCM cũng đã công bố các kết quả cô lập 8 hợp chất tinh khiết trong cao ete dầu và

cloroform của cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume Xem bảng 1.3

Bảng 1.3 Các hợp chất tinh khiết trong cao ete dầu và cloroform cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume [14]

1.2.5 T ng quan hoạt tinh sinh học của cây vằng sẻ

1.2.5.1 Công dụng

Ở một số vùng, lá vằng sẻ được sử dụng làm nước uống hằng ngày trong gia đình nhằm kích thích tiêu hóa, ăn ngon mi ng, ngủ ngon Vằng sẻ thường được dùng như loại thực phẩm bổ đắng uống ngon, với mùi thơm và vị đắng nhưng hậu ngọt đặc trưng phù hợp với sở thích đa số người dân nông thôn ở một số địa phương [1-2]

Một số nghiên cứu dược lý đã công bố chứng minh các nhóm chất trong lá vằng

sẻ như terpenoid, glycosid đắng, flavonoid, nhựa và ancaloid có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm, điều trị đau khớp xương, làm tăng nhanh tái tạo tổ chức, làm mau lành vết thương, thông huyết, trị thiếu máu, điều kinh, nhuận gan chữa b nh

vàng da hay m t mỏi, kém ăn [1],[13],[15]

1.2.5.2 Tác dụng kháng viêm

Theo một báo cáo nghiên cứu của b nh vi n Thái Bình, cây vằng sẻ với một liều lượng nhất định có tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn một số kháng sinh đối với tụ cầu khuẩn và cầu tan huyết [13] Đặc bi t, Trường Đại học Dược Hà Nội cũng có đề tài nghiên cứu về tác dụng chống nhiễm khuẩn của cây vằng sẻ Nghiên cứu này được áp dụng điều trị ở 254 sản phụ và cho nhiều kết quả đáng ch ý [17]

Giai đoạn năm 1984-1986 nhóm của Võ Thị Ngọc Sơn [17] và Nguyễn Thị Ninh Hải [6-7] đã công bố những nghiên cứu ban đầu về một số hoạt tính của cao vằng

sẻ Cả 2 báo cáo cùng tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng viêm của vằng sẻ với các phương pháp và liều lượng khác nhau Xem bảng 1.4

Bảng 1.4 So sánh kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của cây vằng sẻ Jasminum

Phươngpháp Gây phù bằng kaolin Gây phù bằng kaolin, serotonin, carragenin

1ml/con

Nước vằng sẻ 2g/kg chuột Cao etanol 40o 2g/kg chuột Dấu hi u

Tác dụng thuốc được đánh giá qua kết quả giảm sưng phù bàn chân chuột Kết quả Có tác dụng Tác dụng khá rõ r t trên cả 3 chất gây viêm

10g/kg chuột

Kết quả Chưa thấy tác dụng chống

1.2.5.3 Tác dụng kháng sinh của vằng sẻ trên một số vi khuẩn gây bệnh và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Tác giả Nguyễn Thị Ninh Hải và các cộng sự sử dụng các phương pháp sau để

nghiên cứu tác dụng kháng sinh của cao vằng sẻ (Jasminum subtriplinerve Blume):

+ Phương pháp khuếch tán trên thạch: gồm phương pháp khuếch tán dùng khoanh giấy và phương pháp khuếch tán dùng ống trụ

+ Phương pháp sinh tự ký

+ Phương pháp gây nhiễm trùng huyết trên chuột bằng Salmonella typhi

Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu của tác giả Võ Thị Ngọc Sơn chỉ tiến hành khảo sát bằng phương pháp khuếch tán dùng ống trụ

Kết quả được ghi nhận trong bảng 1.5

Bảng 1.5 Tác dụng kháng sinh của vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume lên một số

K TN: không thử nghi m

Các kết quả ghi nhận được cho thấy, vằng sẻ có tác dụng kháng khuẩn khá tốt,

trong đó tác dụng ức chế khá mạnh trong thử nghi m in vitro lên sự phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập từ b nh phẩm: liên cầu tan máu – Streptococcus haemolyticus, Achromobacter, Streptococcus albus, tụ cầu vàng – Staphyloccoccus aureus và Streplococcus epidermidis Tuy nhiên, các cao vằng sẻ này hoàn toàn không có tác dụng trên hai trực khuẩn– Bacillus subtilis, Bacillus mycoides và nấm Candida albicans [6-7]

Ngoài ra, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Ninh Hải còn cho thấy kết quả tác

dụng kháng khuẩn mạnh của vằng sẻ đối với các chủng Shigella dysenteriae, Shigella shigae và Salmonella typhi [6-7]

Các kết quả thu được từ phương pháp sinh tự kí và phương pháp khuếch tán khoanh giấy của các phân đoạn cao vằng sẻ chứa hợp chất terpenoid, glycosid đắng, flavonoid và syringin cũng cho thấy các cao này đều có khả năng ức chế tụ cầu

khuẩn Staphyloccoccus aureus và Streplococcus haemolyticus, nhưng phân đoạn

cao chứa hợp chất có flavonoid có tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn hợp chất

syringin [6]

Trong điều trị sản khoa cho sản phụ sau khi sinh còn dùng cao vằng sẻ để thay

sunfamid, các kháng sinh hoặc dùng phối hợp để giảm liều kháng sinh Kết quả cho thấy các vết mổ không bị nhiễm trùng và các vết khâu chóng khô, mau liền [6] Vào năm 2002, nhóm nghiên cứu của Kraus [32] tiến hành thử hoạt tính kháng nấm, bẫy gốc tự do DPPH● và thử nghi m ức chế sự phát triển của rễ cây củ cải

Raphanus sativa của sáu hợp chất cô lập từ cao metanol vằng sẻ Kết quả được ghi

nhận trong bảng 1.6:

Kết quả thu nhận được cho thấy các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh

nhất là: Chevangin A và Chevangin D trên cả hai chủng vi khuẩn B.subtilis và P.fluorescens

Khả năng bẫy gốc tự do DPPH● của Chevangin D và 6-epi-Chevangin B cao hơn Chevangin C

Đối với khả năng ức chế sự phát triển của rễ cây củ cải, Chevangin B có khả năng ức chế cao nhất với giá trị EC50 là 0.6 ppm

Bảng 1.6 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm, thử nghi m ức chế sự phát triển của rễ cây củ

cải Raphanus sativa và bẫy gốc tự do DPPH● của 6 hợp chất cô lập từ cao metanol của cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume [32]

Raphanus sativa (EC50 ppm)

Cùng với tác dụng kháng sinh của vằng sẻ trên một số vi khuẩn gây b nh Năm

2008, nhóm hóa lý hữu cơ, Khoa Hóa, Đại Học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh cũng công bố kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cao chiết cây vằng sẻ [14],[38]

Để kiểm tra tính kháng khuẩn kháng vi sinh vật kiểm định Thí nghi m được

thực hi n trên các vi khuẩn Gram (-) là E.coli và P.aeruginosa, các vi khuẩn Gram (+) là B.subtilis và S.aureus, các chủng nấm A.niger và F.oxysporum, các chủng men C.albicans và S.cerevisiae Các kết quả thu được cho thấy:

- Cao được trích bằng phương pháp ngâm dầm và đun hoàn lưu không có hoạt tính kháng vi sinh mạnh như cao trích bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng

- Tất cả các cao không có khả năng kháng chủng khuẩn P.aeruginosa và chủng nấm men C.albicans

- Trong phương pháp đun hoàn lưu, cao nước thương mại có hoạt tính mạnh

hơn hẳn, có thể kháng chủng khuẩn E.coli, B.subtilis và hai chủng nấm mốc

- Các cao trích từ phương pháp ngâm dầm không kháng được nấm mốc và nấm men

- Đa số các cao trích từ phương pháp chiết lỏng lỏng đều kháng được hai chủng nấm mốc (trừ cao ete dầu hỏa và butanol)

- Duy nhất cao butanol kháng được chủng nấm men S.cerevisiae với nồng độ

ức chế tối thiểu là 200 µg/ml

Các cao: Etyl axetat S2, etanol S3, ete dầu SA1-1, cloroform SB2, etyl axetat

SB3 đều có khả năng ức chế chủ yếu lên dòng Staphylococcus aureus; Các cao

nước vằng sẻ SB6, cloroform SB2, nhựa SB2-1 đều có khả năng ức chế lên dòng

Aspergillus niger [14] Các kết quả thu được ở trên thì phù hợp với nghiên cứu của

nhóm tác giả Nguyễn Thị Ninh Hải [6-7] và Võ Thị Ngọc Sơn [17]

1.2.5.4 Hoạt tính lợi mật, giảm co thắt

Cao vằng sẻ có tác dụng lợi mật trên chuột lang, làm giảm co bóp tự nhiên của

tử cung và giảm co thắt ruột gây bởi axetylcholin và briclorid trong ruột cô lập, đồng thời không làm ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận thuốc ngủ trên thần kinh trung ương [6]

Ngoài ra cao vằng sẻ còn có tác dụng làm giảm nhu động ruột [6]

1.2.5.5 Hoạt tính giảm sốt, giảm đau, làm lành vết thương, chống rỉ dịch màng

ph i

Cao nước vằng sẻ được nghi nhận có khả năng làm giảm sốt gây bởi natri nucleat, th c đẩy nhanh quá trình làm lành của vết thương Ngoài ra, cao vằng sẻ có tác dụng làm tăng tiết mật và tăng trọng lượng cắn mật trên chuột lang Cao vằng sẻ trong cồn 40o rất ít độc và không làm thay đổi các chỉ số huyết học và sinh hóa như:

hồng cầu, bạch cầu, tỷ l huyết sắc tố, protein toàn phần, urê huyết, các men GOT, GPT của chuột, thỏ Ngoài ra, các cơ quan như: gan, thận, thượng thận không có biểu hi n nhiễm độc [6]

1.2.5.6 Tác dụng độc tính tế bào và hoạt tính gây độc tế bào

Vằng sẻ được cho là không có độc tính qua đường uống [32]

Trong năm 2008, nhóm hóa lý hữu cơ, khoa Hóa, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh [14] cũng trình bày kết quả nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào bằng hai phương pháp là phương pháp nhuộm màu tế bào bằng sulforhodamine B (SRB) và phương pháp khảo sát hoạt tính kháng phân bào dựa theo vòng đời của ch ng (cell proliferation) trên các cao chiết: ete dầu, cloroform, etyl axetat, butanol, etanol, metanol và cao nước bằng các phương pháp chiết khác nhau Xem bảng 1.7

Khả năng gây độc tế bào của các loại cao được thử nghi m dựa trên phương pháp nhuộm màu SRB (sulforhodamine), thử nghi m được tiến hành trên 3 dòng tế bào ung thư là Hep-G2 (tế bào gan người bị ung thư biểu mô), RD (tế bào ung thư màng tim người), LU (tế bào ung thư phổi) Kết quả được ghi nhận dựa trên phần trăm tế bào sống sót so với mẫu chứng và mẫu trắng Khả năng gây độc tế bào cũng

được đánh giá dựa vào giá trị IC 50 Đối với các loại cao thô có giá trị IC 50 nhỏ hơn 20μg/ml thì được xem có khả năng gây độc tế bào

Các kết quả trình bày trong bảng 1.7 cho thấy, chỉ có hai cao không phân cực SA2, SB1-1 cho thấy có độc tính tế bào mạnh trên hai dòng tế bào Hep-G2 và RD, các cao còn lại đều có độc tính tế bào không cao

Cao cloroform SA2 có độc tính trên tế bào Hep-G2 mạnh hơn cao ete dầu, còn đối với tế bào RD thì cao ete dầu lại thể hi n độc tính mạnh hơn cao cloroform SA2 Tất cả các loại cao đều không thể hi n độc tính trên tế bào LU

Bảng 1.7: Phần trăm tế bào sống sót và IC 50 thu được từ khảo sát độc tính tế bào của

các cao vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume trên 3 dòng tế bào ung thư

Cao Ed SB1-1 33.60 ± 0.20 26.00 ± 0.10 62.10 ± 0.90 10.74 12.64 >20 CHCl 3 SA2 29.40 ± 0.40 49.50 ± 0.06 65.70 ± 0.90 6.92 18.97 >20

EtOH SB1-2 101.6 ± 0.60 82.80 ± 1.70 63.60 ± 2.30 >20 >20 >20 CHCl3 SB2 95.40 ± 1.30 90.00 ± 1.40 84.70 ± 0.90 >20 >20 >20

Nhựa SB2-1 106.1 ± 0.70 72.10 ± 0.50 87.60 ± 0.30 >20 >20 >20 Cao EA SB3 103.0 ± 1.10 61.20 ± 0.40 79.40 ± 1.60 >20 >20 >20

EtOH SB5 108.1 ± 0.06 75.70 ± 1.20 80.80 ± 1.60 >20 >20 >20 Cao nước SB6 103.5 ± 1.40 109.2 ± 1.30 82.20 ± 0.40 >20 >20 >20

1.2.5.7 Hoạt tính kháng oxi hoá

Năm 2008, nhóm hóa lý hữu cơ, Khoa Hóa, Trường ĐH KHTN Tp Hồ Chí Minh cũng công bố kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa của các cao dựa vào khả năng bẫy gốc tự do DPPH● (SC%) Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp dùng thuốc thử DPPH, kết quả được ghi nhận trong bảng 1.8

Kết quả thu được cho thấy, cao EtOH và cao EA thu được bằng phương pháp

trích lỏng – lỏng có hoạt tính kháng oxi hoá khá tốt, với các giá trị SC(%) 56.35 và 57.64 ở nồng độ 200 μg/mL, cao hơn hẳn các cao còn lại, so với giá trị SC(%) của mẫu chứng (+) axit Ascorbic là 63.67 ở nồng độ 44 μg/mL

Bảng 1.8 Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của các cao vằng sẻ Jasminum subtriplinerve

Blume bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH● [14]

1.3 MÔ HÌNH GAN NHIỄM ĐỘC TRONG THỬ NGHIỆM IN VIVO

1.3.1 Cơ chế gây độc của CCl 4 [5],[19],[29],[44],[45],[47]

CCl4 là một chất gây độc cho gan đã được biết từ lâu và sự gây hại của nó tương

tự với nhiều loại chất gây độc cho gan ở người CCl4 gây ra b nh gan cấp và mãn tính cũng như b nh ung thư và gây đột biến mất đoạn nhiễm sắc thể CCl4 là tác

nhân được dùng phổ biến trong mô hình gây tổn thương gan trên động vật (in vivo)

Khả năng gây độc gan của CCl4 là do sự chuyển hóa của CCl4 trong gan, hình thành gốc tự do ●CCl3 qua h thống chuyển hóa NADPH-CYP Sau đó các gốc này

sẽ phản ứng với nhau hoặc với các phân tử khác

Các gốc tự do của quá trình chuyển hóa CCl4 trong cơ thể gây hại tế bào do

ch ng khởi phát sự peroxid hóa lipid, tạo liên kết cộng hóa trị với protein, làm tăng nồng độ Ca2+

nội bào, giảm GSH và tăng sự giải phóng sắt, cuối cùng là gây chết tế bào Sự chuyển hóa CCl4 bởi các enzym CYP trong ti thể đã được biết từ lâu Sự liên kết hóa trị của CCl4 với DNA ti thể cao hơn sự liên kết hóa trị của CCl4 với

DNA nhân, chu i hô hấp ti thể có thể cung cấp đi n tử cần thiết cho sự hình thành CCl4 và kết quả là hình thành gốc tự do Ngoài ra, sự chuyển hóa CCl4 có thể hình thành liên kết cộng hóa trị với protein, lipid, DNA của nhân, làm cho DNA của tế bào bị biến đổi Những kết quả này giải thích cho ảnh hưởng gây ung thư của CCl4

Do đó, CCl4 là một chất độc điển hình để tạo mô hình gan bị các gốc tự do phá hoại

trong cả mô hình in vitro và in vivo

Sự peroxit hóa lipid có thể làm gia tăng tiến triển b nh gan nhiễm mỡ và xơ gan

Có thể đánh giá malonyldialdehid (MDA) như chất chỉ thị theo dõi sự peroxid hóa lipid kết quả cho thấy hàm lượng MDA tăng gấp 7 lần khi xử lý gan với CCl4 trong thời gian 14 giờ

1.3.2 Mô hình in vitro và in vivo [19],[20]

Trong những thập kỉ gần đây vi c sàng lọc tác dụng sinh học trên mô hình in vitro đã tăng lên một cách nhanh chóng không chỉ do sự phát triển của các phương

pháp nuôi cấy tế bào trong các phòng thí nghi m mà hơn hết là do những ưu điểm

mà phương pháp này mang lại So với các thử nghi m in vivo, các mô hình in vitro

có một số ưu điểm sau:

- Thời gian làm thí nghi m cho dù khảo sát độc cấp tính hay mãn tính đều

ngắn hơn so với in vivo.

- Lượng mẫu chất độc hay mẫu thử sử dụng ít hơn, điều này có ý nghĩa kinh

tế cao

- Cùng một l c có thể sàng lọc được một số lượng lớn mẫu thử ở các nồng độ thử khác nhau, hay thử trên sự kết hợp các chất với nhau

- Cho phép thực hi n các nghiên cứu không thể thực hi n trên cơ thể vì lý do nhạy cảm như: khảo sát tác động của chất độc, tạo tế bào biến đổi di truyền thông qua đột biến, nuôi cấy tế bào ung thư, tế bào gốc … hoặc những nghiên cứu mà kết quả trên động vật không thể áp dụng cho người

- Về mặt đạo đức sinh học, chúng ta không thể đưa con người ra thí nghi m gây độc rồi lại cho uống thuốc thử tác dụng bảo v của thuốc mà vẫn chưa biết chắc

O HO

OH

OH OH

OH O

nồng độ tác dụng và thời gian dùng thuốc Một lợi điểm nữa khi thử in vitro so với thử in vivo (trên động vật sống) sẽ gi p hạn chế được số lượng động vật cho m i

thử nghi m, giảm kinh phí nghiên cứu

Tuy nhiên mô hình in vivo vẫn có những ưu điểm mà mô hình in vitro không

sánh được, đó chính là tính tổng thể của cơ thể Một chất khi đưa vào cơ thể không thể chỉ tác dụng đến một cơ quan riêng bi t mà nó còn ảnh hưởng và bị ảnh hưởng

của những cơ quan khác trong cơ thể Do vậy, sau khi thử in vitro, người ta thường thử tiếp in vivo để xác định lại tác dụng của thuốc trên cơ thể sống, nhưng l c này

lượng mẫu thử chỉ là những mẫu đã được sàng lọc nên tiết ki m kinh phí và thời gian thử nghi m hơn

1.4 Chất chuẩn

Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu cao khảo sát, chúng tôi sử dụng

Quercetin làm chất đối chứng dương trong hai phương pháp bẫy gốc tự do DPPH●

và phương pháp ức chế gốc tự do NO● vì đây là chất có hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH• [31] ,[38] và ức chế gốc tự do NO● [42]mạnh, được sử dụng làm chất chuẩn trong các nghiên cứu tương tự

Silymarin là h n hợp flavonoid chiết từ quả cây c c gai (Sylibum marianum) vốn

đã được sử dụng để điều trị các chứng vàng da và rối loạn đường mật [23],[37],[39] Silymarin có tác dụng ổn định màng tế bào, ngăn cản quá trình xâm nhập của các chất độc vào bên trong tế bào gan [42], gi p cho tế bào không bị các chất độc xâm

Công thức cấu tạo của Quercetin

nhập và huỷ hoại, do đó nó làm bền vững màng tế bào, duy trì được cấu tr c, chức

năng của tế bào

Silymarin có tác dụng ức chế sự biến đổi của gan thành các tổ chức xơ, giảm sự

hình thành và lắng đọng của các sợi collagen dẫn đến xơ gan [35], [48] Ngoài ra,

Silymarin còn bảo v tế bào gan, tăng cường chức năng gan và kích thích sự phát

triển của các tế bào gan mới để thay thế các tế bào gan cũ bị tổn thương, kích thích

phục hồi các tế bào gan đã bị hủy hoại [22] cũng như có tác dụng chống peroxid

hóa lipid, chống viêm [25 -27], [43], từ đó cải thi n các dấu hi u cũng như tri u

chứng b nh gan, làm giảm nồng độ các enzym gan trong máu

Silymarin đã được kiểm nghi m, chứng thực tác dụng phục hồi gan, đã được bào

chế thành thuốc bán ra thị trường và sử dụng rộng rãi, nên chúng tôi sử dụng

Silymarin như là một chất chuẩn trong phương pháp sàng lọc tác dụng bảo v gan

trên mô hình chuột nhiễm độc CCl4 (in vivo) để đối chiếu, so sánh với tác dụng

phục hồi gan với các cao chiết, phân đoạn của cây vằng sẻ

(a) (b)

(c) (d)

Hình 1.2: Hoa C c gai và một số dạng thương phẩm của Silymarin [50],[51]

(a): Cấu tr c khung sườn của Silybin, một thành phần trong Silymarin (b): Hoa Cúc gai

(c),(d): Một số dạng thương phẩm của Silymarin

CHƯƠNG 2:

THỰC NGHIỆM

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Cành và lá vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume được thu hái tại huyện Cam

Lộ, tỉnh Quảng Trị vào tháng 9/2005 Mẫu vằng sẻ được định danh bởi PGS.TS Lê Công Kiệt và ThS Nguyễn Trần Quốc Trung, được lưu tại Bộ môn Thực vật và Sinh môi, khoa Sinh trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Tp HCM số hiệu TV 1069 Cành và lá được phơi khô ở nhiệt độ phòng và xay nhuyễn

n p lư i đậy ở trên, nư c uống được đựng trong nh ng xi-lanh sạch – được g n lên

n p bocal – đ chuột uống nư c Th c n là dạng cám viên dành riêng cho chuột, mua từ viện Pasteur Nha Trang và bổ sung thêm các loại rau như giá, xà lách, rau muống Sau m i 2 ngày nuôi, thay tr u và rửa bocal sạch s

Hình 2.1: Các dụng cụ nuôi chuột

(a): Bocal nuôi chuột (b): Nắp lưới (c): Lồng nuôi chuột hoàn chỉnh

2.1.3 Hóa chất – dụng cụ

- Etanol 99.5o (Chemsol, >99 )

- Ete dầu h a (Ed) phân đoạn từ 60 – 90oC

- Metanol (MeOH) phân đoạn 64-65 oC

- Cloroform (CHCl3) (Chemsol)

- Etyl axetat (EA) phân đoạn 75 – 77oC

- Aceton (Ac) (Chemsol)

- Butanol (BuOH) (Chemsol)

- Silicagel dùng cho s c kí cột (Merck, Kielselgel 60, 46-60µm)

- Bản m ng silicagel tráng sẵn (Merck, Kielselgel 60F254, 250µm)

- Silicagel pha đảo, bản m ng silicagel pha đảo tráng sẵn

- Thuốc thử ALT/GPT (H ng Diagnosticum Zrt.-Hungaria)

- Đèn soi UV hai bư c sóng (254– 365 nm) Shimadu 1700, Japan

- Các máy đo phổ MS (micro OTOF – Q 10187)

- Máy đo IR (Bruker Equinox 55 FT-IR)

- Máy đo phổ 1

H-NMR (500 Hz) và 13C-NMR (125 Hz) một chiều và hai chiều (Brucker AV 500)

- Máy li tâm Hettich – Mikro 200

- Đèn UV Vilbert Lourmat CN15LC

- Máy quang phổ UV (1800 Shimadzu)

Và các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Quy trình trích ly

Sử dụng phương pháp trích ly l ng – l ng

Sử dụng 2.68 kg nguyên liệu vằng sẻ, bao gồm cành và lá đ được xay nhuyễn,

ngâm trong etanol 99.5o (v i 12.0 Lx 3lần x 24 giờ) Dịch lọc etanol cô lại còn

khoảng 1 lít được khử màu bằng than hoạt tính

Lượng cao etanol tổng thu được là 408g Hòa tan lượng cao này trong 1,2 L

etanol, sau đ cho vào 4,8 L nư c c t, làm lạnh Sau khi lọc, thu được phần r n A

và phần dịch B

Phần dịch B được trích bằng ete dầu, phần tan trong ete dầu cho cao ete dầu và

dịch C Phần dịch C được trích bằng bằng chloroform cho hai sản phẩm, phần tan

trong chloroform cho cao chloroform và l p nhựa Phần dịch còn lại được trích lần

lượt bằng các dung môi etyl axetat và butanol Sau khi thu hồi dung môi thu được

các cao etyl axetat và butanol Quy trình trích ly được t m t t trong sơ đồ 2.1

K t quả ly trích từ 2.68 kg thân và lá vằng sẻ thu được 5 loại cao v i khối lượng

tương ng Xem bảng 2.1:

Bảng 2.1: Khối lượng các cao trích ly được từ cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume

2.2.2 Khảo sát hoạt tính sinh học của các cao và các phân đoạn

N m cao trích ly từ cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume được đem thử

hoạt tính kháng oxi hoá bằng hai phương pháp bẫy gốc tự do DPPH• và phương pháp c ch gốc tự do NO•, nhằm phục vụ cho các thí nghiệm ti p theo

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ trích ly các cao từ nguyên liệu

Cành lá vằng sẻ khô xay nhuyễn (2.68 kg)

Ngâm etanol (12.0 L x 3 lần x 24 giờ), cô còn 1 L

Lắc với MgSO 4 7H 2 O, lọc, cô quay

 Phương pháp thử hoạt tính bẫy gốc tự do 

DPPH [31]

N m 1922, Goldschmidt và Renn [19] đ phát hiện ra một gốc tự do bền c màu tím đậm, không bị phân huỷ hay trùng hoá và cũng không phản ng v i oxi là gốc

DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) Gốc tự do này không tan trong

nư c, tan trong dung môi h u cơ, c bư c s ng h p thu cực đại 517nm

Các ch t c khả n ng kháng oxi hoá s trung hoà hay bao vây các gốc tự do

Chuẩn bị hóa chất

định m c 100 ml bằng etanol được dung dịch DPPH•

100 µM (được gọi là dung dịch làm việc)

Pha mẫu thử: Dung dịch làm việc của mẫu cao có nồng độ 500 µg.mL-1

Đ khảo sát hoạt tính của các cao, ban đầu chúng tôi pha các mẫu thử và mẫu so sánh ở các nồng độ khác nhau Mẫu thử và mẫu so sánh được pha theo bảng 2.4:

Hình 2.2: Phản ng trung hoà gốc DPPH [31] 

Bảng 2.2: Tỉ lệ pha mẫu thử và mẫu so sánh ở các nồng độ khác nhau

Tương ng v i m i nồng độ mẫu thử, chuẩn bị một mẫu tr ng Mẫu tr ng tương

tự như mẫu thử nhưng thay VDPPH bằng Vetanol

Nh ng mẫu c hoạt tính mạnh, phần tr m c ch trên 50  ở nồng độ 10 µg.mL-1, ti p tục được ti n hành thử ở các nồng độ th p hơn, v i các nồng độ tương ng: 5, 2 và 1 µg.mL-1 Khi đ sử dụng mẫu làm việc c nồng độ 100 µg.mL-1

Các mẫu thử được pha ở các nồng độ khác nhau v i th tích 1500 μL, sau đ thêm 1500 L DPPH• (100 M) và ủ trong b ng tối 30 phút gọi là dung dịch ủ, sau

đ ti n hành đo quang ở bư c s ng 517 nm

Xác định hoạt tính kháng oxi hóa và tính giá trị IC 50

Hoạt tính kháng oxi hoá được tính dựa trên phần tr m c ch (I ):

I () = Ac - AsAc  100 

Trong đ :

Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control)

As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu cao (sample)

 Mẫu ch ng dương: thay V1 µL mẫu cao V2 µL dung dịch DPPH●

 Mẫu tr ng: được chuẩn bị tương tự mẫu cao nhưng VDPPH được thay bằng

Vetanol

M i mẫu ban đầu được thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µg.mL-1

M i nồng độ được ti n hành 3 lần L y trung bình giá trị phần tr m của 3 lần thử

m i mẫu đ s xác định được giá trị phần tr m c ch ng v i từng nồng độ khảo sát

N u mẫu thử có hoạt tính mạnh, giá trị phần tr m c ch trên 50 , mẫu s được thử ti p ở các nồng độ th p hơn 10, 5, 2, 1 µg.mL-1 đ tìm ra giá trị IC50

 Ti n hành khảo sát tác dụng của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau

 V i nh ng mẫu c hoạt tính bi n thiên tuy n tính v i nồng độ, s thu được một đường thẳng y = ax + b qua t t cả các đi m (v i y là  c ch và x là nồng độ)

 V i nh ng mẫu c hoạt tính không bi n thiên tuy n tính v i nồng độ, một cách gần đúng, chọn 2 nồng độ c ch trên và dư i 50 , ti n hành v đường thẳng

y = ax + b s thu được phương trình y = ax + b v i 2 hệ số a, b đ bi t

 Thay y = 50  vào phương trình s thu được giá trị x Đ chính là nồng độ

c ch được 50  gốc tự do (IC50)

 M i nồng độ được thực hiện 3 lần, thu được 3 giá trị phần tr m Giá trị

phần tr m c ch là trung bình của 3 lần thực hiện

Dư i ánh sáng natri nitroprussid dễ dàng bị phân hủy tạo ra NO● Trong dung dịch nư c, NO●

sinh ra phản ng v i oxi tạo ra sản phẩm bền v ng là nitrit và nitrat Khi trong mẫu c hoạt ch t c ch NO●

s làm giảm nồng độ nitrit tạo thành trong dung dịch Khả n ng c ch gốc tự do NO●

của mẫu được tính toán dựa trên

sự giảm hàm lượng nitrit tạo thành của mẫu c ch t c ch NO●

so v i mẫu không

có ch t c ch NO● (mẫu control)

Hàm lượng nitrit tạo thành trong dung dịch nư c được xác định bằng phương pháp tr c quang sử dụng thuốc thử Greiss Nitrit phản ng v i thuốc thử Greiss tạo thành hợp ch t màu diazo bền h p thu ở bư c s ng cực đại 540 nm

Chuẩn bị hóa chất

 Đệm photphat pH = 7.4: Hòa tan 2.72 g muối NaH2PO4 và 7.16 g muối

Na2HPO4.12H2Otrong 1000 mL nư c c t 2 lần Dùng NaOH và H3PO4 điều chỉnh pH đ n 7.4 bằng máy pH

nitroprussid hòa tan trong đệm photphat pH = 7.4, sử dụng bình định m c

50 mL Dung dịch này được pha ngay trư c khi ti n hành phản ng, đựng trong chai tối màu và gi trong b ng tối trư c khi ti n hành thí nghiệm

- Dung dịch A (Sulfanilamid 2% trong H3PO4 4%): Cân khoảng 2g Sulfanilamid hòa tan thành 100 mL bằng dung dịch H3PO4 4 %

- Dung dịch B (naphtyletylendiamin 0.2 %): Cân khoảng 0.2 mg naphtyletylendiamin hòa tan thành 100 mL bằng nư c c t hai lần

N-1-Cả hai dung dịch A và B đều được đựng trong chai tối màu và bảo quản trong tủ lạnh Dung dịch A và B được trộn chung cùng tỉ lệ trư c khi thí nghiệm

Chuẩn bị mẫu cao

Cân khoảng 1.80 - 1.90 mg ng v i m i loại cao Pha trong típ nhựa 2 mL bằng đệm photphat pH = 7.4 đ c nồng độ gốc là 1000 µg.mL-1 Nồng độ các mẫu thử là

200, 100, 50 và 25 µg.mL-1

Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO ●

Quy trình thử hoạt tính c ch gốc tự do NO● được t m t t trong sơ đồ 2.3

Sơ đồ 2.3: Quy trình thử hoạt tính c ch gốc tự do NO●