Phân đoạn cao etyl axetat được ti n hành s c ký cột k t hợp v i s c ký bản m ng đ cô lập các hợp ch t.
Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm như IR, MS, 1D-NMR và 2D-NMR đ xác định c u trúc, nhận danh các hợp ch t cô lập được.
K t quả thử hoạt tính kháng oxi hoá bằng các phương pháp bẫy gốc tự do DPPH● và phương pháp c ch gốc tự do NO● cho th y, cao etyl axetat c hoạt tính kháng oxi hoá cao nh t nên ti p tục đem phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học các phân đoạn, cũng như các ch t tinh khi t cô lập được.
Ti n hành phương pháp s c kí cột (SKC) cao EA thô ban đầu c khối lượng 30g. Sử dụng cột c đường kính 6cm, cao 50 cm và nạp 380.0 g silicagel (6cm; 50cm; 380g). Sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH theo tỉ lệ t ng dần độ phân cực, b t đầu
từ 0 đ n 100 % MeOH. Dựa trên k t quả thu được từ quá trình theo dõi s c ký bản m ng (SKBM), gom được 8 phân đoạn từ VS1- 8.
Sơ đồ 2.4: Sơ đồ tách các phân đoạn từ cao vằng sẻ EA thô.
Các phân đoạn VS2 đ n VS8 được ti p tục đem khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH● và khả n ng c ch gốc tự do NO●. K t quả thu được cho th y phân đoạn VS3-5 c hoạt tính cao nh t. Chúng tôi chọn phân đoạn VS3 đ ti p tục khảo sát cô lập ch t.
Trích 10g trong phân đoạn VS3 ti n hành SKC ( 6cm; 50cm; 250g ). Sử dụng hệ dung môi CHCl3-EA giải ly v i độ phân cực t ng dần từ 0 đ n 100% EA, sau đ chuy n qua hệ dung môi EA-MeOH ( v i độ phân cực t ng dần từ 0 đ n 100 % MeOH). Dựa trên k t quả thu được sau khi theo dõi các phân đoạn bằng SKBM, gom được 10 phân đoạn từ VS3.A - J.
Sơ đồ 2.5: Sơ đồ tách các phân đoạn từ phân đoạn VS3
Cao etyl axetat (30g)
SKC: ( 6cm; 50cm; 380g) Hệ giải ly: CHCl3:MeOH
VS1 0.367g VS2 2.674g VS3 15.25g VS4 3.85g VS5 1.843g VS6 0.193g VS7 0.303g VS8 0.987g Phân đoạn VS3 15.25g SKC: ( 6cm; 50cm; 250g)
Hệ giải ly: 1:CHCl3- EA, 2: EA-MeOH VS3.A 0.058g VS3.B 0.045g VS3.C 0.675g VS3.D 0.192g VS3.E 0.576g VS3.F 1.708g VS3.G 0.745g VS3.H 2.725g VS3.I 1.254g VS3.J 1.950g
Theo dõi qua s c kí bản m ng, cho th y trên SKBM của các phân đoạn VS3.A, VS3.B và VS3.G các v t tách khá rõ ràng, do đ chúng tôi đ chọn các phân đoạn này đ ti p tục tách đ tìm ki m các ch t m i.
2.2.3.1 Khảo sát phân đoạn VS3.A
Phân đoạn VS3.A sau khi loại dung môi th y xu t hiện tinh th hình kim có lẫn tạp màu vàng c khối lượng 58.2mg. Hoà tan toàn bộ ch t r n thu được trong lượng vừa đủ dung môi aceton, ti n hành SKC (1cm; 30cm; 7g). Pha động sử dụng hệ dung môi Ed:EA t ng dần độ phân cực từ 0 đ n 100% EA. Theo dõi SKBM gom được 7 phân đoạn VS3.A1-7. Khảo sát ti p phân đoạn VS3.A5.
Phân đoạn VS3.A5 c khối lượng 29.3mg ti p tục được SKC (1cm; 30cm; 6g), sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH và vài giọt HCOOH, t ng dần độ phân cực đ n 50% MeOH. Theo dõi SKBM gom được 4 phân đoạn VS3.A5.1-4. Khảo sát ti p phân đoạn VS3.A5.3.
Ti p tục khảo sát phân đoạn VS3.A5.3 c khối lượng 18.6mg bằng phương pháp SKC (1cm; 30cm; 6g), v i hệ dung môi Ed-EA và vài giọt HCOOH, t ng dần độ phân cực từ 0 đ n 100% EA. Thu được ch t c dạng tinh th hình kim màu tr ng c khối lượng 12.4mg (kí hiệu VS3.1), giải ly trong hệ dung môi Ed-EA (6:4) (3 giọt HCOOH) cho Rf = 0.33.
Sơ đồ 2.6: Sơ đồ cô lập các hợp ch t từ phân đoạn VS3.A
Phân đoạn VS3.A (58.2mg)
SKC:( 1cm; 30cm; 7g), Hệ giải ly: Ed-EA . 7 phân đoạn VS3.A1-7.
Phân đoạn VS3.A5 (29.3mg)
SKC:( 1cm; 30cm; 6g), Hệ giải ly: CHCl3-MeOH-HCOOH. 4 phân đoạn VS3.A5.1-4
Phân đoạn VS3.A5.3(18.6mg)
SKC (1cm; 30cm; 6g)
Hệ giải ly: ED-EA, HCOOH. 12.4 mg ch t Kí hiệu: VS3.1
2.2.3.2 Khảo sát phân đoạn VS3.B
45mg của phân đoạn VS3.B được ti n hành SKC (1cm; 30cm; 8g), hệ dung môi Ed:Ac. T ng độ phân cực từ 0 đ n 100% Ac. Ki m soát bằng SKBM gom được 5 phân đoạn VS3.B1-4. Khảo sát ti p phân đoạn VS3.B4.
Ti p tục khảo sát phân đoạn VS3.B4 c khối lượng 34 mg bằng phương pháp SKC (1cm; 30cm; 6g), v i hệ dung môi CHCl3-EA (vài giọt HCOOH) thu được ch t có dạng tinh th hình kim màu tr ng c khối lượng 15.2mg (kí hiệu: VS3.2), giải ly trong hệ CHCl3-EA (1:1) thêm 3 giọt HCOOH cho Rf=0.25.
Sơ đồ 2.7: Sơ đồ cô lập các hợp ch t từ phân đoạn VS3.B
2.2.3.3 Khảo sát phân đoạn VS3.G
Phân đoạn VS3.G c khối lượng 745mg, ti n hành SKC (3cm; 50cm; 50g), v i hệ dung môi: CHCl3-EA-MeOH, trong đ pha trư c h n hợp dung môi CHCl3-EA (1:1), h n hợp sau khi pha được sử dụng cùng MeOH v i độ phân cực t ng dần từ 0 đ n 100% MeOH, thêm 0.5ml HCOOH trong 100mL h n hợp. Dựa trên k t quả thu được bằng SKBM, gom được 4 phân đoạn VS3.G1-4. Khảo sát ti p phân đoạn VS3.G3.
Cao thu được từ phân đoạn VS3.G3 c khối lượng 209,3mg ti p tục được SKC (3cm; 50cm; 40g), hệ dung môi CHCl3-(MeOH-H2O) v i h n hợp MeOH-H2O được chuẩn bị sẵn v i tỉ lệ 95:5, t ng độ phân cực của dung môi bằng cách t ng dần
Phân đoạn VS3.B (45mg)
SKC: (1cm; 30cm; 8g), Hệ giải ly: Ed-Ac 5 phân đoạn VS3.B1-4
Phân đoạn VS3.B4 (34 mg)
SKC: ( 1cm; 30cm; 6g)
Hệ giải ly: CHCl3:EA-HCOOH
15.2 mg ch t Kí hiệu: VS3.2
từ 0 đ n 100% h n hợp MeOH-H2O vừa pha. Dựa trên k t quả thu được từ quá trình theo dõi SKBM, gom được 6 phân đoạn VS3.G3.1-6. Khảo sát ti p phân đoạn VS3.G3.5.
Ti p tục khảo phân đoạn VS3.G3.5 c khối lượng 87.8mg bằng phương pháp sát s c kí pha đảo v i kích thư c cột (1cm; 50cm), hệ dung môi MeOH-H2O v i tỉ lệ 2:8 và giảm dần độ phân cực đ n tỉ lệ 8:2. Dựa trên k t quả thu được từ quá trình theo dõi SKBM, gom được 4 phân đoạn VS3.G3.5.1-4. Khảo sát ti p phân đoạn VS3.G3.5.3.
Phân đoạn VS3.G3.5.3 c khối lượng 22.8mg được ti n hành SKBM điều ch pha đảo v i hệ dung môi giải ly MeOH-H2O (1:1) thu được ch t có màu vàng có khối lượng 11mg (kí hiệu:VS3.3) Rf = 0.75.
Sơ đồ 2.8: Sơ đồ cô lập các hợp ch t từ phân đoạn VS3.G
Phân đoạn VS3.G 0.745g
SKC: ( 3cm; 50cm; 50g)
Hệ giải ly: CHCl3-EA.
4 phân đoạn VS3.G1-4
Phân đoạn VS3.G3 (209.3 mg)
SKC: ( 3cm; 50cm; 40g) Hệ giải ly: CHCl3-MeOH-H2O. 6 phân đoạn VS3.G3.1-6
Phân đoạn VS3.G3.5 ( 87.8 mg)
SKC pha đảo( 1cm; 50cm) Hệ giải ly: H2O-MeOH. 4 phân đoạn VS3.G3.5.1-4
Phân đoạn VS3.G3.5.3
(22.8 mg)
SKBM điều chế pha đảo Hệ giải ly: H2O-MeOH (1:1)
11 (mg) ch t Kí hiệu: