Cao etyl axetat sau khi c k t quả khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng oxi h a bằng các phương pháp c ch gốc tự do NO● và phương pháp bẫy gốc tự do DPPH● được ti p tục khảo sát khả n ng bảo vệ gan bằng mô hình in vivo v i các liều lượng khác nhau.
Chuột được nuôi ổn định trong 7 ngày v i các điều kiện phòng thí nghiệm và được n uống tự do trư c khi ti n hành thí nghiệm. Cho chuột nhịn n 18 giờ trư c khi uống thuốc.
2.2.4.1 Bố trí lô thí nghiệm [20]
Chuột được chia làm 4 lô chính (hoặc hơn tùy yêu cầu thí nghiệm). M i lô tối thi u 6 con.
- Lô chứng trắng L0: là lô chuột dùng đ làm chuẩn so sánh, không gây độc, không dùng thuốc, chỉ uống nư c. Lô này cho uống 0.2 ml nư c (c DMSO, tỉ lệ DMSO phụ thuộc vào tỉ lệ được dùng đ hòa tan cao chi t hay ch t chuẩn).
- Lô độc Lđ: chuột bị gây độc gan bằng cách cho uống 0.2 ml CCl4 pha trong dầu oliu (tỉ lệ pha s được khảo sát), ti n hành cùng lúc v i các lô khác nhưng không cho uống mẫu thử nghiệm.
- Lô chứng chuẩn L*: là lô chuột sau khi bị gây độc (uống 0.2 ml CCl4), s cho uống 0.2 ml ch t chuẩn Silymarin (254924) sau 1 giờ.
- Lô thử L: lô thử L c th c nhiều lô nh tùy số lượng mẫu thử được đánh số theo mẫu thử nghiệm khác nhau hay nồng độ khác nhau của mẫu thử L1, L2 ... 1 giờ sau khi được uống 0.2 ml CCl4 chuột s được uống mẫu thử nghiệm là các cao chi t hay phân đoạn ở các nồng độ khác nhau.
2.2.4.2 Thiết kế thí nghiệm [20]
Gồm 6 lô ng v i các nồng độ CCl4 (pha v i dầu oliu) như sau: 100 %, 50 %, 30 %, 25 %, 20 % và 10 %.
Cách tiến hành:
- Pha CCl4 v i dầu oliu thành các nồng độ n i trên.
- Cho chuột nhịn n 18 giờ rồi cho uống dung dịch CCl4 đ pha ở trên. Sau khi uống cho chuột n uống bình thường.
- Quan sát và theo dõi ghi nhận hành vi, bi u hiện và sự sống ch t của chuột trong các lô ngay sau khi gây độc và 24 giờ sau đ .
Thí nghiệm 2 – Sàng lọc mẫu thử nghiệm với chất chuẩn [20]
Mẫu thử nghiệm sau khi được sàng lọc in vitro, k t quả được đánh giá, so sánh v i ch t chuẩn s được ti p tục sàng lọc in vivo nhằm đánh giá tác dụng hạ men gan của mẫu thử nghiệm.
Ti n hành v i các lô sau:
Các lô trắng (Lo) và lô độc ( Lđ);
Các lô chuẩn L*1, L*2, L*3, L*4, lần lượt ng v i ch t chuẩn silymarin (254924) ở các nồng độ (mg.ml-1): 0.5; 0.1; 0.05 và 0.01.
Các lô thử nghiệm L1, L2, L3, L4, lần lượt ng v i mẫu cao chi t EA ở các nồng độ (mg.ml-1
): 0.5; 0.1; 0.05 và 0.01.
Cách tiến hành:
- Pha mẫu thử nghiệm và ch t chuẩn (như phần 2.2.4.3). - Cho các lô uống thuốc (như phần 2.2.4.4).
- Sau khi uống thuốc 24 giờ, l y máu chuột trong t t cả các lô (như phần 2.2.4.4).
- Ly tâm và thu l y huy t thanh rồi đo hoạt lực ALT/GPT (như phần 2.2.4.5).
2.2.4.3 Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
- Các mẫu cao thử nghiệm và ch t chuẩn được hòa tan v i DMSO rồi pha v i nư c c t thành các liều dùng theo như phần thi t k thí nghiệm.
- Thuốc gây độc: CCl4 pha v i dầu oliu (tỉ lệ pha s được khảo sát).
- Dung dịch đối ch ng Lo: nư c c t 2% DMSO (tỉ lệ DMSO phụ thuộc vào tỉ lệ DMSO dùng đ hòa tan mẫu và ch t chuẩn).
2.2.4.4 Tiến hành thí nghiệm:
Cho chuột uống thuốc
- Cho chuột nhịn n 18 giờ trư c khi uống thuốc.
- Dùng ng n cái và ng n tr tay trái túm nhẹ gáy chuột, ngón áp út kẹp chặt đuôi, gi thân chuột nghiêng một g c 450 về phía trư c. Tay phải cầm ống tiêm (đầu cong chuyên dụng) c ch a thuốc đưa nhẹ vào thực quản chuột, khi th y chuột c cử động nuốt thì bơm thuốc vào.
- Cho các lô uống như phần bố trí thí nghiệm.
Hình 2.3 Các thao tác cho chuột uống thuốc
Cách lấy máu chuột
- Sau khi cho chuột uống thuốc 24 giờ, b t đầu ti n hành l y máu chuột. Cách b t chuột:
- Tay trái cầm đuôi chuột, ng n cái và ng n tr tay phải n m nhẹ l y cổ chuột, dựng chuột thẳng đ ng, các ng n còn lại gi thân và kẹp đuôi, vuốt nhẹ đuôi rồi dùng kéo c t 1 đoạn nh đuôi chuột, nhẹ nhàng vuốt đuôi đ l y máu.
- L y 0.1ml máu chuột hòa trong 0.55ml EDTA 0.05 M trong ống tube 1ml đ tránh đông máu.
- Mẫu máu/EDTA được ly tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút đ thu l y huy t thanh và ti n hành đo ALT/GPT.
Hình 2.4: Các bư c l y máu chuột
(a): B t chuột (b): Vuốt đuôi (c): C t đuôi (d): H ng máu
2.2.4.5 Phƣơng pháp đo ALT/GPT [5],[20]
ALT (alanin aminotransferase) là một enzym hiện diện trong bào tương của t bào. ALT xúc tác cho quá trình chuy n h a của các nh m aminoaxit trong suốt quá trình bi n đổi của aminoaxit và α-ketoaxit. Pirydoxal photphat làm hoạt h a quá trình. Enzym tìm th y trong huy t thanh phần l n là từ gan và thận. Sự hoạt động của enzym trong huy t thanh s t ng lên khi c một số bệnh về gan.
ALT xúc tác sự bi n đổi của L-Alanin và 2-Oxoglutarat tại pH tối ưu. Pyruvat sinh ra trong quá trình này s được bi n đổi bởi Lactat dehydrogenase (LDH) v i sự hiện diện của coenzym NADH/NAD+
cho L-lactat, trong khi quá trình oxi h a khử NADH/NAD+ làm giảm độ h p thu tại bư c s ng 340 nm. Sự thay đổi của độ h p thu s tương đương v i hoạt độ ALT trong huy t thanh.
L-Alanin + 2-Oxoglutarat ALT
Pyruvat + L-Glutamat
Pyruvat + NADH LDH
L-lactat + NAD+
Theo phương trình phản ứng, hoạt lực ALT càng cao thì càng có nhiều enzym ALT xúc tác phản ứng hình thành pyruvat. Càng nhiều pyruvat thì sự hình thành L-lactat càng nhiều, cường độ màu càng tăng, nên độ hấp thu càng cao. Điều này hoàn toàn phù hợp với công thức tính toán. Độ hấp thu tỉ lệ với hoạt lực của ALT. Giá trị OD càng cao thì hoạt lực ALT càng cao hay men gan càng cao.
Tiến hành đo
Hòa trộn 100 µl mẫu cần đo v i 1 ml thuốc thử rổi ủ ở 37 OC trong 2 phút, đo độ h p thu OD ở 3 thời đi m: 0s, 60s, 120s tại bư c s ng 340 nm.
Phƣơng pháp xử lí số liệu
Cách tính A
Đo OD ở 3 thời đi m: 0s, 60s và 120s:
A = Độ h p thu ở 0s – Độ h p thu ở 120s
Họat lực (U/I) = A x 2200
Cách tính tỉ lệ giảm
Là tỉ lệ giảm hoạt lực ALT của lô thử hay lô chuẩn (L hay L*)so v i lô độc (Lđ)
TLG =
*) (hayL L
Lđ
CHƢƠNG 3:
KẾT QUẢ
3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN VITRO