3.2.1 Hợp chất VS3.1
Tinh thể màu trắng, tan tốt trong etyl axetat, metanol hoặc aceton.
Trên phổ MS xuất hiện mũi ion phân tử [M-H]- ở m/z = 153.0140, vậy VS3.1
cókhối lƣợng phân tử là 154 amu [phụ lục 2].
Phổ IR (KBr, max (cm-1) [phụ lục 1] cho thấy dao động của nhóm chức -OH tại 3231cm-1, dao động của nhóm chức CH vòng thơm tại 2927cm-1, dao động nhóm chức C=O tại 1691 cm-1, dao động nhóm C=C tại 1613 cm-1.
Phổ 1H-NMR [phụ lục 5] có 3 mũi của 3H có độ dịch chuyển hoá học từ 6.76 ppm đến 7.53 ppm tƣơng ứng với H của nhân thơm có 3 nhóm thế tại các vị trí 1,3,4. Vậy VS3.1 là một dẫn xuất của axit benzoic có 2 nhóm thế OH trên vòng.
H tại δ= 6.76:Ha mũi đôi (d) có hằng số ghép J=8 Hz (ghép gần 3 nối) H có δ= 7.47 : Hb mũi đôi đôi (dd) có hằng số ghép J=2 Hz và J=8 Hz H có δ= 7.53 : Hc mũi đôi (d) có hằng số ghép J=2 Hz (ghép qua 4 nối )
Từ các giá trị hằng số ghép cho thấy Ha ghép gần với Hc (Jac=8 Hz), Hb ghép xa với Hc (Jbc=2 Hz)
Phổ 13C- NMR [phụ lục 3] có 1 cacbon đặc trƣng cho nhóm axit cacboxylic với δC ở 167.62 ppm, 6 cacbon còn lại nằm ở vùng từ 115-150 ppm ứng với C của vòng benzen hoặc C anken.
Phổ HSQC [phụ lục 6] cho thấy 3C gắn với 3H, còn lại 4C tứ cấp.
(a) (b) (c) Hình 3.1: Hợp chất VS3.1
(a) Tƣơng quan HMBC của VS3.1 (b) Cấu trúc và giá trị phổ VS3.1 (c) Cấu trúc và giá trị phổ axit 3,4-dihidroxibenzoic.
Tra cứu phổ của hợp chất axit 3,4-dihidroxibenzoic [21] và so sánh với kết quả phổ của hợp chất VS3.1. Kết quả cho thấy, các giá trị δ, dạng mũi, J giữa của hợp chất VS3.1 và hợp chất axit3,4-dihidroxibenzoic có sự tƣơng đồng rất cao. Các giá trị đƣợc ghi nhận trong Bảng 3.5
Bảng 3.5: Giá trị δH của VS3.1 và hợp chất axit 3,4-dihidroxibenzoic H Axit 3,4-dihidroxibenzoic [21] VS3.1 δ, dạng mũi, J 7.41 (dd, J = 8,J =2 Hz ) 7.47 (dd, J =8,J = 2 Hz) 6.78 (d, J=8 Hz) 6.76 (d, J=8Hz) 7.40 (d, J =2 Hz) 7.53 (d, J =2 Hz)
Các kết quả thu đƣợc cũng cho thấy độ dịch chuyển trong phổ 13C của hợp chất VS3.1 hầu nhƣ tƣơng đồng với hợp chất axit 3,4-dihidroxibenzoic đã đƣợc công bố.
Bảng 3.6: So sánh độ dịch chuyển trong phổ 13C của hợp chất VS3.1 và hợp chất axit 3,4- dihidroxibenzoic.
Vị trí Axit 3,4-dihidroxibenzoic [21] VS3.1 Loại C
C1 122.4 123.1 tứ cấp C2 117.4 117.5 CH C3 145.6 145.6 tứ cấp C4 149.8 150.7 tứ cấp C5 116.2 115.7 CH C6 122.6 123.6 CH C7 170.4 167.6 tứ cấp
Sau khi so sánh, chúng tôi kết luận VS3.1 chính là axit 3,4-dihidroxibenzoic.
3.2.2 Hợp chất VS3.2
Tinh thể hình kim, không màu, tan tốt trong etyl axetat, metanol. Trên phổ MS xuất hiện mũi ion phân tử [M-H]-
ở m/z = 169.0177 vậy VS3.2 có khối lƣợng phân tử là 170 amu. [phụ lục 9]
Phổ IR (KBr, max (cm-1)[phụ lục 8]cho thấy dao động của nhóm chức-OH tại 3249 cm-1, nhóm chức COOH có hình dạng mũi bầu mở rộng từ 2500-3500 cm-1, dao động nhóm –C=O tại 1663 cm-1, dao động của nhóm C=C tại 1600 cm-1.
Phổ 1H-NMR [phụ lục 10] có 1 mũi của H có độ dịch chuyển hoá học 7.01 ppm tƣơng ứng với H của nhân thơm do đó VS3.2 cũng là một dẫn xuất của axit benzoic.
Phổ 13
C- NMR [phụ lục 11] có 1 cacbon đặc trƣng cho nhóm axit cacboxylic với δ = 167.64 ppm, 4 tín hiệu còn lại nằm ở vùng từ 110-150 ppm ứng với C của vòng benzen hoặc C anken.
Phổ HSQC [phụ lục 12] cho thấy có 2 nhóm CH còn lại là C tứ cấp
(a) (b) (c)
Hình 3.2: Hợp chất VS3.2
(a). Tƣơng quan HMBC của VS3.2 (b). Cấu trúc và giá trị phổ VS3.2 (c). Cấu trúc và giá trị phổ axit 3,4,5-trihidroxibenzoic. Tên gọi khác: axit gallic
Tiến hành so sánh phổ thực nghiệm của hợp chất VS3.2 với phổ của axit gallic [46] đã đƣợc công bố. Các giá trị δH và δC đƣợc thể hiện trong bảng 3.7 – 3.8
Bảng 3.7: Giá trị δC của axit gallic và hợp chất VS3.2:
Vị trí axit gallic D2O [46] VS3.2 CD3OD Loại C
C1 121.38 122.08 tứ cấp C2, C6 110.52 110.06 CH C3, C5 144.94 145.91 tứ cấp C4 135.93 138.50 tứ cấp C7 170.76 167.64 tứ cấp
Bảng 3.8: Giá trị δH của axit gallic và hợp chất VS3.2.
H VS3.2 axit gallic [46]
δ , dạng mũi 7.01, s 7.10, s
Kết quả cho thấy, phổ của hợp chất VS3.2 và phổ axit gallic gần nhƣ tƣơng đồng. Từ các dữ liệu ghi nhận được chúng tôi kết luận VS3.1 là axit 3,4,5- trihidroxibenzoic.
3.2.3 Hợp chất VS3.3
Phổ MS [phụ lục 15] xuất hiện mũi ion phân tử [M+Na]+ ở m/z = 647.1691, suy ra M = 624 tƣơng ứng với công thức phân tử C29H36O15.
Phổ IR [phụ lục 14] cho thấy dao động của nhóm OH tại 3342 cm-1, nhóm C-H vòng thơm tại 2936 cm-1, nhóm C=O tại 1699 cm-1 và C=C vòng thơm tại 1603 cm-1.
Phổ 13
C-NMR [phụ lục 17] kết hợp phổ DEPT [phụ lục 18] cho tín hiệu cộng hƣởng của 29 cacbon gồm 1 cacbon loại CH3, 3 cacbon loại CH2, 18 cacbon loại CH và 7 cacbon tứ cấp. Sự hiện diện của 2 cacbon anomer cộng hƣởng ở δC 103.18 ppm và 104.35 ppm cùng với 10 cacbon loại >CH-O của phân tử đƣờng trong vùng 82 - 70 ppm cho thấy hợp chất VS3.3 có hai phân tử đƣờng.
Phổ 13C-NMR còn thấy tín hiệu cộng hƣởng 12 cacbon của hai vòng thơm trong vùng 150 –115 ppm gồm 6 cacbon loại CH và 6 cacbon tứ cấp. Tín hiệu cộng hƣởng tại 168.3 ppm đặc trƣng cho cacbon C=O este; hai cacbon olefin cho tín hiệu cộng hƣởng ở 114.83 ppm và 148.18 ppm; ba nhóm CH2 cộng hƣởng tại 36.71, 62.51 và 72.49 ppm. Có thể dự đoán VS3.3 là một hợp chất phenyletanoid glycosid gồm một gốc phenyletyl, một gốc caffeoyl và phần đƣờng gồm một phân tử đƣờng rhamnose (δC anomer 103.18 ppm, δC 6’” 18.60 ppm), một đƣờng hexose (δC anomer 104.35 ppm, δC 6’ 62.51 ppm).
Phổ 1H-NMR [phụ lục 16] xác nhận có một phân tử đƣờng rhamnose nhờ tín hiệu cộng hƣởng của proton anomer ở 5.18 ppm (d, J=1.5Hz, 1H, H-1’”) và một
nhóm CH3 ở 1.08 ppm (d, J=6Hz, 3H, H-6”’); một phân tử đƣờng hexose qua tín hiệu của proton anomer tại δH 4.37 ppm (d, J=7.5Hz, 1H, H-1’).
Trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu cộng hƣởng của 6 proton trong vùng 7.05 – 6.55 ppm tƣơng ứng với proton của 2 nhân thơm có 3 nhóm thế tại các vị trí 1,3,4 nhƣ vậy VS3.3 là một dẫn xuất của benzen có hai nhóm thế OH.
Phổ 1H-NMR cũng cho thấy tín hiệu của hai proton olefin ghép cặp trans tại 6.27 ppm (d, J=16Hz, 1H, H-8”) và 7.58 ppm (d, J=16Hz, 1H, H-7”); tín hiệu cộng hƣởng của 4 proton ở δH 2.79 ppm (dt, J= 4.0Hz; 8Hz, 2H, H-7) và δH 3.72 ppm, 4.05 ppm (dd, J=16Hz; 8Hz, 2H, H-8) của nhóm -CH2-CH2-.
Phổ COSY [phụ lục 19] có tƣơng tác giữa proton H-2 với H-7; H-3 với H-10; H-4 với H-6 và H-8; H-5 với H-10 và H-12; H-6 với H-9; H-8 với H-13; H-11 với H-12 và H-14; H-15 với H-27; H-21 với H-16 và H-17; H-19 với H-20.
Phổ HSQC [phụ lục 20] cho tƣơng tác giữa cacbon và proton gắn trực tiếp với nhau. Phổ HMBC [phụ lục 21] có mối tƣơng quan giữa H-4’ với C-9” cho thấy nhóm este gắn với đƣờng hexose ở vị trí C-4’; giữa H-8 với C-1’ cho thấy nhóm phenyletyl gắn với đƣờng hexose ở vị trí C-1’; giữa H-1’” với C-3’ và giữa H-3’ với C-1’” cho thấy phân tử đƣờng rhamnose gắn với phân tử đƣờng hexose ở vị trí C-3’.
Các mối tƣơng quan HMBC trong hợp chất VS3.3 đƣợc thể hiện trong hình 3.3. Từ các dữ liệu trên, hợp chất VS3.3 đƣợc đề nghị là verbascosid. Dữ liệu phổ
1
H-NMR và 13C-NMR của hợp chất VS3.3 đƣợc so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất verbascosid [10],[40] (bảng 3.9 và 3.10).
Bảng 3.9: Bảng so sánh phổ 13C-NMR của hợp chất VS3.3 và verbascosid STT Vị trí δC (ppm) Loại C Verbascosid [10],[40] VS3.3 1 6’’’ 18.45 18.60 CH3 2 8 36.57 36.71 CH2 3 6’ 62.38 62.51 CH2 4 5’’’ 70.42 70.57 CH 5 4’ 70.62 70.62 CH 6 3’’’ 72.08 72.19 CH 7 2’’’ 72.25 72.41 CH 8 7 72.36 72.49 CH2 9 4’’’ 73.81 73.93 CH 10 5’ 76.06 76.18 CH 11 2’ 76.22 76.35 CH 12 3’ 81.64 81.80 CH 13 1’’’ 103.03 103.18 CH 14 1’ 104.22 104.35 CH 15 8’’ 114.73 114.83 CH 16 2’’ 115.25 115.36 CH 17 5’’ 116.32 116.45 CH 18 2 116.53 116.65 CH 19 5 117.12 117.25 CH 20 6 121.27 121.40 CH 21 6’’ 123.20 123.36 CH 22 1’’ 127.69 127.79 tứ cấp 23 1 131.50 131.60 tứ cấp 24 3 144.69 144.83 tứ cấp 25 4 146.14 146.28 tứ cấp 26 3’’ 146.88 146.99 tứ cấp 27 7’’ 148.01 148.16 CH 28 4’’ 149.79 149.95 tứ cấp 29 9’’ 168.29 168.44 tứ cấp
Bảng 3.10 : Bảng so sánh phổ 1H-NMR của hợp chất VS3.3 và verbascosid STT Vị trí Nhóm Verbascosid [10],[40] VS3.3 (ppm) J(Hz) (ppm) J(Hz) 1 6’’’ CH3 1.09d 6.2 1.08d 6.0 2 7 CH2 2.8t 7.3 2.79dt 4.0; 7.5 3 6’ CH2 3.65m 3.51m 3.62m 3.52m 4 3’’’ CH 3.55m 3.58m 5 4’ CH 4.92t 9.3 4.92m 6 4’’’ CH 3.60d 3.25 3.30m 7 8 CH2 3.70dd 4.06dd 12.9; 9.3 17.1; 7.5 3.72dd 4.05dd 16 ; 8 16 ; 8 8 2’’’ CH 3.92dd 1.8; 3.3 3.91dd 1.5 ;3 9 5’’’ CH 3.27d 6.17 3.56m 10 5’ CH 3.52d 1.93 3.54m 11 2’ CH 3.40d 8.4 3.39t 8.5 12 3’ CH 3.81t 9.2 3.81t 9.0 13 1’’’ CH 5.18d 1.8 5.18d 1.5 14 1’ CH 4.38d 7.8 4.37d 7.5 15 8’’ CH 6.27d 15.9 6.27d 15.5 16 2’’ CH 7.06d 2.1 7.05d 16 17 5’’ CH 6.77d 8.4 6.77d 8.5 18 2 CH 6.70d 2.1 6.69d 2.0 19 5 CH 6.68d 8.1 6.67d 8.0 20 6 CH 6.57dd 2.1; 8.1 6.56dd 2.0 ; 8.0 21 6’’ CH 6.96dd 2.1; 8.4 6.95dd 2.0 ; 8.0 22 1’’ C - - 23 1 C - -
24 4 C - - 25 3 C - - 26 3’’ C - - 27 7’’ CH 7.6d 15.9 7.58d 16.0 28 4’’ C - - - 29 9’’ C -
Kết quả so sánh trong bảng 3.9 và 3.10 cho thấy giá trị phổ 1H-NMR, 13C-NMR hoàn toàn tƣơng tự nhau. Từ các dữ liệu trên, hợp chất VS3.3 đƣợc xác định là verbascosid (hình 3.4).
(a)
(b)
Hình 3.4: Hợp chất VS3.3 (a) Cấu trúc của hợp chất VS3.3
3.2.4 Hoạt tính kháng oxi hóa của các hợp chất cô lập được
Sau khi cô lập và định danh đƣợc ba hợp chất chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH● của ba hợp chất này cùng với chất đối chứng dƣơng là quercetin. Kết quả sau khi xử lý đƣợc thể hiện trong bảng 3.11.
Từ bảng kết quả thu đƣợc chúng tôi nhận thấy, cả 3 chất đều có hoạt tính kháng oxi hoá mạnh với các giá trị IC50 (µM)lần lƣợt là 9.1; 4.8; 1.8 so với giá trị IC50 của chất chuẩn quercetin là 4.0, trong đó verbascosid có hoạt tính mạnh nhất.
Bảng 3.11: Phần trăm bẫy gốc tự do DPPH● của các hợp chất cô lập đƣợc từ cao EA. Nồng độ (µM) Hợp chất 1 2 5 10 IC50 (µM) Quercetin 12.2 ±4.4 22.8 ±5.3 63.7 ±4.3 95.1 ±0.8 4.0 VS3.1 ( Axit 3,4-dihidroxybenzoic) 7.4 ±2.2 14.1±5.8 31.7 ± 3.2 53.9±4.9 9.1 VS3.2 (Axit 3,4,5-trihidroxybenzoic) 9.7±4.9 16.2±3.5 51.7±5.7 82.6±5.3 4.8 VS3.3 (Verbascosid) 27.1±2.8 56.8±5.4 81.2±0.5 83.5±3.1 1.8
Hoạt tính mạnh của các hợp chất thu đƣợc có thể giải thích là do các hợp chất trên có cấu trúc polyphenol với 2 nhóm OH vị trí orto gắn trực tiếp vào vòng benzen nên có khả năng bẫy gốc tự do tốt qua cơ chế sau [34]:
Gốc tự do tạo thành sau khi phản ứng với DPPH● tạo đƣợc liên kết hidro với H của nhóm OH bên cạnh nên an định hơn. Số nhóm OH liền kề càng nhiều thì hoạt tính càng mạnh [31].
Ngoài vị trí và số nhóm OH trên nhân thơm, một số tác giả còn nghiên cứu thêm hoạt tính kháng oxi hoá của các dẫn xuất este của axit 3,4-dihidroxibenzoic và axit 3,4,5-trihidroxibenzoic[24] trong dung môi phân cực proton (metanol) và dung môi phân cực phi proton (aceton) cho thấy nhóm thế ankyl thay thế H của nhóm -COOH làm tăng hoạt tính kháng oxi hoá của hợp chất. Theo tác giả Kumaraswamy [33] thì axit gallic còn có tác dụng kháng viêm, chống lại quá trình lipoxygenase.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả thử hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH● của hai nhóm tác giả Marina Gálvez [36] và Bruno Reis [24] với IC50 của axit 3,4-dihidroxibenzoic, axit 3,4,5-trihidroxibenzoic và verbascosid lần lƣợt là 15.0 µM, 12.0 µM, 11.52 µM.
Trong ba hợp chất trên, verbascosid thể hiện hoạt tính kháng oxi hoá mạnh nhất (IC50=1.77 µM) trên khả năng bẫy gốc tự do DPPH●. Ngoài ra, verbascosid còn có hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng ung thƣ,…[10].
Sự hiện diện của ba hợp chất VS3.1, VS3.2 và VS3.3 trong cây vằng sẻ đã giải thích đƣợc phần nào công dụng của việc sử dụng loại dƣợc liệu này trong y học cổ truyền là có cơ sở khoa học.
3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN VIVO 3.3.1 Khảo sát nồng độ gây độc của CCl4 3.3.1 Khảo sát nồng độ gây độc của CCl4
Trong mô hình in vivo, chuột phải đƣợc gây độc bằng tác nhân CCl4 rồi sử dụng dƣợc liệu để khảo sát khả năng giải độc của dƣợc liệu nghiên cứu.
Để có đƣợc nồng độ gây độc tối ƣu của CCl4 đối với các lô chuột thí nghiệm, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các nồng độ của CCl4 nhƣ sau.
Chuột đƣợc chia 6 lô ứng với các nồng độ CCl4 (pha với dầu oliu) nhƣ sau: 100 %, 50 %, 30 %, 25 %, 20 % và 10 %.
Cho chuột uống thuốc sau 24 giờ, kết qua đƣợc ghi nhận trong Bảng 3.12
Kết quả trên cho thấy, CCl4 ở nồng độ 100 %, 50 % và 30 % không đạt yêu cầu về tỉ lệ sống, còn 20 % và 10 % thì tỉ lệ sống tốt nhƣng độc tính thể hiện không rõ. Riêng lô 25 % thì vừa đạt yêu cầu về tỉ lệ sống vừa thể hiện rõ độc tính nhƣ:
- Ngay sau khi gây độc: mắt lừ đừ, mệt lả, nằm im, chân tay co quắp, thở dốc. - 24 giờ sau khi gây độc: không có con nào chết.
Vì vậy, tất cả các thí nghiệm sàng lọc in vivo tiếp theo đều sử dụng lô chứng độc có nồng độ CCl4 là 25 %.
Bảng3.12: Kết quả khảo sát nồng độ gây độc của CCl4 đối với các lô chuột
Lô (% CCl4)
Tỉ lệ sống
(%) Biểu hiện nhiễm độc quan sát đƣợc
100% 0 Chết ngay sau khi uống
50% 33 Chết nhiều, nằm im, chân co quắp
30% 67 Chết nhiều, nằm im, chân co quắp, thở dốc
25% 100 mắt lừ đừ, mệt lả, nằm im, chân co quắp, thở dốc
20% 100 Không thể hiện rõ
10% 100 Không thể hiện rõ
3.3.2 Kết quả khảo sát khả năng bảo vệ gan của cao chiết etyl axetat
Cao chiết etyl axetat sau khi sàng lọc hoạt tính kháng oxi hóa bằng các phƣơng pháp bẫy gốc tự do DPPH• và ức chế gốc tự do NO• (in vitro), sau khi đánh giá kết quả và so sánh với chất chuẩn quercetin sẽ tiếp tục đƣợc thử nghiệm sàng lọc tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột nhiễm độc CCl4 (in vivo), nhằm đánh giá tác dụng hạ men gan. Kết quả khảo sát tác dụng hạ men gan của cao chiết etyl axetat tại các nồng độ khác nhau sau khi xử lý đƣợc thể hiện trong Bảng 3.13
Từ giá trị thu đƣợc trong bảng chúng tôi nhận thấy, hoạt lực trung bình của các lô trắng tại các nồng độ 0,1 mg/mL và 0,05 mg/mL là 171,6. Trong khi đó, độc tính
của các lô độc tại các nồng độ này là 1797,4 cao gấp 10.47 lần lô trắng. Điều này chứng tỏ chuột bị nhiễm độc rất mạnh với CCl4.
Khi tiến hành khảo sát với chất chuẩn silymarin, giá trị hoạt lực trung bình của các lô này tăng khi nồng độ khảo sát giảm từ 0,5 mg/mL đến 0,05 mg/mL và sau đó hoạt lực giảm khi nồng độ thử nghiệm nhỏ hơn 0,01 mg/mL. Giá trị hoạt lực thu đƣợc tại các nồng độ này là 499,4 và 435,6. Khi tính toán tỉ lệ giảm so với các lô độc, kết quả cho thấy tỉ lệ giảm là 3.6 và 4.1, giảm rất nhiều so với lô trắng, điều này chứng tỏ tác dụng hạ men gan của silymarin là rất tốt.
Bảng 3.13: Tác dụng hạ men gan của cao etyl axetat và chất chuẩn silymarin :
Nồng độ (mg/mL) Lô thử nghiệm 0,5 0,1 0,05 0,01 Lđ 246.8 1797.4 1797.4 847,0 ALTTB Lo 5.1 171.6 171.6 72.6 L* 103.4 499.4 435.6 402.6 L 167.2 723.8 561,0 493.7 Lđ/L* 2.4 3.6 4.1 2.1