Trong mô hình in vivo, chuột phải đƣợc gây độc bằng tác nhân CCl4 rồi sử dụng dƣợc liệu để khảo sát khả năng giải độc của dƣợc liệu nghiên cứu.
Để có đƣợc nồng độ gây độc tối ƣu của CCl4 đối với các lô chuột thí nghiệm, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các nồng độ của CCl4 nhƣ sau.
Chuột đƣợc chia 6 lô ứng với các nồng độ CCl4 (pha với dầu oliu) nhƣ sau: 100 %, 50 %, 30 %, 25 %, 20 % và 10 %.
Cho chuột uống thuốc sau 24 giờ, kết qua đƣợc ghi nhận trong Bảng 3.12
Kết quả trên cho thấy, CCl4 ở nồng độ 100 %, 50 % và 30 % không đạt yêu cầu về tỉ lệ sống, còn 20 % và 10 % thì tỉ lệ sống tốt nhƣng độc tính thể hiện không rõ. Riêng lô 25 % thì vừa đạt yêu cầu về tỉ lệ sống vừa thể hiện rõ độc tính nhƣ:
- Ngay sau khi gây độc: mắt lừ đừ, mệt lả, nằm im, chân tay co quắp, thở dốc. - 24 giờ sau khi gây độc: không có con nào chết.
Vì vậy, tất cả các thí nghiệm sàng lọc in vivo tiếp theo đều sử dụng lô chứng độc có nồng độ CCl4 là 25 %.
Bảng3.12: Kết quả khảo sát nồng độ gây độc của CCl4 đối với các lô chuột
Lô (% CCl4)
Tỉ lệ sống
(%) Biểu hiện nhiễm độc quan sát đƣợc
100% 0 Chết ngay sau khi uống
50% 33 Chết nhiều, nằm im, chân co quắp
30% 67 Chết nhiều, nằm im, chân co quắp, thở dốc
25% 100 mắt lừ đừ, mệt lả, nằm im, chân co quắp, thở dốc
20% 100 Không thể hiện rõ
10% 100 Không thể hiện rõ
3.3.2 Kết quả khảo sát khả năng bảo vệ gan của cao chiết etyl axetat
Cao chiết etyl axetat sau khi sàng lọc hoạt tính kháng oxi hóa bằng các phƣơng pháp bẫy gốc tự do DPPH• và ức chế gốc tự do NO• (in vitro), sau khi đánh giá kết quả và so sánh với chất chuẩn quercetin sẽ tiếp tục đƣợc thử nghiệm sàng lọc tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột nhiễm độc CCl4 (in vivo), nhằm đánh giá tác dụng hạ men gan. Kết quả khảo sát tác dụng hạ men gan của cao chiết etyl axetat tại các nồng độ khác nhau sau khi xử lý đƣợc thể hiện trong Bảng 3.13
Từ giá trị thu đƣợc trong bảng chúng tôi nhận thấy, hoạt lực trung bình của các lô trắng tại các nồng độ 0,1 mg/mL và 0,05 mg/mL là 171,6. Trong khi đó, độc tính
của các lô độc tại các nồng độ này là 1797,4 cao gấp 10.47 lần lô trắng. Điều này chứng tỏ chuột bị nhiễm độc rất mạnh với CCl4.
Khi tiến hành khảo sát với chất chuẩn silymarin, giá trị hoạt lực trung bình của các lô này tăng khi nồng độ khảo sát giảm từ 0,5 mg/mL đến 0,05 mg/mL và sau đó hoạt lực giảm khi nồng độ thử nghiệm nhỏ hơn 0,01 mg/mL. Giá trị hoạt lực thu đƣợc tại các nồng độ này là 499,4 và 435,6. Khi tính toán tỉ lệ giảm so với các lô độc, kết quả cho thấy tỉ lệ giảm là 3.6 và 4.1, giảm rất nhiều so với lô trắng, điều này chứng tỏ tác dụng hạ men gan của silymarin là rất tốt.
Bảng 3.13: Tác dụng hạ men gan của cao etyl axetat và chất chuẩn silymarin :
Nồng độ (mg/mL) Lô thử nghiệm 0,5 0,1 0,05 0,01 Lđ 246.8 1797.4 1797.4 847,0 ALTTB Lo 5.1 171.6 171.6 72.6 L* 103.4 499.4 435.6 402.6 L 167.2 723.8 561,0 493.7 Lđ/L* 2.4 3.6 4.1 2.1 Lđ/L 1.5 2.5 3.2 1.7
Lđ: lô độc L0: lô trắng L*: lô chuẩn L: lô mẫu
Với chất thử nghiệm là cao chiết EA, hoạt lực trung bình tăng khi nồng độ thử nghiệm giảm dần từ 0,5 mg/mL đến 0,05 mg/mL, và sau đó hoạt lực giảm khi nồng độ thử nghiệm nhỏ hơn 0,01 mg/mL. Giá trị hoạt lực thu đƣợc đều cao hơn so với chất chuẩn là silymarin và đạt cao nhất tại nồng độ 0,1 mg/mL. Tuy nhiên khi tính toán tỉ lệ giảm so với lô độc, tỉ lệ giảm đạt giá trị cao nhất tại nồng độ 0,05 mg/mL, điều này chứng tỏ, tại nồng độ này, khả năng làm hạ men gan của cao etyl axetat là tốt nhất với tỉ lệ giảm là 3.2, nhỏ hơn khoảng 1 lần so với tỉ lệ giảm của chất chuẩn là 4.1. Điều này có thể khẳng định tác dụng làm hạ men gan của cao chiết cây vằng sẻ là rất lớn, rất khả quan trong việc bào chế dƣợc phẩm chữa bệnh, giải độc gan.
Khi tính toán quy đổi nồng độ thử nghiệm thành liều dùng của cây vằng sẻ, tại nồng độ tốt nhất (0,05mg/ml) liều dùng dƣợc liệu tƣơng ứng là 0,12g dƣợc liệu (2,5mg cao chiết)/1kg chuột hay tƣơng đƣơng 0,05 mg cao chiết/1 con chuột nặng 20g.
Khi tiến hành so sánh tác dụng hạ men của cao chiết thử nghiệm với tác dụng của cao chiết Diệp hạ châu ở cùng nồng độ 0,05 mg/mL theo kết quả của một nghiên cứu trƣớc đây [16] cũng cho thấy, tác dụng tốt nhất tại liều dùng là 1g dƣợc liệu (tƣơng đƣơng 287mg cao chiết)/1kg chuột hay tƣơng đƣơng 5,74 mg cao chiết/1 con chuột nặng 20g [16]. Kết quả này cho thấy, cao chiết của cây vằng sẻ có tác dụng giải độc gan tốt hơn cao chiết từ cây diệp hạ châu. Tuy nhiên, phải tiến hành đồng thời việc trích ly các cao của 2 loại cây này trong cùng điều kiện, cùng phƣơng pháp và tiến hành thử hoạt tính hạ men gan của các cao chiết của 2 loại cây này cùng lúc mới có thể so sánh và cho ra kết quả chính xác nhất.
CHƢƠNG 4:
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 KẾT LUẬN
Trong nội dung thực hiên đề tài này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu trích ly các cao chiết và khảo sát hoạt tính sinh học của các cao từ cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume. Sau khi có đƣợc các kết quả về hoạt tính sinh học của các cao chiết cũng nhƣ các phân đoạn, chúng tôi tiếp tục tiến hành cô lập, định danh các chất trong các phân đoạn của cây vằng sẻ. Từ đó, tiếp tục thử hoạt tính sinh học của các chất đã thu đƣợc để khẳng định tác dụng của các cao chiết, góp phần vào việc tạo ra các sản phẩm, dƣợc phẩm giải độc gan từ cây vằng sẻ. Sau một thời gian thực hiện, chúng tôi đi đến các kết luận sau:
Chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp trích ly lỏng – lỏng. Bƣớc đầu đã trích ly đƣợc 5 loại cao chiết: ete dầu, cloroform, etyl axetat, butanol và nhựa; với khối lƣợng (g) tƣơng ứng: 12.4; 42.8; 63.3; 55.9; 233.6;
Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa các cao chiết bằng các phƣơng pháp bẫy gốc tự do DPPH• và khả năng ức chế gốc tự do NO. Kết quả thu đƣợc cho thấy, cao etyl axetat có tác dụng tốt nhất, khả năng ức chế mạnh cả trên đối tƣợng gốc tự do DPPH lẫn gốc tự do NO. Ở nồng độ 100 µg/ml, phần trăm bẫy gốc tự do DPPH· đạt 95.8% và phần trăm ức chế gốc tự do NO·
là 59.1% tại nồng độ 200 µg/ml. Các giá trị IC50 lần lƣợt là 8.2 µg/ml và 80.7 µg/ml.
Tiến hành tách các phân đoạn từ cao etyl axetat bằng các phƣơng pháp sắc kí cột và sắc kí bản mỏng với các hệ dung môi thích hợp, kết quả thu đƣợc 8 phân đoạn từ phân đoạn VS1 đến VS8. Khảo sát hoạt tính của các phân đoạn này bằng các phƣơng pháp nhƣ đã khảo sát với các cao chiết ban đầu, kết quả thu đƣợc cho thấy, phân đoạn VS3 có hoạt tính cao trên cả hai phƣơng pháp bẫy gốc tự do DPPH· và ức chế gốc tự do NO·, với giá trị IC50 lần lƣợt là 7.1 µg/ml; 72.9 µg/ml và có khối lƣợng nhiều nhất.
Sử dụng các phƣơng pháp phổ nghiệm nhƣ IR, MS, 1D-NMR và 2D-NMR để xác định cấu trúc, nhận danh các hợp chất có trong phân đoạn VS3. Kết quả thu
đƣợc 3 hợp chất tinh khiết bao gồm: VS3.1 (axit 3,4-dihidroxibenzoic; tên gọi khác axit protocatechuic), VS3.2 (axit 3,4,5-trihidroxibenzoic; tên gọi khác: axit gallic) và VS3.3 làverbascosid.
Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các hợp chất thu đƣợc bằng phƣơng pháp bẫy gốc tự do DPPH• cho thấy, cả 3 hợp chất ( axit 3,4-dihidroxibenzoic; axit 3,4,5- trihidroxibenzoic; verbascosid) đều có hoạt tính kháng oxi hoá mạnh, tại nồng độ 10 µM phần trăm bẫy gốc tự do lần lƣợt đạt: 53.9%; 82.6%; 83.5% và các giá trị IC50 (µM) tƣơng ứng là 9.1; 4.8; 1.8 so với chất chuẩn quercetin là 4.0. Trong đó, verbascosid có hoạt tính kháng oxi hoá mạnh nhất.
Cao chiết etyl acetat sau khi đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phƣơng pháp bẫy gốc tự do DPPH• và khả năng ức chế gốc tự do NO (in vitro), tiếp tục đƣợc khảo sát khả năng hạ men gan trên mô hình chuột nhiễm độc CCl4 (in
Axit 3,4-dihidroxibenzoic Axit 3,4,5-trihidroxibenzoic
vivo). Kết quả thu đƣợc cho thấy, tác dụng hạ men gan của cao chiết này rất tốt, tỷ lệ hạ men gan sau 24 h tại nồng độ 0,05 mg/mL cao nhất, với giá trị tỉ lệ giảm là
3,2 so với chất chuẩn silymarin là 4,1.
Sau khi khảo sát đƣợc nồng độ có tác dụng hạ men gan tốt nhất của cao chiết, chúng tôi đã tính toán đƣợc liều dùng: 0,12g dƣợc liệu (2,5mg cao chiết)/1kg chuột hay tƣơng đƣơng 0,05mg cao chiết/1 con chuột nặng 20g, từ đó có thể tính toán đƣợc liều dùng thích hợp với con ngƣời trong quá trình sử dụng cây thuốc này.
So sánh với liều dùng của cao chiết từ cây diệp hạ châu khi khảo sát ở nồng độ tƣơng tự là 1g dƣợc liệu (tƣơng đƣơng 287mg cao chiết)/1kg chuột hay tƣơng đƣơng 5,74 mg cao chiết/1 con chuột nặng 20g cho thấy, tác dụng của cao chiết etyl axetat là tốt hợn.
Các kết quả khảo sát về tác dụng dƣợc lý cho thấy vằng sẻ có thể là nguồn dƣợc liệu để làm thuốc phòng bệnh, chống oxi hóa và giải độc gan.
4.2 ĐỀ NGHỊ
Từ kết quả thu đƣợc khi khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết từ cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume., chúng tôi nhận thấy cao chiết etyl axetat có hoạt tính kháng oxi hóa, giải độc gan rất tốt. Do đó chúng tôi có các đề nghị nhƣ sau:
Cao chiết etyl axetat có tác dụng kháng oxi hóa, giải độc gan rất tốt, do đó nên đƣa vào ứng dụng trong thực tế, tạo ra các loại thực phẩm dƣới dạng trà uống hòa tan, hoặc bào chế dƣới dạng thuốc để giải độc cho cơ thể trong bối cảnh các loại thực phẩm sử dụng ngày càng bị nhiễm độc bởi các hóa chất sử dụng trong nông nghiệp, và sự ô nhiễm môi trƣờng.
Thực hiện triển khai trồng đại trà cây vằng sẻ để có thể sử dụng trực tiếp cây và là nguồn nguyên liệu cho các nhà sản xuất chế phẩm trà uống hòa tan, túi lọc hoặc hãng bào chế thuốc, dƣợc phẩm.
Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Đoàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật.
[2]. Võ Văn Chi (1999), Từ điển Cây thuốc Việt Nam, NXB Y Học.
[3]. Lê Hoàng Chứa (2008), Khảo sát hoạt tính sinh học và thành phần hóa học cao acetate etyl cây vằng sẻ - Jasminum subtriplinerve Blume., Khóa luận tốt nghiệp, Bộ môn Hóa lý, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên Tp HCM.
[4]. Đỗ Thị Hạ (2008), Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa của một số dược thảo Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp, Bộ môn Hóa lí, Khoa Hóa, Trường ĐH KHTN Tp HCM.
[5]. Nguyễn Thi Phương Hạnh (2009), Khảo sát hoạt tính của cây Nghể Polygonum TomemTosum Willd. trên mô hình gan chuột nhắt trắng bị nhiễm độc CCl4, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Khoa Học Ứng Dụng, Trường Đại học Tôn Đức Thắng Tp HCM.
[6]. Nguyễn Thị Ninh Hải, Nguyễn Văn Bàn, Đoàn Thị Nhu, Lê Thu Thủy (1984), ―Bước đầu nghiên cứu hoá học và thử tác dụng sinh vật các nhóm hoạt chất cây chè vằng”, Tạp chí dược học, (6), trang 16-17.
[7]. Nguyễn Thị Ninh Hải (1986), Góp phần nghiên cứu một số tác dụng sinh học của cây Chè vằng, Luận án Phó tiến sĩ Dược học, Viện Dược Liệu.
[8]. Nguyễn Thị Hồng Hương, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Trịnh Văn Quỳ, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2007), ―Góp phần nghiên cứu các flavonoid trong cây chè vằng Jasminum subtriplinerve Blume.”, Tạp chí Dược học, (11), trang 29-32.
[9]. Nguyễn Thị Hồng Hương, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Trịnh Văn Quỳ (2008), ―Định lượng một số hợp chất phenolic trong Jasminum subtriplinerve Blume bằng HPLC‖, Tạp chí dược học, (389), trang 16-19.
Tạp chí dược học, (2), trang 36-39.
[11]. Nguyễn Thị Hồng Hương, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Trịnh Văn Quỳ, Hoàng Thái Phượng Các (2008), “Định lượng một số flavonoid và phenylethanoid glycoside trong cây chè vằng bằng phương pháp điện di mao quản”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, (3), trang 10-15.
[12]. Trần Tuấn Kiệt (2009), Khảo sát hoạt tính sinh học và thành phần hóa học cao acetate etyl cây vằng sẻ - Jasminum subtriplinerve Blume., Khóa luận tốt nghiệp, Bộ môn Hóa lý, Khóa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên Tp HCM.
[13]. Đỗ Tất Lợi (1995), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
[14]. Đái Huệ Ngân (2008), Khảo sát sơ bộ hoạt tính sinh học và thành phần hoá học cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume, Luận văn thạc sĩ hoá học, Bộ môn Hóa lí, Khoa Hóa, Trường ĐH KHTN Tp HCM.
[15]. Lê Quý Ngưu, Trần Như Đức (1995), Thuốc trị bệnh từ cây cỏ hoang dại,
NXB Thuận Hóa, Huế.
[16]. Huỳnh Ngọc Thụy (2008), Nghiên cứu dược liệu Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum., Luận án Tiến sĩ Dược học, Khoa Dược, Đại học Y – Dược Tp Hồ Chí Minh.
[17]. Võ Thị Ngọc Sơn (1984), ―Tác dụng kháng sinh của chè vằng‖, Tạp chí dược học, (2), trang 18-21.
Tiếng Anh
[18]. C. Andary, R. Wylde, C. Laffite, G. Privat, F. Winternitz (1982), ―Structure of verbascoside and orobanchoside, caffeic acid sugar esters from Orobanche rapum-genistae”, Phytochemistry, (21), page 1123-1127.
for drug development”.
[21] AZIZUDDIN, Talat MAKHMOOR, Muhammad Iqbal CHOUDHARY (2010), ―Radical scavenging potential of compounds isolated fromVitexagnus-castus”,
Turk Journal of Chemistry, (34), page 119–126.
[22]. Biswajit Podder, Yong-Sik Kim, Tamanna Zerin, Ho-Yeon Song ( 2010), ― Antioxidant effects of silymarin on paraquat-induced human lung adenocarcinoma A549 cell line‖, Food and chemical Toxicology, (50), page 3206-3214.
[23]. Fernando A. Crocenzi, Enrique J. Sanschez Pozzi, José M. Pellegrino, Emilio A. Rodríguez Garay, Aldo D. Mottino, Marcelo G. Roma ( 2003), ― Preventive effects of silymarin against taurolithocholate-induced cholestasis in the rat‖,
Biochemical Pharmacology, (66), page 355-364.
[24]. Bruno Reis, Marta Martins, Barbara Barreto, Nuno Milhazes, E. Manuela Garrido, Paulo Silva (2010), ―Structure – Property – Activity Relationship of Phenolic Acids and Derivatives Protocatechuic Acid Alkyl Esters‖, Journal of Agricultural and Food Chemistry, (58), page 6986−6993.
[25]. Fariba Alidoost, Marjan Gharagozloo, Bahram Bagherpour, Abbas Jafarian, Seyed Ebrahim Sajjadi, Hamid Hourfar, Behjat Moayedi (2006), ―Effects of silymarin on the proliferation and glutathione levels of peripheral blood mononuclear cells from β-thalassemia major patients‖, International Immunopharmacology, (6), page 1305-1310.
[26]. F. Galhardi, K. Mesquita, J.M. Monserrat, D.M. Barros (2009), ― Effects of silymarin on biochemical parameters of oxidative stress in aged and young rat brain‖, Food and chemical Toxicology, (47), page 2655-2660.
[27]. Ghanshyam Upadhyay, Abhai Kumar, Mahendra Pratap Singh (2007), ― Effects of silymarin on pyrogallol- and rifampicin-induced hepatotoxicity in mouse‖,
10(11), page 1035–1038.
[29]. Hui-Mei-Lin, Hsien-Chun Tseng, Chau-Jong Wang, Jin-Jin Lin, Chia-Wen Lo, Fen-Pi Chou (2008), ―Hepatoprotective effects of Solanum nigrum lin extract against CCl4-iduced oxidative damage in rats‖, Chemico-biological Interactions,
(171), page 283-293.
[30]. P.Ionita (2005), ―Is DPPH Stable Free Radical a Good Scavenger for Oxygen Active Species?”, Chemical Papers. 59(1), page 11—16.
[31]. Jun Kawabata, Yasuko Okamoto, Asuka Kodamo (2002), ―Oxidative Dimers Produced from Protocatechuic and Gallic Esters in the DPPH Radical Scavenging Reaction” Journal of Agricultural and Food Chemistry, (50), page 5468−5471. [32]. Kraus W., Ngoc L.H, Conrad J., Klaiber I., Reeb S., Vogler B. (2002),
―Investigation of biologically active natural products using oline LC-bioassay, LC-NMR, and LC-MS techniques”, Phytochemstry Reviews, page 409-411. [33]. Kumaraswamy, Raghavendra, Satish (2010), ―Antioxidant and anti-
inflammatory activity of isolated phytoconstituent from Woodfordia fructicosa
Kurz‖, Journal of Pharmacy Research, 3(7), page 1492-1495.
[34]. J.J.Lu , Y.Wei , Q.P.Yuan (2007), ―Preparative separation of gallic acid from Chinese traditional medicine by high-speed counter-current chromatography and followed by preparative liquid chromatography”, Separation and Purification Technology (55), page 40–43.
[35]. H. Malekinejad, A. Rezabakhsh, F. Rahmani, R. Hobbenaghi (2012), ― Silymarin regulates the cytochrome P450 3A2 and glutathione peroxides in the
liver of streptozotocine-induced diabetic rats‖, Phytomedicine, (19), page 583- 590.
[36]. Marina Galvéz, Carmen Martín – Cordero, Peter J.Houghton (2005), ―Antioxidant Activity of Methanol Extracts Obtained from Plantago Species‖, Journal of Agricultural and Food Chemistry, (53), page 1927−1933.
hydrocarbon receptor activation‖, Toxicology, (215), page 80-89.
[38]. Dai Hue Ngan ,Ho Thi Cam Hoai , Le Mai Huong, Poul Erik Hansen and Ole Vang (2008), ―Bioactivities and chemical constituents of a Vietnamese medicinal plant CheVang, Jasminum subtriplinerve Blume(Oleaceae)‖, Natural Product Research, 22(11), page 942–949.
[39]. Nirav Patel, Cecil Joseph, George B. Corcoran, Sidhartha D. Ray (2010), ― Silymarin modulates doxorubicin-induced oxidative stress, Bcl-xL and p53 expression while preventing apoptotic and necrotic cell death in the liver‖,
Toxicology and Applied Pharmocology, (245), page 143-152.
[40]. Lotfy D. Ismail, Mohamed M. El-Azizi, Taha I. Khalifa, Frank R. Stermitz