Khảo sát hoạt tính sinh học của các cao và các phân đoạn

Một phần của tài liệu Khảo sát hóa học phân đoạn có tác dụng bảo vệ gan của cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume. (Trang 35 - 41)

N m cao trích ly từ cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume được đem thử hoạt tính kháng oxi hoá bằng hai phương pháp bẫy gốc tự do DPPH và phương pháp c ch gốc tự do NO, nhằm phục vụ cho các thí nghiệm ti p theo.

2.2.2.1 Khảo sát khả năng bẫy gốc tự do DPPH

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ trích ly các cao từ nguyên liệu vằng sẻ

Dịch trích etanol + H2O (1:4)

Xử lý qua than hoạt tính,

+ 4 lần thể tích nước cất, làm lạnh, lọc Dịch B R n A + Ed Dịch C Dịch cloroform Dịch etanol +EA Dịch etyl axetat Dịch etanol + BuOH Dịch butanol Dịch etanol

Cành lá vằng sẻ khô xay nhuyễn (2.68 kg)

Ngâm etanol (12.0 L x 3 lần x 24 giờ), cô còn 1 L

Lắc với MgSO4.7H2O, lọc, cô quay

Dịch ete dầu

Cao ete dầu 12,4g

+ CHCl3

Cao etyl axetat 63,3g

Cao butanol 55,9g

Cao cloroform 42,8g

Phƣơng pháp thử hoạt tính bẫy gốc tự do

DPPH [31]

N m 1922, Goldschmidt và Renn [19] đ phát hiện ra một gốc tự do bền c màu tím đậm, không bị phân huỷ hay trùng hoá và cũng không phản ng v i oxi là gốc tự do 

DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl). Gốc tự do này không tan trong nư c, tan trong dung môi h u cơ, c bư c s ng h p thu cực đại 517nm.

Các ch t c khả n ng kháng oxi hoá s trung hoà hay bao vây các gốc tự do 

DPPH tạo thành DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine) có màu vàng cam.

DPPH Ch t kháng oxi h a DPPH

Quá trình này làm giảm nồng độ của các gốc tự do 

DPPH cũng như giảm độ h p thu tại bư c s ng cực đại, màu dung dịch phản ng nhạt dần (từ tím sang vàng nhạt). Hoạt tính kháng oxi h a được đánh giá qua giá trị mật độ quang của mẫu thí nghiệm so v i mẫu đối ch ng [30],[41],[49].

Chuẩn bị hóa chất

Pha dung dịch DPPH• 100 µM: Cân chính xác 3.94 mg DPPH, pha trong bình định m c 100 ml bằng etanol được dung dịch DPPH

100 µM (được gọi là dung dịch làm việc).

Pha mẫu thử: Dung dịch làm việc của mẫu cao có nồng độ 500 µg.mL-1.

Đ khảo sát hoạt tính của các cao, ban đầu chúng tôi pha các mẫu thử và mẫu so sánh ở các nồng độ khác nhau. Mẫu thử và mẫu so sánh được pha theo bảng 2.4:

Bảng 2.2: Tỉ lệ pha mẫu thử và mẫu so sánh ở các nồng độ khác nhau C (µg.mL-1) Mẫu so sánh 100 50 25 10 5 2 1 V1 (μL) 0 600 300 150 60 150 60 30 V2 (μL) 1500 900 1200 1350 1440 1350 1440 1470 V (μL) 1500 V1: th tích mẫu; V2: th tích etanol; V: th tích DPPH•

Tương ng v i m i nồng độ mẫu thử, chuẩn bị một mẫu tr ng. Mẫu tr ng tương tự như mẫu thử nhưng thay VDPPH bằng Vetanol.

Nh ng mẫu c hoạt tính mạnh, phần tr m c ch trên 50  ở nồng độ 10 µg.mL-1, ti p tục được ti n hành thử ở các nồng độ th p hơn, v i các nồng độ tương ng: 5, 2 và 1 µg.mL-1. Khi đ sử dụng mẫu làm việc c nồng độ 100 µg.mL-1.

Đo mẫu

Quy trình thử hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH• được t m t t trong sơ đồ 2.2

V1L mẫu V2L etanol  Thêm 1500 L DPPH (100 M)  Ủ trong b ng tối 30 phút 1500 L dung dịch mẫu Dung dịch sau ủ Đo quang ở 517 nm

Các mẫu thử được pha ở các nồng độ khác nhau v i th tích 1500 μL, sau đ thêm 1500 L DPPH (100 M) và ủ trong b ng tối 30 phút gọi là dung dịch ủ, sau đ ti n hành đo quang ở bư c s ng 517 nm.

Xác định hoạt tính kháng oxi hóa và tính giá trị IC50

Hoạt tính kháng oxi hoá được tính dựa trên phần tr m c ch (I ): I () = Ac - As

Ac  100  Trong đ :

Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control). As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu cao (sample).

 Mẫu ch ng dương: thay V1 µL mẫu cao V2 µL dung dịch DPPH●.

 Mẫu tr ng: được chuẩn bị tương tự mẫu cao nhưng VDPPH được thay bằng Vetanol

M i mẫu ban đầu được thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µg.mL-1. M i nồng độ được ti n hành 3 lần. L y trung bình giá trị phần tr m của 3 lần thử m i mẫu đ s xác định được giá trị phần tr m c ch ng v i từng nồng độ khảo sát.

N u mẫu thử có hoạt tính mạnh, giá trị phần tr m c ch trên 50 , mẫu s được thử ti p ở các nồng độ th p hơn 10, 5, 2, 1 µg.mL-1 đ tìm ra giá trị IC50.

 Xác định giá trị IC50:

IC50 là một giá trị dùng đ đánh giá khả n ng c ch mạnh hay y u của các mẫu cao. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đ n c th c ch 50 % gốc tự do hoặc enzym. Giá trị IC50 càng th p là mẫu có hoạt tính mạnh.

 Cách xác định IC50:

 Ti n hành khảo sát tác dụng của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.

 V i nh ng mẫu c hoạt tính bi n thiên tuy n tính v i nồng độ, s thu được một đường thẳng y = ax + b qua t t cả các đi m (v i y là  c ch và x là nồng độ).

 V i nh ng mẫu c hoạt tính không bi n thiên tuy n tính v i nồng độ, một cách gần đúng, chọn 2 nồng độ c ch trên và dư i 50 , ti n hành v đường thẳng y = ax + b s thu được phương trình y = ax + b v i 2 hệ số a, b đ bi t.

 Thay y = 50  vào phương trình s thu được giá trị x. Đ chính là nồng độ c ch được 50  gốc tự do (IC50).

 M i nồng độ được thực hiện 3 lần, thu được 3 giá trị phần tr m. Giá trị phần tr m c ch là trung bình của 3 lần thực hiện.

2.2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế gốc tự do NO●

Phƣơng pháp ức chế gốc tự do Nitric oxid (NO●)

Dư i ánh sáng natri nitroprussid dễ dàng bị phân hủy tạo ra NO●. Trong dung dịch nư c, NO●

sinh ra phản ng v i oxi tạo ra sản phẩm bền v ng là nitrit và nitrat. Khi trong mẫu c hoạt ch t c ch NO●

s làm giảm nồng độ nitrit tạo thành trong dung dịch. Khả n ng c ch gốc tự do NO●

của mẫu được tính toán dựa trên sự giảm hàm lượng nitrit tạo thành của mẫu c ch t c ch NO●

so v i mẫu không có ch t c ch NO● (mẫu control).

Hàm lượng nitrit tạo thành trong dung dịch nư c được xác định bằng phương pháp tr c quang sử dụng thuốc thử Greiss. Nitrit phản ng v i thuốc thử Greiss tạo thành hợp ch t màu diazo bền h p thu ở bư c s ng cực đại 540 nm.

Chuẩn bị hóa chất

Đệm photphat pH = 7.4: Hòa tan 2.72 g muối NaH2PO4 và 7.16 g muối Na2HPO4.12H2Otrong 1000 mL nư c c t 2 lần. Dùng NaOH và H3PO4 điều chỉnh pH đ n 7.4 bằng máy pH.

Dung dịch natri nitroprussid 10 mM: Cân chính xác 0.149 g natri nitroprussid hòa tan trong đệm photphat pH = 7.4, sử dụng bình định m c

50 mL. Dung dịch này được pha ngay trư c khi ti n hành phản ng, đựng trong chai tối màu và gi trong b ng tối trư c khi ti n hành thí nghiệm.

Thuốc thử Greiss: Bao gồm hai dung dịch A và B

- Dung dịch A (Sulfanilamid 2% trong H3PO4 4%): Cân khoảng 2g Sulfanilamid hòa tan thành 100 mL bằng dung dịch H3PO4 4 %.

- Dung dịch B (N-1-naphtyletylendiamin 0.2 %): Cân khoảng 0.2 mg N-1- naphtyletylendiamin hòa tan thành 100 mL bằng nư c c t hai lần.

Cả hai dung dịch A và B đều được đựng trong chai tối màu và bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch A và B được trộn chung cùng tỉ lệ trư c khi thí nghiệm.

Chuẩn bị mẫu cao

Cân khoảng 1.80 - 1.90 mg ng v i m i loại cao. Pha trong típ nhựa 2 mL bằng đệm photphat pH = 7.4 đ c nồng độ gốc là 1000 µg.mL-1. Nồng độ các mẫu thử là 200, 100, 50 và 25 µg.mL-1.

Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO●

Quy trình thử hoạt tính c ch gốc tự do NO● được t m t t trong sơ đồ 2.3

Sơ đồ 2.3: Quy trình thử hoạt tính c ch gốc tự do NO●

V1 (L) mẫu

V2 (L) đệm photphat pH = 7.4

750 L natri nitroprussid 10 mM

1500 L mẫu

Mẫu sau khi ủ

Đo quang ở 540 nm ủ 180 phút, 250 C 1. Thêm 1500 L Greiss 2. để 15 phút +

Các mẫu cao sau khi được pha như phần chuẩn bị s được thêm 750 L natri nitroprussid 10 mM thành dung dịch c th tích 1500 L, sau đ ủ ở 250C trong 180 phút, mẫu sau khi ủ s được thêm ti p 1500 L thuốc thử Greiss đ thêm 15 phút rồi ti n hành đo quang ở bư c s ng 540 nm.

Xác định khả năng ức chế gốc tự do NO● và giá trị IC50

Khả n ng c ch gốc tự do NO● cũng được tính thông qua phần tr m c ch (I %):

I () = Ac - As

Ac  100 

Với Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control) As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu cao (sample)

Mẫu control: thay V1 (µL) mẫu cao bằng đệm photphat pH = 7.4

Xác định giá trị IC50 : tương tự như trong phương pháp bẫy gốc tự do DPPH●.

Một phần của tài liệu Khảo sát hóa học phân đoạn có tác dụng bảo vệ gan của cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume. (Trang 35 - 41)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(81 trang)