N m cao trích ly từ cây vằng sẻ Jasminum subtriplinerve Blume được đem thử hoạt tính kháng oxi hoá bằng hai phương pháp bẫy gốc tự do DPPH• và phương pháp c ch gốc tự do NO•, nhằm phục vụ cho các thí nghiệm ti p theo.
2.2.2.1 Khảo sát khả năng bẫy gốc tự do DPPH•
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ trích ly các cao từ nguyên liệu vằng sẻ
Dịch trích etanol + H2O (1:4)
Xử lý qua than hoạt tính,
+ 4 lần thể tích nước cất, làm lạnh, lọc Dịch B R n A + Ed Dịch C Dịch cloroform Dịch etanol +EA Dịch etyl axetat Dịch etanol + BuOH Dịch butanol Dịch etanol
Cành lá vằng sẻ khô xay nhuyễn (2.68 kg)
Ngâm etanol (12.0 L x 3 lần x 24 giờ), cô còn 1 L
Lắc với MgSO4.7H2O, lọc, cô quay
Dịch ete dầu
Cao ete dầu 12,4g
+ CHCl3
Cao etyl axetat 63,3g
Cao butanol 55,9g
Cao cloroform 42,8g
Phƣơng pháp thử hoạt tính bẫy gốc tự do
DPPH [31]
N m 1922, Goldschmidt và Renn [19] đ phát hiện ra một gốc tự do bền c màu tím đậm, không bị phân huỷ hay trùng hoá và cũng không phản ng v i oxi là gốc tự do
DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl). Gốc tự do này không tan trong nư c, tan trong dung môi h u cơ, c bư c s ng h p thu cực đại 517nm.
Các ch t c khả n ng kháng oxi hoá s trung hoà hay bao vây các gốc tự do
DPPH tạo thành DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine) có màu vàng cam.
DPPH Ch t kháng oxi h a DPPH
Quá trình này làm giảm nồng độ của các gốc tự do
DPPH cũng như giảm độ h p thu tại bư c s ng cực đại, màu dung dịch phản ng nhạt dần (từ tím sang vàng nhạt). Hoạt tính kháng oxi h a được đánh giá qua giá trị mật độ quang của mẫu thí nghiệm so v i mẫu đối ch ng [30],[41],[49].
Chuẩn bị hóa chất
Pha dung dịch DPPH• 100 µM: Cân chính xác 3.94 mg DPPH•, pha trong bình định m c 100 ml bằng etanol được dung dịch DPPH•
100 µM (được gọi là dung dịch làm việc).
Pha mẫu thử: Dung dịch làm việc của mẫu cao có nồng độ 500 µg.mL-1.
Đ khảo sát hoạt tính của các cao, ban đầu chúng tôi pha các mẫu thử và mẫu so sánh ở các nồng độ khác nhau. Mẫu thử và mẫu so sánh được pha theo bảng 2.4:
Bảng 2.2: Tỉ lệ pha mẫu thử và mẫu so sánh ở các nồng độ khác nhau C (µg.mL-1) Mẫu so sánh 100 50 25 10 5 2 1 V1 (μL) 0 600 300 150 60 150 60 30 V2 (μL) 1500 900 1200 1350 1440 1350 1440 1470 V (μL) 1500 V1: th tích mẫu; V2: th tích etanol; V: th tích DPPH•
Tương ng v i m i nồng độ mẫu thử, chuẩn bị một mẫu tr ng. Mẫu tr ng tương tự như mẫu thử nhưng thay VDPPH bằng Vetanol.
Nh ng mẫu c hoạt tính mạnh, phần tr m c ch trên 50 ở nồng độ 10 µg.mL-1, ti p tục được ti n hành thử ở các nồng độ th p hơn, v i các nồng độ tương ng: 5, 2 và 1 µg.mL-1. Khi đ sử dụng mẫu làm việc c nồng độ 100 µg.mL-1.
Đo mẫu
Quy trình thử hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH• được t m t t trong sơ đồ 2.2
V1L mẫu V2L etanol Thêm 1500 L DPPH• (100 M) Ủ trong b ng tối 30 phút 1500 L dung dịch mẫu Dung dịch sau ủ Đo quang ở 517 nm
Các mẫu thử được pha ở các nồng độ khác nhau v i th tích 1500 μL, sau đ thêm 1500 L DPPH• (100 M) và ủ trong b ng tối 30 phút gọi là dung dịch ủ, sau đ ti n hành đo quang ở bư c s ng 517 nm.
Xác định hoạt tính kháng oxi hóa và tính giá trị IC50
Hoạt tính kháng oxi hoá được tính dựa trên phần tr m c ch (I ): I () = Ac - As
Ac 100 Trong đ :
Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control). As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu cao (sample).
Mẫu ch ng dương: thay V1 µL mẫu cao V2 µL dung dịch DPPH●.
Mẫu tr ng: được chuẩn bị tương tự mẫu cao nhưng VDPPH được thay bằng Vetanol
M i mẫu ban đầu được thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µg.mL-1. M i nồng độ được ti n hành 3 lần. L y trung bình giá trị phần tr m của 3 lần thử m i mẫu đ s xác định được giá trị phần tr m c ch ng v i từng nồng độ khảo sát.
N u mẫu thử có hoạt tính mạnh, giá trị phần tr m c ch trên 50 , mẫu s được thử ti p ở các nồng độ th p hơn 10, 5, 2, 1 µg.mL-1 đ tìm ra giá trị IC50.
Xác định giá trị IC50:
IC50 là một giá trị dùng đ đánh giá khả n ng c ch mạnh hay y u của các mẫu cao. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đ n c th c ch 50 % gốc tự do hoặc enzym. Giá trị IC50 càng th p là mẫu có hoạt tính mạnh.
Cách xác định IC50:
Ti n hành khảo sát tác dụng của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.
V i nh ng mẫu c hoạt tính bi n thiên tuy n tính v i nồng độ, s thu được một đường thẳng y = ax + b qua t t cả các đi m (v i y là c ch và x là nồng độ).
V i nh ng mẫu c hoạt tính không bi n thiên tuy n tính v i nồng độ, một cách gần đúng, chọn 2 nồng độ c ch trên và dư i 50 , ti n hành v đường thẳng y = ax + b s thu được phương trình y = ax + b v i 2 hệ số a, b đ bi t.
Thay y = 50 vào phương trình s thu được giá trị x. Đ chính là nồng độ c ch được 50 gốc tự do (IC50).
M i nồng độ được thực hiện 3 lần, thu được 3 giá trị phần tr m. Giá trị phần tr m c ch là trung bình của 3 lần thực hiện.
2.2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế gốc tự do NO●
Phƣơng pháp ức chế gốc tự do Nitric oxid (NO●)
Dư i ánh sáng natri nitroprussid dễ dàng bị phân hủy tạo ra NO●. Trong dung dịch nư c, NO●
sinh ra phản ng v i oxi tạo ra sản phẩm bền v ng là nitrit và nitrat. Khi trong mẫu c hoạt ch t c ch NO●
s làm giảm nồng độ nitrit tạo thành trong dung dịch. Khả n ng c ch gốc tự do NO●
của mẫu được tính toán dựa trên sự giảm hàm lượng nitrit tạo thành của mẫu c ch t c ch NO●
so v i mẫu không có ch t c ch NO● (mẫu control).
Hàm lượng nitrit tạo thành trong dung dịch nư c được xác định bằng phương pháp tr c quang sử dụng thuốc thử Greiss. Nitrit phản ng v i thuốc thử Greiss tạo thành hợp ch t màu diazo bền h p thu ở bư c s ng cực đại 540 nm.
Chuẩn bị hóa chất
Đệm photphat pH = 7.4: Hòa tan 2.72 g muối NaH2PO4 và 7.16 g muối Na2HPO4.12H2Otrong 1000 mL nư c c t 2 lần. Dùng NaOH và H3PO4 điều chỉnh pH đ n 7.4 bằng máy pH.
Dung dịch natri nitroprussid 10 mM: Cân chính xác 0.149 g natri nitroprussid hòa tan trong đệm photphat pH = 7.4, sử dụng bình định m c
50 mL. Dung dịch này được pha ngay trư c khi ti n hành phản ng, đựng trong chai tối màu và gi trong b ng tối trư c khi ti n hành thí nghiệm.
Thuốc thử Greiss: Bao gồm hai dung dịch A và B
- Dung dịch A (Sulfanilamid 2% trong H3PO4 4%): Cân khoảng 2g Sulfanilamid hòa tan thành 100 mL bằng dung dịch H3PO4 4 %.
- Dung dịch B (N-1-naphtyletylendiamin 0.2 %): Cân khoảng 0.2 mg N-1- naphtyletylendiamin hòa tan thành 100 mL bằng nư c c t hai lần.
Cả hai dung dịch A và B đều được đựng trong chai tối màu và bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch A và B được trộn chung cùng tỉ lệ trư c khi thí nghiệm.
Chuẩn bị mẫu cao
Cân khoảng 1.80 - 1.90 mg ng v i m i loại cao. Pha trong típ nhựa 2 mL bằng đệm photphat pH = 7.4 đ c nồng độ gốc là 1000 µg.mL-1. Nồng độ các mẫu thử là 200, 100, 50 và 25 µg.mL-1.
Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO●
Quy trình thử hoạt tính c ch gốc tự do NO● được t m t t trong sơ đồ 2.3
Sơ đồ 2.3: Quy trình thử hoạt tính c ch gốc tự do NO●
V1 (L) mẫu
V2 (L) đệm photphat pH = 7.4
750 L natri nitroprussid 10 mM
1500 L mẫu
Mẫu sau khi ủ
Đo quang ở 540 nm ủ 180 phút, 250 C 1. Thêm 1500 L Greiss 2. để 15 phút +
Các mẫu cao sau khi được pha như phần chuẩn bị s được thêm 750 L natri nitroprussid 10 mM thành dung dịch c th tích 1500 L, sau đ ủ ở 250C trong 180 phút, mẫu sau khi ủ s được thêm ti p 1500 L thuốc thử Greiss đ thêm 15 phút rồi ti n hành đo quang ở bư c s ng 540 nm.
Xác định khả năng ức chế gốc tự do NO● và giá trị IC50
Khả n ng c ch gốc tự do NO● cũng được tính thông qua phần tr m c ch (I %):
I () = Ac - As
Ac 100
Với Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control) As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu cao (sample)
Mẫu control: thay V1 (µL) mẫu cao bằng đệm photphat pH = 7.4
Xác định giá trị IC50 : tương tự như trong phương pháp bẫy gốc tự do DPPH●.