Đề tài khoa hoc : Đánh giá tương đương sinh học chế phẩm hai thành phần amoxicilin và acid clavulanic

Các chữ viết tắtAmox Amoxicilin AUC Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian Area Under Curve AUCt Diện tích dưới đường cong dược động học đến thời điểm t AUC ∝ Diện tích dưới đườ

5754

14/4/2006

N¨m 2006

Bộ y tế

Báo cáo kết quả đề tài nghiên cứu cấp Bộ

Đánh giá tương đương sinh học

chế phẩm hai thành phần Amoxicilin và acid clavulanic

Chủ nhiệm đề tài: PGS - TS Trần Tử An

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội

Cấp quản lý: Bộ y tế

Mã số đề tài: Quyết định số 3075/BYT - QĐ ngày 06/9/2004

Thời gian thực hiện: 9/2004 đến 3/2006 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 390 triệu đồng

Trong đó kinh phí SNKH: 350 triệu đồng Nguồn khác: 40 triệu đồng

Năm 2006

Báo cáo kết quả

đề tài nghiên cứu KHCN cấp Bộ

Tên đề tài:

Đánh giá tương đương sinh học

chế phẩm hai thành phần

Amoxicilin và acid clavulanic

Cấp quản lý đề tài: Bộ y tế Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội

Danh sách những người thực hiện chính:

1 Ths Nguyễn Thị Kiều Anh - Trường Đại học Dược Hà Nội

2 Ths Trần Nguyên Hà - Trường Đại học Dược Hà Nội

3 Ths Nguyễn Lâm Hồng - Trường Đại học Dược Hà Nội

4 Ths Nguyễn Trung Hiếu - Trường Đại học Dược Hà Nội

5 CN Trần Văn Tích - Trường Đại học Dược Hà Nội

6 DSCKI Nguyễn Văn Tuyền - Trường Đại học Dược Hà Nội

7 DS Lê Thanh Hà - Sở Y tế Hòa Bình

8 DS Đặng Thị Thu Dung - Xí nghiệp Dược phẩm Trung Ương I

9 TS Phùng Thị Vinh - Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế

Năm 2006

Các chữ viết tắt

Amox Amoxicilin

AUC Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (Area Under

Curve) AUCt Diện tích dưới đường cong dược động học đến thời điểm t AUC ∝ Diện tích dưới đường cong dược động học ngoại suy đến t = ∝

BP Dược điển Anh (Bristish Pharmacopoiea)

Clav Acid clavulanic

Cmax Nồng độ thuốc đạt cực đại trong máu

CDER Trung tâm đánh giá và nghiên cứu thuốc thuộc FDA (Mỹ) CPMP Uỷ ban các chế phẩm thuốc bản quyền của Liên minh châu Âu

(EU)

DC Dược chất

DĐH Dược động học

EDTA Acid etylendiamin tetracetic

FDA Cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and

OMS Tổ chức Y tế thế giới (tiếng Pháp)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MRT Thời gian lưu trú trung bình

S.clav Diện tích pic của acid clavulanic

S.nội chuẩn Diện tích pic của chuẩn nội

SĐK Số đăng ký

SKD Sinh khả dụng (Bioavailability)

T1/2 Thời gian bán thải (Half - life)

tmax Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại trong máu TĐSH Tương đương sinh học (Bioequivalence)

WHO Tổ chức Y tế thế giới (tiếng Anh)

XNDPTWI Xí nghiệp Dược phẩm trung ương I

Bảng 4.3 Kết quả biểu thị sự phụ thuộc giữa đáp ứng phân

tích và nồng độ amoxicilin và acid clavulanic trong huyết

Bảng 4.9 Nồng độ amoxicilin và acid clavulanic (àg/ml)

trong huyết tương theo thời gian của các cá thể

43

Bảng 4.10 Các thông số dược động học của amoxicilin và

acid clavulanic trong huyết tương của người tình nguyện sau

khi uống 1 viên Vigentin 500/ 125 mg

44

Bảng 4.11 Nồng độ hoạt chất trong huyết tương người tình

nguyện N8 sau khi uống 3 viên Vigentin 500mg/125mg

46

Bảng 4.12 Các thông số dược động học của amoxicilin và 48

acid clavulanic ở người tình nguyện N8 sau khi uống 3 viên

Vigentin 500mg/125mg

Bảng 4.13 Nồng độ hoạt chất trung bình trong huyết tương

của 12 người tình nguyện sau khi uống 3 viên Augmentin

500/125mg

49

Bảng 4.14 Nồng độ hoạt chất trung bình trong huyết tương

của 12 người tình nguyện sau khi uống 3 viên Vigentin

Bảng 4.21 Giá trị Cmax và AUC0-420 (TB ± sd) của amoxicilin

và acid clavulanic của viên Vigentin 500 mg/ 125 mg và

Augmentin 500 mg/ 125 mg

65

Bảng 4.22 Thông số dược động học đối với amoxicilin và

acid clavulanic của viên Augmentin 500 mg/ 125 mg

66

Danh mục hình

Hình 4.1a Phổ hấp thụ của dẫn chất acid clavulanic 30

Hình 4.2 Phổ hấp thụ của pic nội chuẩn trên sắc ký đồ 32

Hình 4.3a Sắc ký đồ của huyết tương trắng tại 200nm 33

Hình 4.3b Sắc ký đồ của amoxicilin trong huyết tương tại

200nm

33

Hình 4.4a Sắc ký đồ của huyết tương trắng tại 322nm 33

Hình 4.4b Sắc ký đồ của acid clavulanic trong huyết tương

tại 322nm

34

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa đáp ứng phân tích

và nồng độ amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương

36

Hình 4.6a Biểu đồ xác định độ chính xác của phương pháp

đối với amoxicilin

37

Hình 4.6b Biểu đồ xác định độ chính xác của phương pháp

đối với acid clavulanic

38

Hình 4.7a: Sắc ký đồ định lượng acid clavulanic trong huyết

tương NTN N8 sau khi uống viên Vigentin 500mg/ 125mg thứ

nhất

46

Hình 4.7b.: Sắc ký đồ định lượng amoxicilin trong huyết tương

người tình nguyện N8 sau khi uống viên Vigentin 500mg/

125mg thứ nhất

46

Hình 4.8 Đường cong dược động học ở người tình nguyện N8 48

Hình 4.9 Đường cong dược động học trung bình của

amoxicilin và acid clavulanic của 12 người tình nguyện uống 3

viên Vigentin 500mg/125mg hoặc Augmentin 500mg/125mg

51

2.2 §¹i c−¬ng vÒ amoxicilin vµ acid clavulanic 12

2.2.1 TÝnh chÊt lý – ho¸ cña amoxicilin vµ acid clavulanic 12

4.1 Xây dựng phương pháp định lượng định lượng 29 4.1.1 Khảo sát dung môi chiết đồng thời amoxicilin và acid

clavulanic trong huyết tương

29

4.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký định lượng đồng thời amoxicillin và

acid clavulanic trong huyết tương

Phụ lục 1: Các đường chuẩn dùng trong tính toán

Phụ lục 2: Kết quả kiểm tra sức khỏe của người tình nguyện

Phụ lục 3: Một số sắc ký đồ

Phụ lục 4: Đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu

Tóm tắt kết quả nổi bật

của đề tài

1 Kết quả nổi bật của đề tài

1.1 Đóng góp mới của đề tài:

Sau khi hoàn thành đề tài: Đánh giá TĐSH của chế phẩm hai thành phần amoxicilin (amox) và acid clavunanic (clav) sản xuất ở Việt Nam, chúng tôi rút ra 3 đóng góp mới của đề tài

1.1.1 Đối với các chế phẩm có sự cá thể hoá cao trong hấp thu như amox và clav chọn

mô hình chéo đa liều là phù hợp Thông qua mô hình này giảm thiểu được độ phân tán của số liệu thực nghiệm, cho kết quả đánh giá TĐSH tin cậy hơn

1.1.2 Đã lựa chọn viên nén dài bao phim Vigentin 625mg do xí nghiệp dược phẩm TW I

sản xuất làm đối tượng nghiên cứu – chế phẩm thử (T) – so sánh với chế phẩm đối chiếu (R) viên Augmentin 625mg của SmithKline Beecham Đã xây dựng thành công mô hình chéo ngẫu nhiên 2 giai đoạn 3 liều với 12 người tình nguyện (NTN) nam khoẻ mạnh Các thông số dược động học thu được từ thử nghiệm này hoàn toàn phù hợp với các số liệu của một số tác giả đã công bố trước đây

1.1.3 Đã xây dựng được một qui trình kỹ thuật phân tích định lượng đồng thời amox và

clav trong huyết tương Qui trình này đơn giản, nhanh, chi phí ít, dễ thực hiện, tạo thuận lợi cho thử nghiệm đánh giá TĐSH của Vigentin

1.2 Kết quả cụ thể:

1.2.1 Mô hình thử nghiệm:

• 12 NTN nam khoẻ mạnh, tương đối đồng nhất: 20 – 25 tuổi, cân nặng 55 – 65 kg; đã được kiểm tra 4 chỉ tiêu huyết học và 5 chỉ tiêu hoá sinh

• Mô hình chéo 2 giai đoạn 3 liều: ở mỗi giai đoạn, NTN uống chế phẩm T hoặc

R 1 viên/lần x 3 lần, cách nhau 12 giờ liên tiếp trong 2 ngày sau khi ăn 1 giờ Giữa hai giai đoạn cách nhau 7 – 14 ngày

• Lấy mẫu: sau khi uống 1 viên T hoặc R lấy 4 ml máu ở 11 thời điểm: 40 60,

80, 100, 120, 140, 160, 180, 240, 300 và 420 phút Tổng số 33 mẫu cho 1 NTN

1.2.2 Đường cong DĐH: đã xây dựng đường cong DĐH trung bình cho 12 NTN trên cơ

sở phân tích định lượng amox và clav trong huyết tương theo thời gian lấy mẫu Dựa vào đường cong DĐH, dùng phần mềm Kinetica 4.4.1 để tính toán thông số DĐH của chế phẩm thử Vigentin 625 mg so với chế phẩm đối chiếu Augmentin

625 mg Kết quả được trình bày ở bảng 1

Bảng 1: So sánh các thông số DĐH của chế phẩm 2 thành phần

amoxicilin và acid clavulanic

Kết quả thu được phù hợp với các số liệu đã được công bố trước đây

TT Thông

số

Đơn vị

Augmentin (Beecham Research, UK) 625mg [28]

Co - amoxiclav (Losan- pharma) 625mg [28]

Augmentin (Beecham Research, UK) 375mg [26]

Vigentin (XNDPTƯ I) 625mg

1.2.3 Chương trình HPLC phân tích định lượng:

Đã định lượng AMOX và CLAV trong huyết tương theo điều kiện sau:

Pha tĩnh: SB – C8 (150 ì 4,6mm); 5àm

Cột bảo vệ SB – C8 (10 ì 4,6mm); 5àm Pha động: Đệm phosphat – MeOH (91 : 9)

Xác định CLAV

1.3 Đóng góp đào tạo cán bộ:

• Các cán bộ trẻ của BM Hóa phân tích - độc chất thông qua đề tài nghiên cứu đã rèn luyện phương pháp tư duy, xây dựng kế hoạch thực nghiệm cho một đề tài nghiên cứu, hoàn thiện kỹ năng thực hành trên thiết bị HPLC

• Đề tài nghiên cứu là nội dung cho 2 luận văn thạc sĩ chuyên ngành kiểm nghiệm thuốc - độc chất và 1 khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học

2 áp dụng vào thực tiễn và đời sống xã hội:

Đề tài nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn:

2.1 Đã giúp xí nghiệp dược phẩm TW 1 minh chứng chất lượng thuốc Vigentin 625 mg

tương đương sinh học với chế phẩm tương ứng được tín nhiệm trên thị trường thuốc thế giới: viên Augmentin 625 mg của hãng SmithKline Beecham, U.K

2.2 Làm cơ sở cho các nhà quản lý thuốc của nước ta có cơ sở thực tế đưa tiêu chuẩn

đánh giá TĐSH vào qui chế xét duyệt và cấp phép thuốc mới

3 Đánh giá thực hiện so với đề cương đã phê duyệt

3.1 Tiến độ hoàn thành:

Đề tài theo đề cương đã phê duyệt, thực hiện trong 18 tháng (từ 9/2004 đến 3/2006) Do cố gắmg của các cộng tác viên, kế hoạch thực nghiệm chi tiết sát sao, nên đã rút ngắn thời gian 2 tháng, hoàn thành và nộp báo cáo vào tháng 1/2006 3.2 Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:

Hoàn thành tốt trước thời hạn nội dung nghiên cứu đã được phê duyệt

3.3 Kết quả nghiên cứu:

Phù hợp với dự kiến của đề cương

được qui định trong qui chế thử của FDA:

- Phối hợp các dược chất có tỷ lệ rất khác nhau

- Thuốc có đáp ứng rất khác nhau trên các cá thể

- Phương pháp định lượng dược chất không đủ độ nhậy cần thiết phải dùng đa liều để tăng nồng độ trong máu

2/ TĐSH là phép thử cần thiết nhằm thúc đẩy chất lượng thuốc và hướng tới đánh giá tương đương điều trị của các chế phẩm sản xuất trong nước Do đó ngành Dược

Việt Nam nên xem xét để đưa phép thử TĐSH vào qui chế về sản xuất, kiểm nghiệm và cấp phép chế phẩm thuốc

3/ Nhà nước cần đầu tư và thành lập các trung tâm đánh giá SKD và TĐSH của

thuốc để đảm bảo kết quả nghiên cứu này có đáng tin cậy và có tính chất pháp lý

được thế giới công nhận

lý

Song song với đánh giá sinh khả dụng thì nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của thuốc cũng được triển khai nhằm hai mục tiêu: ư Đánh giá chất lượng thuốc generic về mặt hiệu quả và an toàn

so với thuốc phát minh (innovator drug) phục vụ xét duyệt thuốc và sử dụng cho điều trị

ư Giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân và giảm tải phí bảo hiểm y

tế

Tuy nhiên đánh giá tương đương sinh học của thuốc khá tốn kém Theo thống kê của FDA, chi phí thử nghiệm cho một thuốc (bao gồm khâu phân tích và khâu lâm sàng) có thể kéo dài một năm tới cả chục năm, tiêu tốn từ vài trăm nghìn đến hàng triệu USD Vì vậy, ngay ở các nước phát triển, tuỳ từng trường hợp cụ thể, người ta giới hạn phạm vi thử

in vivo và nhất là thử trên người ở nước ta hiện nay chưa có văn bản qui

định chính thức thử tương đương sinh học Trong hồ sơ trình duyệt đăng

ký thuốc chưa cần cung cấp số liệu thử tương đương sinh học mặc dù đã

có một số công trình nghiên cứu về sinh khả dụng và đánh giá tương

đương sinh học của một số chế phẩm bào chế ở Việt nam

Hiện nay, công nghiệp bào chế thuốc của nước ta tương đối phát triển, có thể cung cấp đầy đủ các loại thuốc thiết yếu cho nhu cầu điều trị bệnh của nhân dân với các dạng bào chế phong phú và chất lượng không ngừng được nâng cao Tuy nhiên, để có thể khẳng định được chất lượng của sản phẩm thuốc nội, đồng thời định hướng cho thầy thuốc, bệnh nhân

trong việc lựa chọn, xác định thuốc có tác dụng tốt hoặc chọn thuốc thay thế có tác dụng tương đương thì chúng ta phải có những kết quả đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc

Việt Nam có tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao so với các nước trên thế giới, do đó các doanh nghiệp dược trong nước đã đầu tư sản xuất nhiều loại thuốc kháng sinh Trong đó, chế phẩm dạng phối hợp của amoxicilin

và acid clavulanic được sử dụng khá phổ biến trong điều trị ở nhiều dạng bào chế khác nhau: dung dịch tiêm, viên, hỗn dịch dạng chai và dạng gói…

Xuất phát thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài "Đánh giá tương

đương sinh học chế phẩm hai thành phần amoxicilin và acid clavulanic nhằm hai mục tiêu chính là:

- Xây dựng một qui trình thực nghiệm thích hợp, khả thi để nghiên cứu tương đương sinh học của chế phẩm chứa hai thành phần amoxicilin

và acid clavulanic

- Đánh giá tương đương sinh học của viên nén bao film Vigentin 500mg/125mg sản xuất tại Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương I so sánh với chế phẩm viên nén bao film Augmentin 500mg/125mg của hãng dược phẩm SmithKline Beecham

Chúng tôi hy vọng rằng thông qua thực tế nghiên cứu của đề tài này sẽ cung cấp một số dữ liệu giúp thêm các cơ quan chức năng soạn thảo văn bản đánh giá tương đương sinh học ở nước ta

Phần 2 tổng quan

2.1 Sinh khả dụng và tương đương sinh học

2.1.1.Sinh khả dụng (Bioavailability: SKD) [2], [19]

Đối với các thuốc mà sinh khả dụng phụ thuộc vào nồng độ dược chất (DC) trong máu thì SKD phản ánh mức độ và tốc độ hấp thu của DC còn nguyên hoạt tính từ dạng bào chế vào hệ đại tuần hoàn và đưa tới nơi

tác dụng

Mức độ hấp thu được phản ánh bằng diện tích dưới đường cong dược động học của nồng độ dạng hoạt tính của thuốc trong huyết tương (Area Under Curve: AUC) AUC cho biết tổng lượng DC được hấp thu từ dạng bào chế vào hệ đại tuần hoàn

Tốc độ hấp thu được đặc trưng bởi thời gian thuốc đạt cực đại (tmax)

và nồng độ cực đại của thuốc (Cmax) trong máu

2.1.2 Tương đương sinh học

Hai chế phẩm được coi là tương đương sinh học (TĐSH) nếu không

có sự khác nhau có ý nghĩa về mức độ và tốc độ hấp thu của chúng vào

đại tuần hoàn, khi được dùng với liều giống nhau, dưới điều kiện như nhau trong một nghiên cứu được thiết kế một cách thích hợp [2], [23]

Khi đã có một sản phẩm generic, một chế phẩm muốn chứng minh

được tính an toàn và hiệu quả phải được so sánh về TĐSH với chế phẩm

đối chiếu đó

Hiện nay đã có ba văn bản chính thức qui định thử TĐSH của các chế phẩm thuốc thuộc ba cơ quan quản lý dược phẩm được lưu hành phổ biến ở nước ta

ư FDA: hướng dẫn về phương pháp thống kê cho đánh giá TĐSH dùng bố trí chéo hai giai đoạn xuất bản 7/ 1992 do Trung tâm đánh giá và nghiên cứu thuốc CDER (Center for Drug Evaluation and Research) thuộc

FDA biên soạn Văn bản này có hướng dẫn bổ sung vào tháng 10/ 2000 và 1/ 2001 [10]

ư CPMP: ủy ban thuốc bản quyền châu Âu (Committee for proprietary medicinal products) có hướng dẫn đầu tiên vào tháng 12/

1991 Văn bản này được sửa chữa và bổ sung xuất bản vào tháng 6/ 2001 [11]

ư WHO: tổ chức y tế thế giới có khuyến cáo năm 1998 về đánh giá TĐSH [29]

Có nhiều phương pháp đánh giá TĐSH, nhưng phương pháp dược

động học (DĐH) được sử dụng phổ biến nhất để đánh giá TĐSH cho các thuốc tác dụng toàn thân, giải phóng thuốc vào hệ tuần hoàn Nội dung chính của phương pháp này là dựa vào các thông số DĐH trung bình thu

được từ nhiều cá thể

2.1.3 Các chế phẩm cần đánh giá TĐSH [29]

Với các chế phẩm có nguy cơ khác nhau về KDSH đưa đến không tương đương điều trị Có thể phân ra nhiều trường hợp :

∗ Dạng thuốc giải phóng nhanh

Dạng này bao gồm: viên nén, viên nang, hỗn dịch uống, cần nghiên cứu invivo trong các trường hợp:

ư Dược động học của hoạt chất phức tạp: do quá trình hấp thu, do dược động học không tuyến tính, do tỷ lệ hoạt chất chuyển hóa cao (trên 70%) hoặc đào thải trước khi vào hệ đại tuần hoàn

ư Tính chất lý hoá của hoạt chất không thuận lợi như

+ Độ tan thấp (do tính đa hình - polymorphism hoặc kích thước tiểu phân,….)

+ Tính thấm kém,

+ Kém bền vững, không ổn định

ư Có vấn đề về KDSH do cấu trúc hóa học của hoạt chất (ví dụ

ư Tỷ lệ tá dược quá lớn so với hoạt chất

∗ Dạng thuốc tác dụng toàn thân vào cơ thể qua các đường khác như qua da, qua trực tràng

∗ Dạng thuốc tác dụng kéo dài

∗ Dạng thuốc tác dụng tại chỗ (trừ dạng dung dịch) như viên đặt phụ khoa, thuốc mỡ,… về nguyên tắc dùng phương pháp dược lý hoặc thử lâm sàng để đánh giá TĐSH

ư Thuốc dạng khí

ư Thuốc dạng bột để pha thành dung dịch tiêm hoặc uống

ư Thuốc nhỏ mắt, nhỏ tai dạng dung dịch nước có cùng nồng độ, hoạt chất và cùng các tá dược chính

ư Các thuốc hít, xịt mũi có cùng hoạt chất, nồng độ và tá dược chính, cách sử dụng (xịt, hít) cơ bản giống nhau

2.1.5 Phương pháp DĐH đánh giá TĐSH

Trong phương pháp này, các thông số DĐH được dùng làm cơ sở

đánh giá tương đương giữa chế phẩm nghiên cứu với chế phẩm đối chiếu

ở đây có 6 nội dung cơ bản:

ư Cách bố trí thử thuốc trên người tình nguyện,

ư Chọn đối tượng nghiên cứu,

ư Các thông số DĐH dùng cho đánh giá TĐSH,

ư Chương trình lấy mẫu và uống thuốc,

ư Phương pháp phân tích định lượng hoạt chất trong dịch sinh vật, ư Phân tích số liệu thực nghiệm và đánh giá kết quả

Chúng ta xem xét cụ thể từng nội dung

2.1.5.1 Chọn mô hình thử nghiệm [7, 10, 11, 30]

Trong bố trí thực nghiệm đánh giá TĐSH cần chọn mô hình để tách tác động của chế phẩm thuốc khỏi các tác động khác Mô hình hay

được lựa chọn để đánh giá TĐSH của thuốc cần nghiên cứu so với thuốc

đối chiếu là bố trí chéo đôi, hai giai đoạn (crossover design, two sequences, two treatments) Điểm cơ bản của bố trí này là mỗi cá thể sẽ là chuẩn của nó Giữa 2 lần uống thuốc có một thời gian nghỉ cần thiết để

đào thải hết dược chất của lần uống thuốc trước ra khỏi cơ thể

Liều dùng trong thực nghiệm

Thông thường dùng liều đơn (single dose) cho phương pháp DĐH Tuy nhiên trong một số trường hợp cần dùng đa liều (multidose) để đạt

đến trạng thái dừng (steady state)

∗ Sự dao động quá lớn của nồng độ hoạt chất trong huyết tương ở từng cá thể gây khó khăn cho đánh giá TĐSH khi dùng liều đơn Trong trường hợp này người ta dùng đa liều nhằm giảm thiểu dao động này ∗ Độ nhạy (sensitivity) của phương pháp phân tích không đủ tin cậy để xác định nồng độ hoạt chất trong huyết tương Đa liều sẽ tăng nồng độ hoạt chất

∗ Động học không tuyến tính, đặc biệt khi hoạt chất có liên kết bão hoà với protein trong huyết tương

∗ Phối hợp nhiều thuốc, nếu nồng độ của chúng trong huyết tương rất khác nhau

∗ Các chế phẩm thuốc giải phóng chậm

2.1.5.2 Chọn đối tượng nghiên cứu [10, 11, 23, 29]

Đối tượng nghiên cứu trong đánh giá TĐSH là người tình nguyện thử thuốc, chế phẩm đối chiếu và chế phẩm nghiên cứu

• Chọn người tình nguyện

Trong phương pháp DĐH cần chọn quần thể người tình nguyện nhằm đảm bảo 2 yêu cầu: sự khác biệt giữa các cá thể là cực tiểu và cho phép phát hiện dễ dàng sự khác nhau giữa các chế phẩm Do đó, các cá thể phải là:

+ Người khoẻ mạnh, tuổi từ 18 đến 55, cân nặng, chiều cao nằm trong khoảng trị số trung bình của dân số

+ Không hút thuốc lá, không nghiện rượu và ma tuý,

+ Không có tiền sử dị ứng với thuốc

+ Nếu là nữ phải kiểm tra để đảm bảo họ không mang thai

Ngoài ra, tuỳ đặc điểm của chế phẩm nghiên cứu có thể thực hiện thêm các xét nghiệm cần thiết

Số lượng NTN cần cho thử nghiệm phụ thuộc vào nhiều yếu tố liên quan đến hoạt chất và phương pháp phân tích Các yếu tố này thể hiện ở: ư Phương sai của các thông số ban đầu thu được từ thí nghiệm thăm dò (pilot experiment), từ các nghiên cứu trước đây hoặc các tài liệu

đã công bố

ư Độ tin cậy mong muốn của kết quả

ư Mức độ khác nhau giữa chế phẩm nghiên cứu và chế phẩm đối chiếu về TĐSH, về tính an toàn và hiệu quả

Ngoài ra các yếu tố về chuẩn phân tích, chuẩn lâm sàng cũng có thể ảnh hưởng đến số lượng cá thể cần dùng Tuy nhiên số lượng cá thể tối thiểu không dưới 12 người

• Chọn chế phẩm đối chiếu

+ Mục đích của đánh giá TĐSH là xác định xem chế phẩm generic

Chế phẩm phát minh là những chế phẩm bản quyền được cấp phép lưu thông trên cơ sở có đủ hồ sơ nghiên cứu về hóa học, sinh học, bào chế, dược lý, độc chất và thử lâm sàng Vì vậy, chế phẩm đối chiếu trong đánh giá TĐSH phải là chế phẩm phát minh

+ Tuy nhiên, hiện nay chưa có thoả thuận quốc tế về vấn đề này Theo khuyến cáo của OMS, việc lựa chọn chế phẩm đối chiếu ở từng quốc gia có thể dựa vào: 1) Thuốc chiếm vị trí chủ yếu trên thị trường nước đó; 2) Thuốc được cấp phép đầu tiên

Chính vì lý do này nên có sự khác nhau đáng kể giữa thuốc đối chiếu của các nước

+ Khối EU có qui định mềm dẻo hơn trong một số trường hợp cụ thể:

* Có thể dùng thuốc tương đồng (essentially similar product) thay cho thuốc phát minh của nó

* Đánh giá sự tương đồng của thuốc (essentially similarity) dựa vào TĐSH với một chế phẩm đối chiếu ở một nước thành viên có thể dùng cho các nước thành viên khác của khối

* Khi cần đánh giá TĐSH bổ sung, có thể dùng chế phẩm đã được

đăng ký ở nước thành viên liên quan làm chế phẩm đối chiếu

• Chế phẩm nghiên cứu

Chế phẩm nghiên cứu cần đánh giá TĐSH so sánh với chế phẩm

đối chiếu phải đảm bảo các yêu cầu:

ư Chế phẩm được sản xuất theo tiêu chuẩn GMP

ư Chế phẩm được lấy từ lô sản xuất công nghiệp Nếu phải lấy từ lô sản xuất thử (pilot) thì lô này không được dưới 10% cỡ lô sản xuất chuẩn

ư Độ hoà tan in vitro giữa hai chế phẩm nghiên cứu và chế phẩm

đối chiếu khác nhau không quá 5%

ư Hàm lượng hoạt chất của 2 chế phẩm cũng không khác nhau quá 5% Nếu quá thì phải hiệu chính các thông số phụ thuộc liều để so sánh

đánh giá kết quả

2.1.53 Các thông số DĐH dùng trong đánh giá TĐSH [10, 11, 23]

Trong đa số trường hợp TĐSH được đánh giá trên cơ sở nồng độ dược chất đo được trong dịch sinh vật (máu, huyết tương, huyết thanh, nước bọt, nước tiểu) Tuy nhiên, dùng các thông số DĐH trong huyết tương như AUC, Cmax, Tmax để đánh giá TĐSH được sử dụng phổ biến nhất, phản ánh tốt mức độ và tốc độ hấp thụ thuốc Chế phẩm thử A được coi là TĐSH với chế phẩm đối chiếu B nếu:

20 , 1 AUC

AUC 80

, 0

maxB maxA ≤

AUC

AUC ln 80

maxB maxA ≤

Nếu thực nghiệm đa liều đánh giá ở trạng thái dừng (steady state) cần có thêm các thông số Cmin và mức thăng giáng (fluctuation) ∆

2.1.5.4 Chương trình lấy mẫu và uống thuốc

Để thu được đường cong DĐH phản ánh đúng mức độ hấp thu và

đào thải thuốc cần xây dựng một chương trình lấy mẫu và uống thuốc phù hợp Chuẩn hóa điều kiện thí nghiệm nhằm giảm thiểu sự thay đổi của các yếu tố ảnh hưởng đến độ tin cậy của số liệu DĐH

ư Người tình nguyện được phân ngẫu nhiên vào nhóm uống thuốc đối chiếu hoặc thuốc nghiên cứu với 240 ml nước (khối EU qui định tối thiểu 150 ml nước) Nếu cần uống thêm nước phải đợi 1 giờ sau khi uống thuốc

Trong và sau giai đoạn thử nghiệm, việc theo dõi sức khoẻ người tình nguyện phải do các bác sĩ có năng lực đảm nhiệm

• Chương trình lấy mẫu

Chương trình lấy mẫu cần bảo đảm thu được Cmax tin cậy và AUC tính được từ số liệu thực nghiệm tối thiểu bằng 80% AUC∝ Vì vậy thường xây dựng đường cong DĐH tối thiểu đến thời gian bằng 3t1/2

Để có chương trình lấy mẫu phù hợp, người ta dựa vào các thông tin thu được từ thí nghiệm sơ bộ và số liệu đã được công bố trước đó Để có trị số t1/2 tin cậy cần tính từ 3 - 4 điểm thực nghiệm ở pha

đào thải

2.1.5.5 Thẩm định phương pháp phân tích [8, 12, 20, 23, 25]

Phương pháp phân tích định lượng hoạt chất trong dịch sinh vật (máu, huyết tương, nước tiểu) cần được lựa chọn và thẩm định Mục đích của thẩm định là xác nhận độ tin cậy của phép đo hoạt chất trong môi trường đã cho Nội dung thẩm định phương pháp gồm 6 điểm:

ư Độ ổn định của hoạt chất trong điều kiện bảo quản mẫu và xử lý mẫu,

2/ Dùng phương pháp phân tích ở giai đoạn 1 định lượng hoạt chất trong mẫu nghiên cứu nhằm xác định lại độ ổn định, độ đúng và độ chính xác cao

Một vấn đề cần được lưu ý là phân tích các hoạt chất chiral (chiral active substances), do một số thuốc có hoạt tính thay đổi tuỳ thuộc vào loại đồng phân (enantiomers) Theo CPMP, trong đánh giá TĐSH để xác

định chế phẩm tương đồng (essentially similar products) nên định lượng loại đồng phân có trong mẫu, trừ 2 trường hợp:

ư Hiệu quả và an toàn nằm ở đồng phân,

ư Quá trình hấp thu không tuyến tính ít nhất là với một đồng phân

Theo qui định này của FDA, các dược chất ít trường hợp phải định lượng các đồng phân chiral

Thông số dược động học được tính toán từ nồng độ như AUC, Cmax

được phân tích chuyển dạng logarit cơ số 10 hoặc cơ số e Riêng với Tmaxkhông chuyển dạng logarit, được xử lý theo phương pháp thống kê không tham số Ngoài ra, phân tích phương sai được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các nguồn biến thiên như: trình tự, giai đoạn, cá thể và chế phẩm đến kết quả Cần lưu ý là trình tự thử thuốc phải không có ý nghĩa thống kê, tức là không có hiệu ứng tồn lưu giữa 2 giai đoạn thử thuốc ∗ Khoảng chấp nhận của các thông số DĐH

Với AUC, Cmax và các thông số liên quan đến nồng độ như MRT, mức thăng giáng ∆, tiêu chuẩn của Mỹ và châu Âu chấp nhận khoảng dao động 0,80 - 1,20 của chế phẩm nghiên cứu so với chế phẩm đối chiếu

Có một vài ghi chú:

ư Đối với các hoạt chất có khoảng điều trị hẹp (narrow therapeutique range), khoảng chấp nhận này có thể được rút ngắn lại, ư Trong một số trường hợp, tiêu chuẩn châu Âu cho rộng hơn 0,75

- 1,33 có lý giải về hiệu quả và an toàn

Riêng trị số Tmax việc đánh giá thống kê chỉ có ý nghĩa trong hai trường hợp:

ư Thuốc giải phóng nhanh hoặc tác dụng nhanh có ý nghĩa lâm sàng,

ư Có dấu hiệu liên quan đến tác dụng phụ của thuốc

Trị số Tmax được xử lý theo phương pháp thống kê không tham số

Điều đó có nghĩa là khoảng dao động Tmax của chế phẩm nghiên cứu được

xử lý theo phương pháp này sẽ rộng hơn nhiều so với khoảng dao động nếu xử lý theo phương pháp thống kê dùng test t

2.2 Đại cương về Amoxicilin và Acid Clavulanic 2.2.1 Tính chất lý – hoá của amoxicilin và acid clavulanic

♦ Amoxicilin [4], [21], [22], [23]

H H

Acid clavulanic (Clav) ®−îc t¹o thµnh do sù lªn men cña

Streptomyces Clavuligerus cã cÊu tróc beta- lactam gÇn gièng penicilin,

cã kh¶ n¨ng øc chÕ beta- lactamase B¶n th©n Clav cã t¸c dông kh¸ng

Sự kết hợp hai thành phần này: Clav giúp Amox không bị beta- lactamase phá huỷ, đồng thời mở rộng thêm phổ kháng khuẩn của Amox

Sự hấp thu của thuốc không bị ảnh hưởng bởi thức ăn và tốt nhất là uống ngay trước bữa ăn SKD đường uống của Amox là 90% và Clav là 75%

- Phân bố:

Phân bố nhanh vào hầu hết các mô và dịch trong cơ thể, trừ mô não

và dịch não tuỷ nhưng khi màng não bị viêm thì Amox lại khuếch tán vào

dễ dàng

- Thải trừ:

55-70% Amox và 30- 40% Clav được thải trừ qua nước tiểu dưới dạng hoạt động Thời gian bán thải của Amox là 1- 2 giờ và của Clav là xấp xỉ 1giờ

2.2.3 Các dạng thuốc trên thị trường [3], [5], [24]

Trên thị trường có nhiều loại biệt dược khác nhau phối hợp bởi hai thành phần Amox và Clav dưới nhiều dạng bào chế khác nhau, bảng 2.1 tóm tắt một số biệt dược đã và đang lưu thông trên thị trường

Bảng 2.1 Một số biệt dược kết hợp amoxicilin và acid clavulanic trên thị trường

TT Tên chế phẩm Dạng bào

chế

Amox (mg) Clav (mg) Tên hãng sản xuất

250

125

62,5 31,25

OPV - Việt Nam

500

250

125 62,5

Far east Access (Đức)

6 Moxiclav Viên nén 500 125 Medochemie (Síp)

2.2.4 Định lượng Amox và Clav trong dịch sinh vật

Định lượng Amox và Clav trong máu, nước tiểu, nước bọt đã

được nhiều tác giả nghiên cứu [13, [14], [15] Phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến do ưu điểm tách tốt, giới hạn định lượng thích hợp Một số chương trình định lượng Amox và Clav trong huyết tương bằng HPLC với

detectơ UV được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các chương trình định lượng Amoxicilin và Acid Clavulanic

trong huyết tương bằng HPLC [17]

Stt Cột sắc ký Pha động

Lưu lượng (ml/phút)

Bước sóng (nm)

Thể tích tiêm (àl)

T R (phút)

100mM, chỉnh pH 3,2 bằng acid phosphoric)

50mM + ethanolamin

Ngoài ra, Amox và Clav còn được định lượng bằng HPLC với

detectơ khối phổ [28], điện di mao quản [27]

2.2.5 Đánh giá TĐSH của chế phẩm có Amox và Clav

Từ khi chế phẩm chứa Amox và Clav được sử dụng trong điều trị đã

có nhiều công trình nghiên cứu về DĐH và SKD của nó [9], [16], [18],

[26] Việc đánh giá TĐSH của viên nén chứa Amox và Clav thường được

tiến hành theo mô hình đa liều (Multiple - dose) vì có sự cá thể hóa rất

cao trong hấp thu Amox và Clav

3.1.2 Hóa chất – chất chuẩn

- Amoxicilin: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ y tế, hàm lượng 99,46%

- Kali clavulanat: Chuẩn làm việc do XNDP I cung cấp

- Terbutalin : Chuẩn làm việc, hàm lượng 99,5%

- Acetonitril, dicloromethan, methanol: loại HPLC – Baker (Mỹ)

- Kali dihydrophosphat, triethylamin, imidazol: loại tinh khiết phân tích – Merck (Đức)

- Các nguyên liệu và hoá chất khác đều đạt tiêu chuẩn PA do các nguồn tin cậy cung cấp theo yêu cầu của thực nghiệm

3.1.3 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 series gồm: Bơm cao

áp G1311A; Detectơ DAD G1315B; Bộ phận tiêm mẫu tự động G1313A

và Phần mềm điều khiển ChemStation

- Máy ly tâm điện Jouan (Pháp) và Harmonic (Đài Loan)

- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh)

- Cân phân tích điện tử Sartorius GP 1503P (Đức)

- Tủ lạnh sâu (T°=-50°C) Frigor (Đan mạch)

- Máy siêu âm Eurosonic 22 (Hà Lan)

- Máy lắc Labinco L46 (Hà lan)

- Máy đo pH Metrohm (Thụy sỹ)

- Máy khuấy từ Ikamag (Đức)

- Autopipet Biohit (Phần Lan) 1-10àl, 10-100àl, 100-1000àl

- ống nghiệm thủy tinh borosilicat nút xoáy 10 ml (Hach - Đức)

- Bình định mức, pipet và dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm phân tích

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Đánh giá tương đương sinh học

Phương pháp đánh giá TĐSH đã được lựa chọn và thay đổi trên cơ

sở các qui định của FDA, EU và WHO [10], [11], [23], [29]

3 2.1.1 Chọn người tình nguyện

Người tình nguyện (NTN) được lựa chọn muốn tham gia vào nghiên cứu này phải tự tay ký vào Đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu Mẫu đơn được trình bày ở phụ lục 4

Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn 18 NTN thử thuốc theo các yêu cầu sau:

- Lứa tuổi : tuổi trung bình 18 - 25

- Giới tính: Nam giới

- Cân nặng trung bình và chiều cao trung bình của người Việt Nam: nặng 54 - 65 kg và cao 160 - 175 cm

- Không hút thuốc, nghiện rượu, ma tuý, nhiễm HIV

- Không có tiền sử dị ứng với Amox và Clav và các thuốc khác

- Để đánh giá hiện trạng sức khoẻ chúng tôi xem xét thêm chỉ tiêu xét nghiệm:

+ Hoá sinh: 5 chỉ tiêu: urê, creatinin, bilirubin toàn phần, SGOT, SGPT

+ Huyết học: 4 chỉ tiêu: hồng cầu, công thức bạch cầu, HIV và HBsAg

Các chỉ tiêu xét nghiệm hoá sinh và huyết học của NTN phải nằm trong giới hạn của người bình thường Riêng HIV và HBsAg phải cho kết quả âm tính

Các xét nghiệm huyết học và hoá sinh được thực hiện tại BV Thanh Nhàn Riêng chỉ tiêu HIV và HBsAg được xét nghiệm tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương

Trong số 18 NTN: 6 NTN tham gia nghiên cứu khảo sát ban đầu để xây dựng mô hình thực nghiệm, 12 NTN tham gia vào nghiên cứu TĐSH

2 ngày

* Thời gian giữa 2 giai đoạn: 7 - 14 ngày

3.2.1.3 Uống thuốc: Các nhóm uống thuốc theo bố trí ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Bố trí các nhóm uống thuốc Giai đoạn Chế phẩm thử Chế phẩm đối chiếu

Mỗi NTN được uống 1 viên/ lần ì 3 lần trong 1 giai đoạn Thuốc

được uống sau khi ăn 1 giờ với 200ml nước

3.2.1.4 Lấy mẫu:

Để thu được đường cong dược động học tin cậy, phản ánh đúng

mức độ, tốc độ hấp thu và đào thải thuốc cần chọn chương trình lấy mẫu

thích hợp đảm bảo tối thiểu lấy được 3 mẫu trước cực đại và 6 mẫu sau

cực đại

Dựa vào số liệu đã công bố của các tác giả về tmax, t1/2 của Amox và

Clav, kết hợp với kết quả điều tra sơ bộ của chúng tôi trên NTN, chương

trình lấy mẫu được lựa chọn như sau:

- Trước khi uống thuốc

- Sau khi uống viên 1 : lấy mẫu tại thời điểm 40, 60, 80, 100, 120,

Như vậy ở mỗi giai đoạn mỗi NTN uống 3 viên, lấy 33 mẫu máu

Máu 4ml được lấy từ tĩnh mạch trước của cánh tay, do 1 bác sỹ và 3 y tá

đảm nhiệm, cho vào ống nghiệm có chất chống đông EDTA, lắc nhẹ Ly

tâm trong 15 phút với tốc độ 7000 vòng/ phút Lấy huyết tương cho vào

ống nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ -30°C tới khi phân tích

3.2.1.5 Theo dõi cá thể trong thời gian thử thuốc:

- Các cá thể trong thời gian lấy máu được đo nhịp tim, huyết áp 1

lần/giờ trong 4 giờ sau khi uống thuốc Việc theo dõi sức khoẻ và lấy mẫu

của NTN do các bác sĩ chuyên khoa nội đảm nhiệm và được thực hiện tại

BV Thanh Nhàn Hà Nội

- Tất cả NTN được ăn uống và sinh hoạt trong khi thử nghiệm với cùng điều kiện

3.2.2 Định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương

3.2.2.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn:

- Dung dịch chuẩn gốc amoxicilin: Cân một lượng chính xác khoảng

92,6mg amoxicilin chuẩn cho vào bình định mức 100ml, hòa tan và thêm pha động vừa đủ đến vạch

- Dung dịch chuẩn gốc clavulanat: Cân một lượng chính xác khoảng

50,4mg clavulanat chuẩn cho vào bình định mức 100ml, hòa tan và thêm pha động vừa đủ đến vạch

Từ các dung dịch chuẩn gốc này pha loãng thành các dung dịch có nồng độ khác nhau sao cho khi lấy 8 àl mỗi dung dịch chuẩn cho vào 800

àl huyết tương trắng ta thu được mẫu huyết tương chứa Amox nồng độ từ

1 ữ 16àg/ml và Clav nồng độ từ 0,25 ữ 4àg/ml

- Dung dịch chuẩn nội : Cân chính xác khoảng 100 mg terbutalin chuẩn

cho vào bình định mức 100ml, hòa tan và thêm pha động vừa đủ đến vạch Lấy 8 àl dung dịch chuẩn nội cho vào 800 àl huyết tương

Hình 3.1 Qui trình xử lý mẫu huyết tương

Xác định CLAV

Dung dịch đệm phosphat: 10,5g NaH2PO4 pha trong 650ml nước, thêm 100ml dung dịch triethylamin 2%, chỉnh pH = 3,50 ± 0,05 bằng

AChuẩn

Trong đó:

A(Chuẩn + Thử): Đáp ứng phân tích (Diện tích pic/ tỷ số diện tích pic) của Amox hoặc Clav trên sắc ký đồ thu được của mẫu chuẩn + thử

AThử: Đáp ứng phân tích (Diện tích pic/ tỷ số diện tích pic) của Amox hoặc Clav trên sắc ký đồ thu được của mẫu thử

AChuẩn): Đáp ứng phân tích (Diện tích pic/ tỷ số diện tích pic) của Amox hoặc Clav trên sắc ký đồ thu được của mẫu chuẩn

3.2.3.2 Độ chính xác của phương pháp (Precision):

Xử lý các mẫu huyết tương ở 3 mức nồng độ: thấp, trung bình và cao ở mỗi mức nồng độ tiến hành với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của tỷ lệ diện tích pic của Amox với chất nội chuẩn và diện tích pic của Clav Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị RSD%

Yêu cầu chênh lệch kết quả giữa các mẫu trong cùng một nồng độ biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) phải không lớn hơn 15%, riêng tại nồng độ LOQ cho phép không vượt quá 20%

3.2.3.3 Tính chọn lọc (Selectivity):

Trong thực nghiệm này, tính chọn lọc của phương pháp được xác

định bằng cách so sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với mẫu huyết tương trắng Lấy 800 àl huyết tương trắng: 3 mẫu không thêm Amox và Clav và

3 mẫu thêm Amox và Clav chuẩn Tiến hành phân tích

Yêu cầu tại vị trí tương ứng với pic Amox và Clav, kết quả phân tích của mẫu trắng không được xuất hiện pic

3.2.3.4 Giới hạn định lượng (Limit of quantification – LOQ):

Giới hạn định lượng được xác định trực tiếp bằng cách giảm nồng

độ hoạt chất định lượng trong mẫu cho đến khi sai số tương đối không vượt quá 20% Thêm Amox và Clav chuẩn có nồng độ thấp dần vào từng mẫu huyết tương trắng, mỗi nồng độ 3 mẫu Tiến hành phân tích và xác

định LOQ