- Dung dịch chuẩn nội: Cân chính xác khoảng 100 mg terbutalin chuẩn cho vào bình định mức 100ml, hòa tan và thêm pha động vừa đủ đến vạch.
3.2.3.Thẩm định ph−ơng pháp phân tích Amox và Clav trong huyết t−ơng
t−ơng
Để xác nhận độ tin cậy của kết quả nghiên cứu, ph−ơng pháp phân tích d−ợc chất trong dịch sinh học phải đ−ợc thẩm định. Nội dung thẩm định gồm 6 chỉ tiêu: độ ổn định của d−ợc chất, tính chọn lọc, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định l−ợng (LOQ), khoảng nồng độ tuyến tính. Khi tiến hành thẩm định, các mẫu thử đ−ợc chuẩn bị bằng cách thêm một thể tích dung dịch mẫu chuẩn nhất định vào mẫu huyết t−ơng trắng. L−ợng dung dịch mẫu chuẩn phải d−ới 5% thể tích mẫu huyết t−ơng [8], [20], [23].
3.2.3.1. Độ đúng:
Xác định bằng ph−ơng pháp thêm chuẩn. Tiến hành đo các mẫu sau khi xử lý:
+ Mẫu thử: Huyết t−ơng ng−ời sau khi uống thuốc Vigentin hoặc Augmentin.
+ Mẫu chuẩn: Cho Amox và Clav chuẩn có nồng độ xác định với tỷ lệ giữa Amox và Clav t−ơng tự tỷ lệ trong viên vào huyết t−ơng trắng.
+ Mẫu chuẩn + thử: Huyết t−ơng ng−ời sau khi uống thuốc + Amox và Clav chuẩn có nồng độ xác định với tỷ lệ giữa Amox và Clav t−ơng tự tỷ lệ trong viên.
Tính hệ số thu hồi H của Amox và Clav (%) từ đáp ứng phân tích theo công thức:
A (Chuẩn + Thử) – AThử
H%Tìm lại = --- ì 100 AChuẩn
A(Chuẩn + Thử): Đáp ứng phân tích (Diện tích pic/ tỷ số diện tích pic) của Amox hoặc Clav trên sắc ký đồ thu đ−ợc của mẫu chuẩn + thử
AThử: Đáp ứng phân tích (Diện tích pic/ tỷ số diện tích pic) của Amox hoặc Clav trên sắc ký đồ thu đ−ợc của mẫu thử
AChuẩn): Đáp ứng phân tích (Diện tích pic/ tỷ số diện tích pic) của Amox hoặc Clav trên sắc ký đồ thu đ−ợc của mẫu chuẩn.
3.2.3.2. Độ chính xác của ph−ơng pháp (Precision):
Xử lý các mẫu huyết t−ơng ở 3 mức nồng độ: thấp, trung bình và cao. ở mỗi mức nồng độ tiến hành với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của tỷ lệ diện tích pic của Amox với chất nội chuẩn và diện tích pic của Clav. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị RSD%.
Yêu cầu chênh lệch kết quả giữa các mẫu trong cùng một nồng độ biểu thị bằng độ lệch chuẩn t−ơng đối (RSD%) phải không lớn hơn 15%, riêng tại nồng độ LOQ cho phép không v−ợt quá 20%.
3.2.3.3. Tính chọn lọc (Selectivity):
Trong thực nghiệm này, tính chọn lọc của ph−ơng pháp đ−ợc xác định bằng cách so sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với mẫu huyết t−ơng trắng. Lấy 800 àl huyết t−ơng trắng: 3 mẫu không thêm Amox và Clav và 3 mẫu thêm Amox và Clav chuẩn. Tiến hành phân tích.
Yêu cầu tại vị trí t−ơng ứng với pic Amox và Clav, kết quả phân tích của mẫu trắng không đ−ợc xuất hiện pic.
3.2.3.4. Giới hạn định l−ợng (Limit of quantification – LOQ):
Giới hạn định l−ợng đ−ợc xác định trực tiếp bằng cách giảm nồng độ hoạt chất định l−ợng trong mẫu cho đến khi sai số t−ơng đối không v−ợt quá 20%. Thêm Amox và Clav chuẩn có nồng độ thấp dần vào từng mẫu huyết t−ơng trắng, mỗi nồng độ 3 mẫu. Tiến hành phân tích và xác định LOQ.
3.2.3.5. Khoảng nồng độ tuyến tính
Xác lập mối t−ơng quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích, trong tr−ờng hợp dùng nội chuẩn, diện tích pic đ−ợc thay thế bằng tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích và nội chuẩn trong từng ngày phân tích. Th−ờng làm từ 5 -7 điểm nồng độ của chất phân tích, bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ mẫu thực (dự đoán). Mối t−ơng quan giữa tín hiệu đáp ứng (diện tích pic, tỷ số diện tích pic) với nồng độ chất phân tích đ−ợc biểu diễn bằng ph−ơng trình và hệ số t−ơng quan hồi qui.
Yêu cầu đ−ờng hồi quy thu đ−ợc phải có dạng đ−ờng thẳng và giá trị hệ số t−ơng quan hồi quy phải không nhỏ hơn 0,99.
3.2.3.6. Độ ổn định của hoạt chất:
Mẫu huyết t−ơng tại thời điểm bất kỳ đ−ợc bảo quản ở -30°C. Sau những khoảng thời gian khác nhau tiến hành chạy sắc ký và tính nồng độ hoạt chất để đánh giá độ ổn định của mẫu trong thời gian bảo quản.
So sánh giá trị của các lần phân tích sau với giá trị của lần phân tích đầu tiên. Yêu cầu, l−ợng hoạt chất thay đổi phải d−ới 5%.