Nghiên cứu Tương đương sinh học viên nén Gliclazid giải phóng chậm sản xuất ở Việt Nam theo mô hình thử đơn liều và đa liều

ANOVA : Phân tích phương sai AUC : Diện tích dưới đường cong AUMC : Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian x thời gianBCS : Hệ thống phân loại sinh dược học BMI : Chỉ số khối cơ t

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Thị Vinh, người thầy

đã tận tụy hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứuthực hiện đề tài

Xin chân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy côPhòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các bộ môn khác củatrường Đại học Dược Hà nội đã tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trình họctập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Kiểm nghiệm thuốcTrung Ương, Trung tâm đánh giá tương đương sinh học nơi tôi công tác đãluôn quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập

và nghiên cứu trong thời gian vừa qua

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn luôn độngviên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ để tôi có thể có kết quả như ngày hôm nay

Trần Hoàng Học viên cao học khóa 12, chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC .3

1.1.1 Khái niệm chung 3

1.1.2 Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 4

1.1.3 Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học 5

1.1.4 Đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu 8

1.1.5 Đảm bảo chất lượng kết quả nghiên cứu 9

1.2 TỔNG QUAN GLICLAZID 9

1.2.1 Tính chất lý hóa và cách sử dụng 9

1.2.2 Một số chế phẩm gliclazid giải phóng chậm có trên thị trường 11

1.2.3 Một số phương pháp định lượng Gliclazid trong dịch sinh học 12

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TĐSH Ở TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 14

1.3.1 Trên thế giới 14

1.3.2 Trong nước 16

Phần 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Thiết bị 19

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích 20

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 23

2.2.3 Đánh giá tương đương sinh học chế phẩm gliclazid 30

Phần 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 38

3.1.1 Lựa chọn chất nội chuẩn 38

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 38

3.1.3 Khảo sát phương pháp chiết tách GLI trong huyết tương 40

3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký… 43

3.2.2 Đánh giá độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp 45

3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 46

3.2.4 Xác định độ đúng và độ chính xác 49

3.2.5 Tỉ lệ thu hồi của phương pháp 51

3.2.6 Khảo sát độ ổn định 52

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CHẾ PHẨM GLICLAZID .58

3.3.1 Kết quả lâm sàng 58

3.3.2 Xác định nồng độ thuốc trong huyết tương 59

3.3.3 Các thông số dược động học 61

3.3.4 Kết quả đánh giá tương đương sinh học 68

Phần 4: BÀN LUẬN 78

4.1 VỀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GLICLAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG .78

4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG HUYẾT TƯƠNG 79

4.3 VỀ ĐÁNH GIÁ TĐSH CHẾ PHẨM GLICLAZID 80

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Tóm tắt một số chế phẩm gliclazid có trên thị trường 11

Bảng 1.2: Tóm tắt một số phương pháp định lượng Gliclazid bằng phương pháp HPLC 12

Bảng 2.3: Các chất chuẩn đã sử dụng 18

Bảng 2.4: Các mẫu huyết tương trắng đã sử dụng 18

Bảng 2.5: Các dung môi và hóa chất sử dụng trong phương pháp phân tích .18

Bảng 2.6: Các thiết bị đã sử dụng trong phương pháp phân tích… 20

Bảng 2.7: Thiết bị HPLC Shimadzu 20

Bảng 2.8: Cách chuẩn bị đường chuẩn 25

Bảng 2.9: Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương 26

Bảng 2.10: Kết quả ngẫu nhiên hoá và bố trí uống thuốc 32

Bảng 3.11: Kết quả xác định độ phù hợp của hệ thống sắc ký……… 44

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu (tR) của GLI và IS 46

Bảng 3.13: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 47

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát đường chuẩn 47

Bảng 3.15: Sự tương quan giữa nồng độ GLI trong huyết tương và đáp ứng pic .48

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày 49

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày 50

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát tỉ lệ thu hồi của GLI 52

Bảng 3.20: Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn GLI gốc, IS thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng .53

Bảng 3.21: Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn GLI gốc thời gian dài ở nhiệt độ - 40 0C .53

Bảng 3.22: Kết quả độ ổn định dung dịch IS gốc thời gian dài ở nhiệt độ - 400C .54

Bảng 3.23: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông–rã .54

Bảng 3.24: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 55

Bảng 3.25: Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 56

Bảng 3.26: Độ ổn định của mẫu sau xử lý trong auto-sampler 57

Bảng 3.27: Nồng độ GLI tối đa trong huyết tương (Cmax) 61

Bảng 3.28: Thời gian đạt đến nồng độ tối đa trong huyết tương (Tmax) 62

Bảng 3.29: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC) 63

Bảng 3.30: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian x thời gian (AUMC) và thời gian lưu trú trung bình khi nghiên cứu đơn liều 64

Bảng 3.31: Nồng độ Cmin trong khoảng thời gian  khi thử đa liều 65

Bảng 3.32: Nồng độ Cav (g/ml) trong khoảng thời gian  khi thử đa liều 66

Bảng 3.33: Độ dao động DF và DF/ trong khoảng thời gian  khi thử đa liều .67

Bảng 3.34: So sánh Cmax bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đơn liều 68

Bảng 3.35: So sánh AUC0-∞ bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đơn liều

69 Bảng 3.36: So sánh MRTbằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đơn liều 70

Bảng 3.38: So sánh Cmax bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đa liều .73Bảng 3.39: So sánh AUCss

bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đa liều 74Bảng 3.40: So sánh Tmax theo phương pháp thống kê phi tham số, đa liều 76Bảng 4.41 So sánh thông số DĐH của gliclazid sản xuất ở Việt Nam với thông

số DĐH của tài liệu đã công bố 82

Hình 1.1: Đồ thị biến thiên nồng độ dược chất trong máu theo thời gian 4

Hình 3.2: Phổ hấp thụ của GLI 38

Hình 3.3: Phổ hấp thụ của IS 38

Hình 3.4: Sắc đồ mẫu GLI và IS trong pha động 40

Hình 3.5: Sắc đồ mẫu GLI và IS trong huyết tương 40

Hình 3.6: Sắc đồ mẫu trắng xử lý bằng n-hexan 41

Hình 3.7: Sắc đồ mẫu trắng xử lý bằng dichloromethan 41

Hình 3.8: Sắc đồ mẫu trắng xử lý bằng MeCN-CHCl3 41

Hình 3.9: Sắc đồ mẫu chuẩn + IS xử lý bằng MeCN-CHCl3 41

Hình 3.10: Sắc đồ mẫu trắng xử lý bằng chiết pha rắn 43

Hình 3.11: Sắc đồ mẫu chuẩn + IS xử lý bằng chiết pha rắn 43

Hình 3.12: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn GLI và IS trong pha động 44

Hình 3.13: Sắc ký đồ huyết tương trắng 45

Hình 3.14: Sắc ký đồ huyết tương trắng có pha IS 45

Hình 3.15: Sắc ký đồ huyết tương trắng có pha chuẩn GLI ở nồng độ LLOQ (0,2 µg/mL) và IS 45

Hình 3.16: Sắc ký đồ huyết tương trắng có pha chuẩn Gli và IS ở nồng độ khoảng giữa đường chuẩn (4,0 µg/mL) 45

Hình 3.17: Đường cong trung bình nồng độ thuốc – thời gian của 20 NTN khi thử đơn liều 60

Hình 3.18: Đường cong trung bình nồng độ thuốc – thời gian của 20 NTN khi thử đa liều 60

ANOVA : Phân tích phương sai

AUC : Diện tích dưới đường cong

AUMC : Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian x thời gianBCS : Hệ thống phân loại sinh dược học

BMI : Chỉ số khối cơ thể

C : Nồng độ thuốc tại thời điểm 

Cav : Nồng độ thuốc trung bình ở trạng thái ổn định :

Cmax : Nồng độ thuốc tốt đa

Cmin : Nồng độ thuốc tối thiểu ở trạng thái ổn định

CV% : Hệ số biến thiên

DF : Dao động nồng độ thuốc trong huyết tương

EMS : Trung bình bình phương của sai số

FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

GCP : Thực hành tốt lâm sàng

GLP : Thực hành tốt phòng thí nghiệm

GMP : Thực hành tốt sản xuất thuốc

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC : Mẫu kiểm tra nồng độ cao

IS : Glibenclamid (nội chuẩn)

Kel : Hằng số tốc độ thải trừ

LLOQ : Giới hạn định lượng dưới

LQC : Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

TĐSH : Tương đương sinh học

Tmax : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đaWHO : Tổ chức Y tế thế giới

- Đơn vị đo chiều dài

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gliclazid là một dẫn chất nhóm sulfonylurea được dùng trong điều trịbệnh tiểu đường, một căn bệnh gia tăng khi xã hội phát triển Tỷ lệ người bịbệnh tiểu đường trên thế giới ngày một tăng lên, nhu cầu dùng các thuốc trịbệnh tiểu đường cũng tăng theo Ở Việt nam, số bệnh nhân mắc bệnh tiểuđường cũng đã tới 1 – 2,5 % dân số và có tỷ lệ biến chứng, tử vong cao nhấttrong các bệnh nội tiết Trên thị trường trong nước, các chế phẩm chứagliclazid đã được lưu hành và sử dụng trong điều trị, phần lớn là các thuốcnhập ngoại Gần đây, một số cơ sở sản xuất trong nước đã và đang nghiên cứusản xuất các chế phẩm có chứa gliclazid, trong đó có cả những dạng thuốcgiải phóng chậm như Glidin (Công ty Dược phẩm Vellpharm) Tuy nhiên,chất lượng của các chế phẩm sản xuất trong nước chưa được khẳng định, việccấp phép lưu hành cũng như lựa chọn trong điều trị còn đang được xem xét

Trên thế giới, hầu hết các nước có nền công nghiệp Dược phát triển đều

đã có quy chế rõ ràng về yêu cầu dữ liệu tương đương sinh học trong việc cấpphép lưu hành, đồng thời ban hành các hướng dẫn nghiên cứu về lĩnh vựcnày Tuy nhiên, qui chế đăng ký thuốc của nước ta vẫn chưa yêu cầu về tươngđương sinh học và sinh khả dụng Khái niệm về sinh khả dụng và tươngđương sinh học mới được đề cập tới trong đào tạo và nghiên cứu khoa họckhoảng gần chục năm trở lại đậy Những nghiên cứu ban đầu mang tính chấtnhận thức khái niệm và tiếp cận phương pháp Nhiều vấn đề chưa được vàgần như không thể giải quyết được trong thời gian qua, đặc biệt là các vấn đềliên quan tới kỹ thuật Hạn chế về trình độ và thiếu các thiết bị hiện đại đãlàm giảm giá trị và khả năng ứng dụng thực tiễn của các nghiên cứu, phần nào

đó do chưa có một yếu tố nào thúc đẩy các nhà sản xuất trong nước quan tâmđầu tư cho những nghiên cứu này Gần đây, tình hình nghiên cứu về chủ đề

này đã được cải thiện khá nhiều nhờ có thêm kinh nghiệm thực tế và sựhưởng ứng của các doanh nghiệp.

Với các thuốc dạng rắn dùng đường uống, đặc biệt thuốc giải phóngchậm, ảnh hưởng của công thức bào chế và yếu tố đường tiêu hóa lên quátrình hấp thu của thuốc khá nhiều Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá khả nănghấp thu các dạng thuốc này là rất cần thiết Hơn nữa, với các dạng giải phóngchậm, nghiên cứu sinh khả dụng còn cần để chứng tỏ quá trình giải phóngdược chất chậm trong cơ thể và giúp kiểm soát nồng độ thuốc trong máu

Để đánh giá một cách đích thực chất lượng của chế phẩm Gliclazid sản

xuất trong nước, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu Tương đương sinh học viên nén Gliclazid giải phóng chậm sản xuất ở Việt Nam theo mô hình thử đơn liều và đa liều”.

Mục tiêu của đề tài là:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích Gliclazid trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC.

2 Đánh giá tương đương sinh học cho chế phẩm gliclazid giải phóng chậm sản xuất trong nước so với Diamicron ® MR 30 mg.

Phần 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

1.1.1 Khái niệm chung

- Sinh khả dụng: là thông số biểu thị tỷ lệ thuốc vào được vòng tuần hoàn

chung ở dạng còn hoạt tính so với liều đã dùng (F%), tốc độ (Tmax) và mức độ(Cmax) thuốc thâm nhập được vào vòng tuần hoàn chung Sinh khả dụnginvivo được biểu thị dưới 2 khái niệm: Sinh khả dụng tuyệt đối và sinh khảdụng tương đối, trong đó sinh khả dụng tương đối thường được dùng nhiềuhơn trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm thuốc generic [1], [4], [13]

- Tương đương sinh học: hai thuốc được gọi là tương đương sinh học nếu

chúng là những chế phẩm tương đương bào chế hoặc là thế phẩm bào chế cósinh khả dụng tương tự nhau sau khi dùng cùng một mức liều, trong cùng mộtđiều kiện thử nghiệm [4], [13]

- Tương đương bào chế: những chế phẩm thuốc được coi là tương

đương về mặt bào chế nếu các thuốc này chứa cùng một lượng dược chấtgiống nhau, cùng một dạng bào chế và đạt các tiêu chuẩn chất lượng do dượcđiển quy định [4], [13]

- Thế phẩm bào chế: là những chế phẩm thay nếu chúng chứa cùng một

dược chất nhưng khác nhau về mặt hóa học (base, muối, este …) hoặc khácnhau về dạng thuốc hay hàm lượng [13]

- Nghiên cứu đơn liều: nghiên cứu được thực hiện để đánh giá các thông

số dược động học sau khi dùng một liều duy nhất [19]

- Nghiên cứu đa liều ở trạng thái ổn định: nghiên cứu thực hiện để đánh giá

các thông số DĐH trong một khoảng liều ở trạng thái ổn định Cho người tìnhnguyện dùng thuốc đến khi đạt đến trạng thái ổn định, sau đó dùng một liều

thuốc nghiên cứu để xác định thông số dược động học từ thời điểm bắt đầu dùngliều này ở trạng thái ổn định cho đến thời điểm dùng liều tiếp theo [19].

- Thuốc giải phóng chậm (tác dụng kéo dài): là những chế phẩm có khả

năng giải phóng dược chất liên tục theo thời gian để duy trì nồng độ dượcchất trong máu trong phạm vi điều trị trong khoảng thời gian dài, nhằm nângcao hiệu quả điều trị, giảm bớt tác dụng không mong muốn, giảm số lần dùngthuốc cho người bệnh [12]

Hình 1.1: Đồ thị biến thiên nồng độ dược chất trong máu theo thời ị biến thiên nồng độ dược chất trong máu theo thời ến thiên nồng độ dược chất trong máu theo thời th bi n thiên n ng ồ thị biến thiên nồng độ dược chất trong máu theo thời độ dược chất trong máu theo thời ược chất trong máu theo thời d c ch t trong máu theo th i ất trong máu theo thời ời

1.1.2 Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

Có nhiều phương pháp đánh giá SKD và TĐSH [18, 17-33], [20] Sauđây là các phương pháp hay dùng:

- Thử in vivo ở người bằng cách so sánh sự biến thiên nồng độ dược chất

hoặc chất chuyển hóa trong máu, huyết tương, huyết thanh hoặc các dịch sinhhọc thích hợp khác theo thời gian

- Thử in vitro nếu đã chứng minh được là có tương quan tỉ lệ thuận với

số liệu SKD in vivo trên người.

- Thử in vivo ở người bằng cách đo tổng lượng dược chất hoặc chất

chuyển hóa bài tiết qua nước tiểu theo thời gian

- Thử in vivo trên người bằng cách đo tác dụng dược lý của dược chất

hoặc chất chuyển hóa theo thời gian nếu phương pháp đánh giá đủ nhậy,chính xác và tin cậy

- So sánh tác dụng lâm sàng bằng phương pháp thích hợp, tin cậy

1.1.3 Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học

Hiện nay, đánh giá tương đương sinh học thực hiện theo hướng dẫn củaFDA, Canada, ASEAN…, và dược điển của một số nước như Mỹ, TrungQuốc…[9], [10], [13], [14], [17], [28], [31]

1.1.3.1 Thiết kế nghiên cứu

- Thiết kế: Trong nghiên cứu TĐSH, để hạn chế sự ảnh hưởng của các

yếu tố các thể người ta hạn chế thiết kế nghiên cứu song song mà thường thiết

kế nghiên cứu chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn (ô vuông la tinh 2x2) áp dụng khi sosánh 1 thuốc thử và 1 thuốc chứng hoặc thiết kế chéo, 3 thuốc, 3 giai đoạn(3x3) khi cần so sánh 2 thuốc thử và một thuốc đối chứng Đối với thuốc giảiphóng chậm thiết kế như sau:

+ Thiết kế chéo (2 x 2), đơn liều, 2 thuốc, 2 giai đoạn, 2 trình tự

+ Thiết kế chéo (2 x 2), đa liều, 2 thuốc, 2 giai đoạn, 2 trình tự

+ Thiết kế chéo (3 x 3), đơn liều, 3 thuốc, 3 giai đoạn, 6 trình tự

Các nghiên cứu này thực hiện trong tình trạng đói hoặc không đói

- Thời gian đào thải: Thời gian nghỉ giữa hai giai đoạn dùng thuốc

phải đủ để liều đã dùng ở giai đoạn trước được đào thải hết trước khi dùngliều sau Thời gian này được tính bằng 7 lần thời gian bán thải của thuốc.Đối với thuốc giải phóng chậm thời gian nghỉ có thể dài hơn phụ thuộc vàotừng thuốc

- Liều thử: Mức liều thử thường dùng là liều tương ứng với 1 đơn vị có

hàm lượng cao nhất được lưu hành trên thị trường hoặc bằng mức liều thườngdùng trong lâm sàng Trường hợp không thể định lượng được do nồng độ quáthấp, có thể thử với liều cao hơn nhưng không được vượt quá mức liều tối đaghi trên nhãn Trường hợp thuốc có tác dụng phụ có hại hoặc quá nhiều nguy

cơ, nên thử với mức liều thấp

- Lấy mẫu: Thời điểm và khoảng thời gian lấy mẫu phải được thiết lập

sao cho có thể ước lượng tương đối chính xác giá trị Cmax và thu được đườngcong nồng độ trong huyết tương theo thời gian để ước lượng chính xác mức

độ hấp thu Thời gian lấy mẫu đáp ứng khi giá trị AUC0-t ít nhất bằng 80% giátrị AUC0-∞ Để có một đường cong dược động học lý tưởng thì số điểm lấymẫu tối thiểu phải lấy 12 điểm, 1 điểm trước khi uống thuốc, 3 – 4 điểm ở phahấp thu trước Cmax, 3 điểm xung quanh Cmax, 5 - 6 điểm ở pha thải trừ Toàn bộquá trình lấy mẫu phải tuân thủ theo quy định của GCP

1.1.3.2 Đối tượng thử

Tùy theo loại thuốc mà chọn đối tượng thử khác nhau, tốt nhất là đánhgiá trên NTN Đối với thuốc có độc tích cao, thuốc có nồng độ dược chấttrong máu thấp hoặc khi thăm dò trong quá trình phát triển sản phẩm, nghiêncứu SKD in vivo có thể tiến hành trên động vật thí nghiệm [20]

Phải lựa chọn đủ số lượng NTN để đảm bảo kết quả phân tích thống kê.Dùng tối thiểu 12 người cho một nghiên cứu Số lượng NTN có thể nhiều hơnnếu dược chất thuộc loại có tốc độ và mức độ hấp thu biến thiên giữa các cáthể là khác nhau nhiều NTN khỏe mạnh, thuộc cả hai giới, tuy nhiên khôngnghiên cứu trên đối tượng là phụ nữ mang thai Các tiêu chí về chỉ số khối cơthể phải đạt các yêu cầu theo cánh tính của Metropolitan Index 1983 cho ngườilớn NTN cần được kiểm tra lâm sàng, xem xét tiền sử bệnh và các xét nghiệm

cơ bản NTN phải có khả năng hiểu các thông tin về nghiên cứu và tự viết bản

tình nguyện tham gia nghiên cứu NTN tự nguyện tham gia nghiên cứu và kývào Bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu theo mẫu được Hội đồngđạo đức thông qua Các thông tin về NTN và kết quả xét nghiệm, nghiên cứu sẽđược giữ bí mật trong hồ sơ nghiên cứu Tên, địa chỉ, hình ảnh NTN sẽ khôngđược công bố trong các báo cáo kết quả, báo, tạp chí nếu không được sự đồng

ý của NTN

1.2.3.3 Thuốc thử và thuốc đối chứng

- Thuốc thử: Thuốc dùng trong nghiên cứu SKD và TĐSH phải được sản

xuất theo tiêu chuẩn GMP Chế phẩm được lấy từ lô sản xuất công nghiệp.Nếu mẫu thử lấy từ lô sản xuất thử (pilot) thì cỡ lô này không được dưới 10%

cỡ lô sản xuất chuẩn Các mẫu thuốc dùng trong nghiên cứu phải được kiểmtra chất lượng trước khi đưa vào thử

- Thuốc đối chứng: Là các thuốc phát minh cùng loại Nếu các thuốc

phát minh không có sẵn trên thị trường tại thời điểm nghiên cứu, có thể dùngmột thuốc tương đương đã được cấp phép thay thế

- Kết quả định lượng dược chất mẫu thuốc thử và thuốc đối chứng dùngtrong nghiên cứu phải có hàm lượng không được khác nhau quá 5% Nếu quáthì phải hiệu chỉnh các thông số phụ thuộc liều để so sánh đánh giá kết quả

1.1.3.4 Phân tích mẫu sinh học

Phân tích mẫu dịch sinh học phải thực hiện theo các nguyên tắc thựchành tốt phòng thí nghiệm (GLP) Các thiết bị phân tích phải được bảo trì,hiệu chuẩn theo định kỳ để đảm bảo thông số thiết bị nằm trong giới hạn chophép Các phương pháp phân tích sinh học dùng để xác định dược chất hoặcchất chuyển hóa trong dịch sinh học phải đặc hiệu, được thẩm định đầy đủ và

có hồ sơ để cung cấp kết quả tin cậy Mục đích của việc thẩm định phương pháp

là đánh giá mức độ tin cậy của phương pháp dùng trong xác định nồng độ chấtcần phân tích trong dịch sinh học Theo quy định của FDA, thẩm định phương

pháp gồm 6 chỉ tiêu như: (1) tính đặc hiệu, (2) độ chính xác, (3) độ đúng, (4) giớihạn định lượng, (5) khoảng tuyến tính, (6) độ ổn định của dược chất ở điều kiệnphân tích và trong quá trình bảo quản Tất cả các chỉ tiêu phải đạt các quy địnhtheo hướng dẫn của FDA cũng như dược điển Mỹ, Trung Quốc

1.1.3.5 Phân tích số liệu

Phân tích số liệu đánh giá TĐSH là lượng hóa sự khác nhau về SKD giữacác thuốc thử và thuốc đối chứng Phân tích thống kê được sử dụng để đánhgiá sự khác nhau này Cơ sở của phương pháp là khoảng tin cậy 90% cho tỉ sốcủa trung bình quần thể thử và quần thể đối chứng: µT/µR cho một số thông sốkhảo sát

Thông số dược động học được tính toán từ nồng độ như AUC, MRT,

Cmax được phân tích chuyển dạng logarit cơ số 10 hoặc cơ số e Riêng đối với

Tmax được xử lý theo phương pháp thống kê phi tham số Phân tích phương saiđược sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các nguồn biến thiên như: trình tự,giai đoạn, cá thể, thuốc đến kết quả nghiên cứu

Khoảng chấp nhận của các thông số DĐH theo tiêu chuẩn của Mỹ vàChâu Âu nằm trong khoảng dao động 0,80 – 1,25 của chế phẩm thử so vớichế phẩm đối chứng

Trên thế giới, thông thường các thông số DĐH được tính toán theo phầnmềm thống kê như: Kinetica, Winnolin, SAS Trong đề tài chúng tôi tínhtoán thông số DĐH được lập trên phần mềm Ecell theo những nguyên tắctrên, phần mềm đã được thẩm định đầy đủ trước khi đưa vào sử dụng [14]

1.1.4 Đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu

Để đảm bảo vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Y – sinh học, đề cươngnghiên cứu phải được xem xét và phê duyệt bởi hội đồng đạo đức độc lập vớinhóm nghiên cứu theo các quy định hiện hành Tất cả các hoạt động nghiêncứu chỉ được thực hiện sau khi đề cương được phê duyệt Bản cam kết của

người tình nguyện phải được ký trước khi tiến hành bất kỳ hoạt động gì vớingười tình nguyện [6], [37].

1.1.5 Đảm bảo chất lượng kết quả nghiên cứu

Để đảm bảo chất lượng kết quả nghiên cứu, quá trình lấy mẫu phải tiếnhành trong điều kiện cơ sở lấy mẫu phải đạt tiêu chuẩn (GCP), NTN phảiđược tuyển chọn đạt các yêu cầu đối với thuốc thử nghiệm, quá trình phântích mẫu phải định lượng trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn vể GLP vàISO Cơ sở vật chất được thẩm định và đánh giá định kỳ Tất cả các thiết bịdùng trong nghiên cứu được hiệu chuẩn theo kế hoạch, nghiên cứu viên đượcđào tạo về GLP, GCP và các phương pháp chung về đánh giá SKD và TĐSH[11], [37]

Khối lượng phân tử: 323,4 g/mol

Công thức cấu tạo:

Tính chất: Tinh thể hay bột kết tinh trắng, hầu như không tan trong

nước, tan nhiều trong Methylenclorid, tan ít trong acetone và alcol Nhiệt độnóng chảy 1810 C Gliclazid là một acid yếu có pKa 5,8, có tính thân mỡ LogP(octanol/water) 2,1 Theo bảng phân loại dược chất của BCS thì gliclazidđược xếp vào nhóm 2 có tính tan kém và tính thấm tốt Do đó có thể chiết

tách GLI trong dịch sinh học bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng với dungmôi hưu cơ Trong môi trường acid hấp thụ mật độ quang ở bước sóng 230

nm, môi trường bazơ là 263 nm [11], [25], [30]

Chỉ định

- Gliclazid được chỉ định trong đái tháo đường không phụ thuộc insulin typ 2

mà chế độ ăn kiêng đơn thuần không kiểm soát được glucose huyết

- Gliclazid dùng cho người cao tuổi bị đái tháo đường

Chống chỉ định

- Đái tháo đường phụ thuộc insulin typ 1

- Hôn mê hay tiền hôn mê do đái tháo đường

- Suy gan nặng, suy thận nặng

- Có tiền sử dị ứng với sulfonamid và các sulfonylurea khác

- Phối hợp với viên miconazol

- Nhiễm khuẩn nặng hoặc chấn thương nặng, phẫu thuật lớn

Một số phản ứng ADR có thể xảy ra khi dùng thuốc

● Thường gặp, ADR > 1/100:

- Thần kinh trung ương: Đau đầu.

- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, buồn nôn

- Thần kinh trung ương: Trạng thái lơ mơ, vã mồ hôi

- Tim mạch: Tăng tần số tim

- Da: Tái xanh

- Tiêu hóa: Nôn, đói cồn cào

1.2.2 Một số chế phẩm gliclazid giải phóng chậm có trên thị trường.

Trên thị trường chế phẩm gliclazid có nhiều loại biệt dược khác nhau dướinhiều dạng bào chế khác nhau Hiện nay các dạng thuốc qui ước trong nước sảnxuất khá nhiều, các dạng thuốc giải phóng chậm đã và đang nghiên cứu sản xuất

Bảng 1.1: Tóm tắt một số chế phẩm gliclazid có trên thị trường

2 Diamicron MR

(gliclazid 30 mg)

Viên nén bao phim VN-0456-06

Les Laboratories Servier Industrie (Pháp)

Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng được tóm tắtnhư sau:

Bảng 1.2: Tóm tắt một số phương pháp định lượng Gliclazid bằng phương pháp HPLC.

mL dicloromethan lắc, ly tâm 2900 g/10 phút Cô N 2

45 0 C Cắn + 400 L PĐ, lắc + 1 mL hexan, lắc, ly tâm

mL chloroform, lắc 1 phút.

Ly tâm 3000 vòng/15 phút.

Cô N 2 40 0 C Cắn hoà tan trong 100 L pha động.

mL benzen-isopropanol (98:2) Lắc vortex 2 phút Ly tâm 5 phút, tốc độ 2000 vòng/phút Lấy 4 mL dung môi cô N 2 60 0 C Phần còn lại hoà tan trong 0,16 mL MeCN.

- Phương pháp 4: Quy trình xử lý mẫu tương đối đơn giản : chiết lỏng– lỏng trong môi trường acid yếu nhưng sử dụng dung môi độc hại (benzen)

vì vậy không nên sử dụng

- Phương pháp 5: Có độ nhậy cao, giá trị LLOQ rất nhỏ 2,5 ng/mL,song sử dụng detector khối phổ là một phương pháp mới với thiết bị hiện đại

đắt tiền chưa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, thông tin

về phương pháp còn chưa đầy đủ

Trên cơ sở tham thảo các phương pháp định lượng đã được công bố,chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng GLI trong huyết tươngNTN bằng HPLC với detector PDA

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TĐSH Ở TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.3.1 Trên thế giới

Đánh giá SKD và TĐSH được thực hiện từ nhiều thập kỷ trước, ở cácnước có nền công nghiệp Dược phát triển như Canada, Mỹ, Pháp, Đức,Indonesia, Malaysia, Philippin và một số nước trong khu vực Mỗi quốc giakhi quy định thử nghiệm đều ban hành các hướng dẫn nghiên cứu và quy chếtrong quản lý Tuy nhiên các hướng dẫn chung thì rất phổ biến, những hướngdẫn cho các dạng thuốc cụ thể thì chưa có nhiều Trong đó, Mỹ là quốc giađầu tiên thực hiện luật bản quyền trong sản xuất dược phẩm và quy định rõviệc cấp phép lưu hành cho thuốc generic Cho đến nay cơ quan quản lýthuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) đã ban hành nhiều qui chế và hướng dẫn choviệc nghiên cứu và cấp phép lưu hành thuốc Các qui chế của Mỹ qui địnhkhá rõ ràng về hồ sơ cần đệ trình khi đăng ký sản xuất và lưu hành các loạithuốc, cũng như các trường hợp thay đổi sau khi cấp phép Đồng thời FDAcũng ban hành các tài liệu mang tính chất hướng dẫn kỹ thuật cho việc thựchiện nghiên cứu như hướng dẫn về thẩm định phương pháp nghiên cứu,hướng dẫn về xử lý và bảo quản mẫu sinh học và xem xét miễn thử SKD vàTĐSH in vivo cho các thuốc dạng rắn [15], [18], [19], [35] Dược điển Mỹban hành chuyên luận " Hướng dẫn nghiên cứu tương đương sinh học in vivo

", kèm theo quy trình thử cho một số chế phẩm cụ thể, trong đó có 2 thuốcgiải phóng chậm (Diclofenac và Pentoxyphillin)[25]

Gần đây ở ASEAN, việc đánh giá TĐSH đã trở thành yêu cầu cấp thiết vàđược thực hiện trong một số năm qua Các nước này đưa ra quy chế đăng kýthuốc trong nước và một số thuốc nước ngoài xin lưu hành đều phải trình kếtquả đánh giá TĐSH Sự gia tăng các thuốc generic trên thị trường cũng là mộttrong những yếu tố quan trọng thôi thúc các nhà quản lý của Bộ Y tế tìm ramột biện pháp để lựa chọn các thuốc generic có tương đương điều trị dùngtrong lâm sàng Trên thực tế, nghiên cứu của các nước ASEAN cũng thực hiệntrên chế phẩm qui ước, và hiếm có nghiên cứu trên chế phẩm giải phóng chậm.

Ở Châu Âu, năm 1987 đã có hướng dẫn về nghiên cứu SKD (Investigation

of Bioavailability), năm 1991 quy định chính thức đầu tiên về nghiên cứu SKD

Một số nước châu Á như Hàn Quốc, Trung quốc cũng đưa ra nhữnghướng dẫn cho việc thử nghiệm SKD và TĐSH nhưng bằng tiếng địa phương.Dược điển Trung quốc đã đưa ra quy trình thử TĐSH cho thuốc giải phóngchậm [28]

Chi phí đánh giá TĐSH của thuốc trên người tình nguyện khá tốn kém.Theo thống kê của FDA, thực hiện đánh giá một chế phẩm có thể chi phí từ

10.000 đến 100.000 USD Vì vậy người ta quy định cụ thể những trường hợpcần thử in vivo, nhất là thử trên người tình nguyện.

1.3.2 Trong nước [7], [9], [10], [11].

Ở nước ta, khái niệm TĐSH mới được phổ biến trong vài năm trở lạiđây, chưa có văn bản chính thức quy định về đánh giá SKD và TĐSH Năm

2008, bản Hướng dẫn thực hành tốt thử thuốc trên lâm sàng (GCP) đã được

ban hành (số 799/2008/QĐ-BYT) là tài liệu hướng dẫn chi tiết về đảm bảovấn đề đạo đức trong nghiên cứu thực hiện trên người Đồng thời kèm theoquyết định số 2626, ngày 17/05/2008, Bộ Y tế cũng ban hành quy chế hoạtđộng của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Bản quy chế nàyquy định cụ thể các hoạt động của hội đồng theo chuẩn mực GCP hiện hành.Trong thời gian gần đây, trường đại học Dược Hà Nội đã thực hiện một

số nghiên cứu bào chế dạng phóng thích kéo dài: bào chế viên Nifedipin,Salbutamol, Ketoprofen, Theophylin… Một số nghiên cứu khác về tươngđương điều trị cũng đã bước đầu đề cập đến như nghiên cứu đánh giá tươngđương điều trị của chế phẩm Rifampicin, Omeprazol Trường đại học Y –

Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã thực hiện nghiên cứu "Thiết kế và tối ưu

hóa công thức viên nén gliclazid 30 mg phóng thích kéo dài" trên cơ sở khóa

luận tốt nghiệp dược sĩ đại học nên mới chỉ so sánh công bằng phương phápthử độ hòa tan, chưa có đánh giá một cách đầy đủ trên in vivo [7] Nhữngnghiên cứu này đã góp phần tích cực trong đào tạo đội ngũ cán bộ nghànhDược có thêm kiến thức về SKD và TĐSH Kết quả có ý nghĩa lớn trong đàotạo, nhưng còn hạn chế về thực tiễn đánh giá sản phẩm thuốc; các quy định vềGCP (trong pha lâm sàng) cũng như GLP (trong phân tích) chưa được ápdụng và tuân thủ một cách đầy đủ Với chế phẩm TDKD, chưa có một nghiêncứu đặc biệt nào được áp dụng để đánh giá về ảnh hưởng của thức ăn hoặcđánh giá ở trạng thái ổn định

Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương là đơn vị đầu tiên triển khai thựchiện nghiên cứu đánh giá TĐSH một cách chính quy theo yêu cầu của nhànước Việc tiếp cận với phương pháp nghiên cứu, tài liệu hướng dẫn, chuẩn bị

cơ sở vật chất đã được thực hiện từ năm 2003 Cho đến nay một số nghiêncứu đã được thực hiện, có thể theo yêu cầu cơ quan quản lý để xem xét cấpphép lưu hành hoặc một số nghiên cứu khác theo yêu cầu của chính doanhnghiệp nhằm tự đánh giá chất lượng thuốc của mình như Công ty Cổ phầnDược Hậu Giang, Công ty Cổ phần Dược Imexpharm

Trước nhu cầu hội nhập và mục tiêu tăng cường đảm bảo chất lượngthuốc, Cục quản lý Dược đang soạn thảo ban hành danh mục các thuốc yêu cầuphải cung cấp dữ liệu về SKD và TĐSH khi cấp phép lưu hành Danh mục này

đã được gửi lấy ý kiến của các doanh nghiệp trong và ngoài nước đang kinhdoanh dược phẩm tại Việt nam Do đó thuốc tác dụng kéo dài đều bắt buộcphải có kết quả đánh giá SKD và TĐSH khi cấp phép lưu hành Chính vì vậy,việc đánh giá TĐSH cho chế phẩm giải phóng chậm là cần thiết

Phần 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

Bảng 2.4: Các mẫu huyết tương trắng đã sử dụng

01 H1510073147 Viện huyết học – truyền máu TW 15/10/2009 -40 0 C

02 H1510073184 Viện huyết học – truyền máu TW 15/10/2009 -40 0 C

03 H1510073185 Viện huyết học – truyền máu TW 15/10/2009 -40 0 C

04 H1010072056 Viện huyết học – truyền máu TW 10/10/2009 -40 0 C

05 H1010071034 Viện huyết học – truyền máu TW 10/10/2009 -40 0 C

06 215/13993 Viện huyết học – truyền máu TW 14/06/2009 -40 0 C

Bảng 2.5: Các dung môi và hóa chất sử dụng trong phương pháp phân tích

- Trong đánh giá TĐSH hai chế phẩm viên nén gliclazid 60 mg: Sử dụngcác mẫu huyết tương của NTN sau khi uống thuốc thử hoặc thuốc đối chứng.

- Thuốc thử: Viên nén Glidin (Gliclazide controlled release tablets 60 mg)

- Thuốc đối chứng: Diamicron® MR (Gliclazide 30 mg)

SKS: 797982 Ngày sản xuất: 08/2007 Hạn dùng: 08/2010

Nơi sản xuất: Công ty Les Laboratories Servier – France

Địa chỉ: 905, route de Saran 45520 Gidy – Pháp

Số đăng ký Việt Nam: VN-0465-06

Mô tả: Viên nén hình thuôn dài, màu trắng Một mặt khắc logo của hãngLes Laboratoires Servier (2 hình tam giác và 1 dấu hoa thị), một mặt khắc chữDIA 30 Đóng gói 30 viên/vỉ, 2 vỉ trong hộp carton có in nhãn Trên nhãn hộp và

vỉ có ghi tên thuốc, hàm lượng, nơi sản xuất, số lô, ngày sản xuất và hạndùng

- Cả hai thuốc dùng trong nghiên cứu đã được kiểm tra chất lượng theophiếu kiểm nghiệm số 38N 35 và 38N 36, hàm lượng gliclazid trong chếphẩm Glidin: 97,1% và Diamicron®MR: 97,4 % Kết quả kiểm tra chất lượngcho thấy hàm lượng của hai thuốc khác nhau không quá 5%

2.1.2 Thiết bị

Sử dụng các thiết bị phân tích của Trung tâm Đánh giá Tương đươngsinh học, Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương Tất cả các thiết bị đều đượcbảo trì, hiệu chuẩn định kỳ hàng năm theo đúng quy định của GLP và ISO.

Bảng 2.6: Các thiết bị đã sử dụng trong phương pháp phân tích.

Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 – 16K, Đức

Tủ lạnh sâu – 40 0C Sanyo MDF – 236, Nhật

Ống ly tâm thuỷ tinh thể tích 15 mL Sartorius, Đức

Đầu típ cho micropipet Eppendorf, Đức

Bình định mức, pipet class A Prolabo, Pháp

Bảng 2.7: Thiết bị HPLC Shimadzu.

Phần mềm điều khiển và xử lý kết quả Shimadzu LC Solution Shimadzu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.2.1.1 Khảo sát lựa chọn nội chuẩn

Dựa trên nguyên tắc chất nội chuẩn cho vào chất cần phân tích với mục đích làm giảm sai số trong quá trình sử lý mẫu đến quá trình phân tích Do vậy chất nội chuẩn phải có công thức phân tử tương tự như chất phân tích, tính chất lý hóa tương

tự nhau để trong quá trình xử lý chiết, tách, chạy sắc ký dễ dàng hơn

2.2.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-VIS.Trên cơ sở lựa chọn 2 loại cột C18 có sẵn là Phenomenex và Lichrospher.Chương trình sắc ký được xây dựng trên chuẩn GLI trong pha động và tronghuyết tương nhằm khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp:

- Khảo sát lựa chọn bước sóng cho detector PDA

- Khảo sát thành phần pha động, pH

- Khảo sát tốc độ dòng

- Khảo sát thể tích tiêm mẫu

2.2.1.3 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu

Khảo sát trên mẫu chuẩn GLI hòa tan trong pha động, mẫu huyết tương trắng

và mẫu thử tự tạo GLI nồng độ 2,5 µg/mL chuẩn trong huyết tương trắng (nồng độ xấp xỉ Cmax)

- Dung dịch chuẩn gốc: Nồng độ chính xác khoảng 1,0 mg/mL GLI trongMeOH

- Dung dịch chuẩn làm việc (10µg/mL): Lấy 1,0 mL dung dịch chuẩn gốc,bốc hơi dung môi (400C, khí N2) Hòa tan cắn trong 10,0 mL huyết tương trắng

- Mẫu chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng

để thu được các mẫu chuẩn có nồng độ GLI từ 0,2 – 2,5 µg/mL

- Mẫu chuẩn trong pha động: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng trongpha động được dung dịch GLI nồng độ 2,5 µg/mL

Tiến hành khảo sát theo các phương pháp sau:

a) Phương pháp kết tủa protein [5]

Nguyên lý của phương pháp: Các mẫu dung dịch động vật (máu, huyết

tương, nước tiểu ) thường chứa protein cản trở cho việc phân tích cácchất Do vậy, người ta thường dùng kỹ thuật kết tủa loại protein trước khiphân tích

Các tác nhân gây tủa protein: Khảo sát trên 2 loại dung môi hưu cơ:

Acetonitril, methanol

Quy trình tủa protein: Hút (0,5 – 1 mL) mẫu thử, thêm tác nhân gây tủa

protein thích hợp Lắc xoáy, ly tâm lấy dịch trong (10000 vòng/5 phút) Tiêmsắc ký

b) Phương pháp chiết lỏng – lỏng [5]

Nguyên lý của phương pháp: Chiết lỏng - lỏng là một phương pháp phân

tách dùng trong xử lý mẫu để tách riêng chất cần phân tích ra khỏi các tạp cótrong nền mẫu, dựa trên sự khác nhau về tính tan trong hai pha chất lỏngkhông trộn lẫn, thông thường là pha nước và pha dung môi hữu cơ Kỹ thuậtchiết lỏng - lỏng là kỹ thuật cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm hoá học,dùng để chiết hoạt chất từ pha lỏng này vào pha lỏng kia

Dung môi chiết: Khảo sát trên các loại dung môi sau: n-hexan,

chloroform, dichloromethan, hỗn hợp chloroform MeCN, dichloromethan ether với tỷ lệ thích hợp

-Quy trình chiết lỏng - lỏng: Hút (0,5 – 1 mL) mẫu thử, thêm dung môi

chiết thích hợp (5-10 mL) Lắc cơ học, ly tâm lấy dịch chiết dung môi (4-5mL) Bốc hơi dung môi (t0C/ khí nitơ) thu được cắn Hòa tan trong pha động.Tiêm sắc ký

c) Phương pháp chiết pha rắn (Rắn – lỏng) [5]

Nguyên lý của phương pháp: Chiết pha rắn (Solid-phase extraction-SPE) là

một phương pháp phân tách dùng trong xử lý mẫu để tách riêng chất cần phântích ra khỏi các tạp có trong nền mẫu, dựa trên sự khác nhau về ái lực của chấtcần phân tích và các tạp với pha động dạng lỏng và pha tĩnh dạng rắn Các tạptrong mẫu sẽ được rửa giải để loại đi trong khi chất cần phân tích được lưu giữlại trên pha tĩnh hoặc ngược lại Sau đó, chất phân tích được lưu giữ trên pha rắn

sẽ được rửa giải ra khỏi cột chiết pha rắn bằng dung môi thích hợp

Lựa chọn cột chiết pha rắn: Tiến hành khảo sát trên cột Strata -X-C Quy trình chiết pha rắn:

Hoạt hoá cột: 3 mL MeOH x 2 lần

3 mL nước

3 mL đệm phosphat pH 3,0 Dung môi loại tạp: 3 mL đệm phosphat pH 3,0

dẫn về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học FDA [13], [28],

[29], [31], [34] để đảm bảo nghiên cứu là phù hợp

- Mẫu trắng: Huyết tương trắng không chứa GLI

- Mẫu thử: Huyết tương NTN sau khi uống GLI

- Mẫu QC: Chuẩn bị tương tự như các mẫu chuẩn Mẫu QC chuẩn bị từdung dịch chuẩn gốc độc lập với dung dịch chuẩn gốc để pha mẫu chuẩn

Nồng độ mẫu LQC (0,45 µg/mL), MQC (2,40 µg/mL), HQC (5,40 µg/mL).

2.2.2.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký bằng cách tiêm dung dịchphân giải của GLI nồng độ 2,5 µg/mL và IS nồng độ 40 µg/mL trong phađộng Hệ số phân giải giữa hai pic GLI và IS không được nhỏ hơn 2 Tiêm 6lần dung dịch phân giải, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic GLI và ISphải nhỏ hơn 2%

2.2.2.2 Đánh giá độ chọn lọc - đặc hiệu của phương pháp

Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu

có nguồn gốc khác nhau, Huyết tương trắng có pha nội chuẩn (IS), Huyếttương trắng có pha chuẩn GLI ở nồng độ LLOQ và IS

Yêu cầu: Pic của GLI phải được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi

các pic tạp có trong mẫu Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thờigian lưu của GLI không được vượt quá 20% đáp ứng của GLI ở nồng độLLOQ Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của ISkhông được vượt quá 5% đáp ứng của IS

2.2.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Mối quan hệ giữa đáp ứng pic (diện tích pic) với nồng độ của GLI đượcđánh giá bằng phương pháp bình phương tối thiểu và được biểu hiện quaphương trình hồi quy tuyến tính Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từthấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính

- Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Giới hạn định lượng dưới thể hiện độ nhậy, độ chính xác, độ đúng củaphương pháp Tham khảo một số tài liệu, nồng độ GLI cực đại trong máu Cmax

khoảng 2,5 µg/mL khi dùng liều 60 mg Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn GLItrong huyết tương ở nồng độ khoảng 0,08 – 0,25 µg/mL (1/30 -1/10 Cmax) với

6 mẫu độc lập Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành

trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu LLOQ Xác định độ đúngcủa phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực cótrong mẫu Xác định độ chính xác bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trịcác lần định lượng

Yêu cầu: Đáp ứng của mẫu LLOQ phải gấp 5 lần đáp ứng của mẫu trắng

tại cùng thời gian lưu Độ đúng phải bằng 80% – 120% so với nồng độ thực

Độ chính xác thể hiện bằng giá trị CV% khi tiến hành phân tích trên ít nhất 5mẫu LLOQ độc lập phải nhỏ hơn hoặc bằng 20%

Bảng 2.8: Cách chuẩn bị đường chuẩn

Yêu cầu: Độ lệch so với giá trị thực của các nồng độ phải ≤ 15%, trừ tại

điểm LLOQ được chấp nhận ≤ 20% Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩnđạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêuchuẩn Hệ số tương quan r ≥ 0,98

2.2.2.4 Xác định độ đúng và độ chính xác

– Độ đúng (accuracy): giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích

với giá trị thực của mẫu đã biết Tiến hành trên 3 nồng độ LQC, MQC vàHQC, mỗi nồng độ làm 6 mẫu

– Độ chính xác (precision): là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt

khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất,được biểu thị bằng giá trị CV (%) Tiến hành trên 3 nồng độ LQC, MQC vàHQC, mỗi nồng độ làm 6 mẫu

Độ chính xác bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày

Xác định nồng độ của mẫu kiểm tra (QC):

Bảng 2.9: Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương

Mẫu QC Code Khoảng xác định (µg/mL) Nồng độ

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp LQC ≤ 3 x LLOQ 0,45Mẫu kiểm tra nồng độ trung

Gần điểm giữa của

Mẫu kiểm tra nồng độ cao HQC 75% - 90% ULOQ 4,50

Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùngđiều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC Xác định độ đúng của phươngpháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu.Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trịcác lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày Xác

định độ lặp lại khác ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lầnđịnh lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau

Yêu cầu: Độ đúng tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85% đến

115% Độ lặp lại trong ngày: Giá trị CV% phải ≤ 15% Độ lặp lại giữa các

ngày: Giá trị CV% phải ≤ 15%

2.2.2.5 Tỉ lệ thu hồi của phương pháp

Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lômẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập Song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn phatrong dung môi pha mẫu có nồng độ tương ứng, tiến hành chiết tách như mẫu QC.Xác định tỉ lệ thu hồi của IS và GLI bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của IS

và GLI trong các mẫu QC với đáp ứng của IS và GLI trong mẫu chuẩn pha trongdung môi pha mẫu Tỉ lệ thu hồi được tính theo công thức:

% 100 (%)  

C

T

S

S H

Trong đó:

- ST: Diện tích pic IS, GLI hòa tan trong huyết tương

- SC: Diện tích pic IS, GLI hòa tan trong dung môi pha mẫu

Yêu cầu: Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỉ lệ thu hồi

không quá 110% và không thấp hơn 30% Giá trị CV% giữa các đáp ứng của IS

và giữa các đáp ứng của chất phân tích trong các mẫu QC ở mỗi nồng độ phảinhỏ hơn hoặc bằng 15% Tỉ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ không khácnhau quá  15%

2.2.2.6 Khảo sát độ ổn định

a) Độ ổn định dung dịch chuẩn GLI gốc và IS

Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

Phân tích, so sánh 3 mẫu có nồng độ khác nhau của dung dịch chuẩn

GLI gốc và IS sau khi để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (lần

lượt là 6 giờ) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng Nồng độdung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới phakhông quá 2%

Độ ổn định dài ngày

Phân tích, so sánh 3 mẫu có nồng độ khác nhau của dung dịch chuẩnGLI gốc và IS sau khi bảo quản ở nhiệt độ -40 0C những khoảng thời giannhất định (1, 2 và 4 ngày với dung dịch GLI gốc; 1, 7, 22 và 50 ngày vớidung dịch IS) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng Nồng độdung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới phakhông quá 2%

b) Độ ổn định của mẫu huyết tương

Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã

Khảo sát độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độLQC và HQC, mỗi nồng độ làm tối thiểu 5 mẫu Chia làm 2 phần, mã hóa vàghi nhãn Phần 1 tiến hành định lượng ngay lấy kết quả ban đầu Phần 2 tiếnhành để 3 chu kỳ đông – rã

- Chu kỳ 1: Mẫu LQC, HQC sau khi chuẩn bị song, để đông 24 giờ trong

tủ bảo quản - 400 C, lấy ra để tan chảy hoàn toàn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

- Chu kỳ 2: Sau đó để trở lại vào tủ bảo quản trong vòng 24 giờ, lấy ra đểtan chảy hoàn toàn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

- Chu kỳ 3: Tương tự, để đông – rã tiếp

Sau 3 chu kỳ đông – rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ GLI cótrong mẫu So sánh với kết quả xác định nồng độ GLI có trong các mẫu tiếnhành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu) Nồng độ GLI trong mẫusau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % vàgiá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặcbằng 15 %

Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC, mỗi nồng độ làmtối thiểu 5 mẫu, sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhấtđịnh (6 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông Nồng

độ GLI trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ởnhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% vàgiá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặcbằng 15%

Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

Khoảng thời gian thử nghiệm độ ổn định dài ngày tối thiểu phải đủ đểtiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tương của ngườitình nguyện Dự kiến đánh giá trên 20 NTN, thời gian thải trừ hết thuốc từgiai đoạn I sang giai đoan II là 10 ngày, tiến hành khảo sát độ ổn địnhtrong 75 ngày Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ởnhiệt độ -400C, mỗi nồng độ tối thiểu 5 mẫu, phân tích mẫu tại thời điểmban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định So sánh nồng

độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thờiđiểm ban đầu Nồng độ GLI trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhấtđịnh phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị CV% giữacác kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15 %

Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)

So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC, mỗi nồng độ làm tốithiểu 5 mẫu, bảo quản trong auto-sampler sau một thời gian xác định và nồng

độ của mẫu tiêm ngay sau xử lý Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gianxác định trong auto-sampler sai khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơnhoặc bằng 15%

2.2.3 Đánh giá tương đương sinh học chế phẩm gliclazid

2.2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu chéo, ngẫu nhiên, 2 thuốc, 2 trình tự, 2 giai đoạn, đơn liều và

đa liều (6 liều liên tục), trên người tình nguyện khoẻ mạnh trong tình trạngđói Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn là 10 ngày

Trình tự (nhóm) Giai đoạn I Giai đoạn II

Trong đó: A – thuốc thử, B – thuốc đối chứng

2.2.3.2 Tuyển chọn người tình nguyện

- Đánh giá chung về tình hình sức khoẻ, khám tổng quát về tim mạch,tiêu hoá, thần kinh, huyết áp, nhịp thở, tất cả phải trong giới hạn bình thường

- Các chỉ số xét nghiệm đều phải trong giới hạn bình thường Xét nghiệmmáu bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hematocrit; Xétnghiệm sinh hoá lâm sàng bao gồm: AST(GOT), ALT(GPT), ure, creatinine,glucose

- Xét nghiệm kháng thể HIV và kháng nguyên viêm gan B phải âm tính.c) Tiêu chuẩn loại trừ

- NTN nghiện ma tuý, rượu hoặc thuốc lá