- Thuốc thử: Viên nén Glidin (Gliclazide controlled release tablets 60mg)
2.2.1.3. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
Khảo sát trên mẫu chuẩn GLI hòa tan trong pha động, mẫu huyết tương trắng và mẫu thử tự tạo GLI nồng độ 2,5 µg/mL chuẩn trong huyết tương trắng (nồng độ xấp xỉ Cmax).
- Dung dịch chuẩn gốc: Nồng độ chính xác khoảng 1,0 mg/mL GLI trong MeOH.
- Dung dịch chuẩn làm việc (10µg/mL): Lấy 1,0 mL dung dịch chuẩn gốc, bốc hơi dung môi (400C, khí N2). Hòa tan cắn trong 10,0 mL huyết tương trắng. - Mẫu chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để thu được các mẫu chuẩn có nồng độ GLI từ 0,2 – 2,5 µg/mL.
- Mẫu chuẩn trong pha động: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng trong pha động được dung dịch GLI nồng độ 2,5 µg/mL.
Tiến hành khảo sát theo các phương pháp sau: a). Phương pháp kết tủa protein [5]
Nguyên lý của phương pháp: Các mẫu dung dịch động vật (máu, huyết tương, nước tiểu...) thường chứa protein cản trở cho việc phân tích các chất. Do vậy, người ta thường dùng kỹ thuật kết tủa loại protein trước khi phân tích.
Các tác nhân gây tủa protein: Khảo sát trên 2 loại dung môi hưu cơ: Acetonitril, methanol.
Quy trình tủa protein: Hút (0,5 – 1 mL) mẫu thử, thêm tác nhân gây tủa protein thích hợp. Lắc xoáy, ly tâm lấy dịch trong (10000 vòng/5 phút). Tiêm sắc ký.
b). Phương pháp chiết lỏng – lỏng [5]
Nguyên lý của phương pháp: Chiết lỏng - lỏng là một phương pháp phân tách dùng trong xử lý mẫu để tách riêng chất cần phân tích ra khỏi các tạp có trong nền mẫu, dựa trên sự khác nhau về tính tan trong hai pha chất lỏng không trộn lẫn, thông thường là pha nước và pha dung môi hữu cơ. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm hoá học, dùng để chiết hoạt chất từ pha lỏng này vào pha lỏng kia.
Dung môi chiết: Khảo sát trên các loại dung môi sau: n-hexan, chloroform, dichloromethan, hỗn hợp chloroform - MeCN, dichloromethan - ether với tỷ lệ thích hợp.
Quy trình chiết lỏng - lỏng: Hút (0,5 – 1 mL) mẫu thử, thêm dung môi chiết thích hợp (5-10 mL). Lắc cơ học, ly tâm lấy dịch chiết dung môi (4-5 mL). Bốc hơi dung môi (t0C/ khí nitơ) thu được cắn. Hòa tan trong pha động. Tiêm sắc ký.
c). Phương pháp chiết pha rắn (Rắn – lỏng) [5].
Nguyên lý của phương pháp: Chiết pha rắn (Solid-phase extraction-SPE) là một phương pháp phân tách dùng trong xử lý mẫu để tách riêng chất cần phân tích ra khỏi các tạp có trong nền mẫu, dựa trên sự khác nhau về ái lực của chất cần phân tích và các tạp với pha động dạng lỏng và pha tĩnh dạng rắn. Các tạp trong mẫu sẽ được rửa giải để loại đi trong khi chất cần phân tích được lưu giữ lại trên pha tĩnh hoặc ngược lại. Sau đó, chất phân tích được lưu giữ trên pha rắn sẽ được rửa giải ra khỏi cột chiết pha rắn bằng dung môi thích hợp.
Lựa chọn cột chiết pha rắn: Tiến hành khảo sát trên cột Strata -X-C.
Quy trình chiết pha rắn:
Hoạt hoá cột: 3 mL MeOH x 2 lần 3 mL nước
3 mL đệm phosphat pH 3,0 Dung môi loại tạp: 3 mL đệm phosphat pH 3,0
3 mL nước
1 mL MeOH x 2 lần
Dung môi rửa giải: 1 mL MeOH chứa NH4OH 1% (v/v) x 3 lần