- Thuốc thử: Viên nén Glidin (Gliclazide controlled release tablets 60mg)
2.2.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Mối quan hệ giữa đáp ứng pic (diện tích pic) với nồng độ của GLI được đánh giá bằng phương pháp bình phương tối thiểu và được biểu hiện qua phương trình hồi quy tuyến tính. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính.
- Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Giới hạn định lượng dưới thể hiện độ nhậy, độ chính xác, độ đúng của phương pháp. Tham khảo một số tài liệu, nồng độ GLI cực đại trong máu Cmax
khoảng 2,5 µg/mL khi dùng liều 60 mg. Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn GLI trong huyết tương ở nồng độ khoảng 0,08 – 0,25 µg/mL (1/30 -1/10 Cmax) với 6 mẫu độc lập. Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành
trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu LLOQ. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu. Xác định độ chính xác bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng.
Yêu cầu: Đáp ứng của mẫu LLOQ phải gấp 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại cùng thời gian lưu. Độ đúng phải bằng 80% – 120% so với nồng độ thực. Độ chính xác thể hiện bằng giá trị CV% khi tiến hành phân tích trên ít nhất 5 mẫu LLOQ độc lập phải nhỏ hơn hoặc bằng 20%.
- Khoảng tuyến tính
Sau khi xác định được giới hạn định lượng (LLOQ) tiến hành khảo sát khoảng nồng độ 0,16 – 5,4 µg/mL như sau:
- Dung dịch chuẩn gốc GLI trong MeOH có nồng độ chính xác khoảng 1,0 mg/mL.
- Dung dịch chuẩn làm việc GLI trong huyết tương có nồng độ chính xác khoảng 5,4 µg/mL.
- Dung dịch nội chuẩn Glibenclamid trong MeOH có nồng độ 40 µg/mL. Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết tương trắng có pha nội chuẩn (zero) và 09 mẫu huyết tương có pha chuẩn GLI và nội chuẩn.
Bảng 2.8: Cách chuẩn bị đường chuẩn
Nồng độ (µg/mL) Blank Zero 0,16 0,33 0,54 0,95 1,63 2,71 4,10 4,80 5,40 V chuẩn làm việc (µL) 0 0 30 60 100 175 300 500 750 900 1000 VHuyết tương trắng(µL) 1000 1000 970 940 900 825 700 500 250 100 0 V nội chuẩn (µL) 50 (MeOH) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Yêu cầu: Độ lệch so với giá trị thực của các nồng độ phải ≤ 15%, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận ≤ 20%. Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn. Hệ số tương quan r ≥ 0,98.