Nghiên cứu tương đương sinh học của viên Azithromycin 250mg sản xuất tại Việt nam

Chương 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC .................................................................. 3 1.1.1. Sinh khả dụng (Bioavailability) ....................................................... 3 1.1.2. Tương đương sinh học .................................................................... 3 1.1.3. Tình hình nghiên cứu TĐSH ở Việt nam và thế giớ ........................ 5 1.1.3.1. Trên thế giớ ............................................................................... 5 1.1.3.2. Trong nướ .................................................................................. 6 1.1.4. Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh họ ........ 7 1.1.4.1. Chế phẩm cần và không cần đánh giá TĐS .............................. 8 1.1.4.2. Phương pháp DĐH đánh giá TĐS ............................................ 9 1.1.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học ........ 12 1.1.4.4. Phân tích số liệu và đánh giá TĐSH ....................................... 13 1.1.5. Sinh khả dụng của thuốc dạng rắn ................................................ 14 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ AZITHROMYCI ........................................................................................................................ 14 1.2.1. Tính chất lýhoá của Azithromy .................................................... 14 1.2.2. Tính chất dược lý và dược động họ ............................................... 15 1.2.3. Một số chế phẩm chứa AZI trên thị trườn ..................................... 17 1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng Azithromycin trong dịch sinh họ .......... 18 1.2.4.1.Định lượng AZI bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC........ 18 1.2.4.2. Các phương pháp khác ngoài sử dụng sắc .............................. 20

Sau một thời gian thực hiện, luận văn “Nghiên cứu tương đương sinh học của viên Azithromycin 250mg sản xuất tại Việt nam” đã hoàn thành.

Ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi

đã nhận được sự khích lệ rất nhiều từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bèbạn đồng nghiệp

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Trường ĐH Dược HàNội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tậptại Trường

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Kiều Anh,

người đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúptôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Việt Hùng, người đã rất nhiệt tình

hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Tạ Mạnh Hùng và Ban giám đốc cùng toàn thể cán bộ, nhân viên Trung tâm Tương đương sinh học-Viện

Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, nơi tôi thực hiện đề tài, đã tạo điều kiện vàgiúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám đốc Sở y tế vả Trung tâm Kiểm nghiệm Bắc Kạn, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp,

đã động viên khích lệ và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập và nghiêncứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2009

Hà Thị Xuân

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 3

1.1.1 Sinh khả dụng (Bioavailability) 3

1.1.2 Tương đương sinh học 3

1.1.3 Tình hình nghiên cứu TĐSH ở Việt nam và thế giới 5

1.1.3.1 Trên thế giới 5

1.1.3.2 Trong nước 6

1.1.4 Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 7

1.1.4.1 Chế phẩm cần và không cần đánh giá TĐSH 8

1.1.4.2 Phương pháp DĐH đánh giá TĐSH 9

1.1.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 12

1.1.4.4 Phân tích số liệu và đánh giá TĐSH 13

1.1.5 Sinh khả dụng của thuốc dạng rắn 14

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ AZITHROMYCIN 14

1.2.1 Tính chất lý-hoá của Azithromycin 14

1.2.2 Tính chất dược lý và dược động học 15

1.2.3 Một số chế phẩm chứa AZI trên thị trường 17

1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng Azithromycin trong dịch sinh học 18

1.2.4.1.Định lượng AZI bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 18

1.2.4.2 Các phương pháp khác ngoài sử dụng sắc ký 20

1.3.1 Nguyên tắc 20

1.3.2 Máy khối phổ 21

1.3.2.1 Bộ nạp mẫu (Inlet) 21

1.3.2.2 Bộ nguồn ion (Ion source) 21

1.3.2.3 Bộ phân tích khối (Mass Analyzer) 21

1.3.2.4 Detector 22

1.3.2.5 Bộ xử lý dữ liệu (Data System) 23

1.3.3 Một số kỹ thuật LC-MS 23

Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 24

2.1.1 Dược phẩm 24

2.1.2 Hoá chất - chất chuẩn 24

2.1.3 Thiết bị 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1.Phương pháp phân tích Azithromycin trong huyết tương 25

2.2.2.Thẩm định phương pháp phân tích Azithromycin trong huyết tương .27

2.2.2.1.Tính chọn lọc (Selectivity) 27

2.2.2.2.Khoảng nồng độ tuyến tính 27

2.2.2.3 Độ đúng 28

2.2.2.4 Độ lặp lại của phương pháp 28

2.2.2.5 Giới hạn định lượng (Limit of quantification-LOQ) 28

2.2.2.6 Hiệu suất chiết 29

2.2.2.7 Độ ổn định của hoạt chất 29

2.2.3 Đánh giá tương đương sinh học 29

2.2.3.1 Chọn người tình nguyện 29

2.2.3.2 Phương pháp thăm dò SKD in vivo 30

2.2.3.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá TĐSH 30

2.2.3.5 Lấy mẫu 31

2.2.3.6 Theo dõi NTN trong thời gian thử thuốc 32

2.2.4 Phân tích số liệu thực nghiệm 32

2.2.4.1 Xác định các thông số DĐH 32

2.2.4.2 Đánh giá tương đương sinh học 32

Chương 3: KẾT QUẢ 34

3.1 TỐI ƯU HOÁ ĐIỀU KIỆN KHỐI PHỔ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG AZI TRONG HUYẾT TƯƠNG .34

3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG 35

3.2.1 Tính chọn lọc- đặc hiệu 35

3.2.2 Đánh giá tính phù hợp của hệ thống 39

3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 40

3.2.4 Xác định LOD, LOQ của phương pháp 41

3.2.5 Độ đúng của phương pháp 42

3.2.6 Độ lặp lại 43

3.2.7 Xác định hiệu xuất chiết của phương pháp 43

3.2.8 Độ ổn định của Azithromycin trong huyết tương theo thời gian bảo quản .45

3.3 KHẢO SÁT SINH KHẢ DỤNG CỦA VIÊN AZITHROMYCIN 250mg 47

3.4 ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 49

3.4.1 Xây dựng đường cong dược động học của các NTN 49

3.4.2.1 Phân tích số liệu AUC0- 57

Chương 4: BÀN LUẬN 62

4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH AZI TRONG HUYẾT TƯƠNG 62

4.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AZI TRONG HUYẾT TƯƠNG 63

4.3 VỀ ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 67

4.3.1 Phương pháp nghiên cứu TĐSH 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm (Food and Drug Administration)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Perfomance Liquid

Chromatography)

HQC : Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High Quality Control Sample)

IS : Nội chuẩn (Internal Standard)

LC-MS : Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography- Mass

Spectrometry)

LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification)

LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LQC ; Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control Sample)

PA :Tinh khiết phân tích (Pure for Analysis)

ROXI : Roxithromycin

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SKD : Sinh khả dụng

S/N : Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

STT : Số thứ tự

TĐSH : Tương đương sinh học

T max : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa

ULOQ : Giới hạn định lượng trên (Upper limit of Quantification)

USP : Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopoeia)

WHO : Tổ chức y tế thế giới (Word Health Organization)

Bảng 1.1 Một số chế phảm chứa Azithromycin trên thị trường 17 Bảng 1.2 Một số phương pháp định lượng AZI trong dịch sinh học

bằng HPLC 18

Bảng 2.1 Bố trí NTN uống thuốc 31 Bảng 3.1 Các thông số của detector khối phổ dùng để định tính, định

lượng AZI và ROXI 34

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống LC-MS 39 Bảng 3.3 Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI trong

huyết tương 40

Bảng 3.4 Kết quả xác định độ đúng của phương pháp phân tích 42 Bảng 3.5 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp 43 Bảng 3.6 Kết quả xác định hiệu suất chiết nội chuẩn trong huyết tương 44 Bảng 3.7 Kết quả xác định hiệu suất chiết 45 Bảng 3.8 Kết quả xác định độ ổn định của hoạt chất trong mẫu phân

tích được bảo quản ở T0 = -400C 46

Bảng 3.10 Nồng độ của AZI trong huyết tương của NTN sau khi uống 2

viên chế phẩm thử (khảo sát chương trình lấy mẫu) 48

Bảng 3.11 Các thông số dược động học của Azi trong huyết tương

NTN sau khi uống 2 viên chế phẩm thử (khảo sát chương trình lấy mẫu) 48

Bảng 3.12 Nồng độ hoạt chất trong huyết tương NTN 14 sau khi uống

2 viên chế phẩm thử và 2 viên chế phẩm đối chiếu 51Bảng 3.13 Các thông số dược động học của Azithromycin ở NTN 14 sau

khi uống 2 viên chế phẩm thử và 2 viên chế phẩm đối chiếu 52

tình nguyện 53

Bảng 3.15 Nồng độ AZI (ng/mL) trong huyết tương của 14 người tình

nguyện sau khi uống 2 viên chế phẩm đối chứng 54

Bảng 3.16 Kết quả các thông số dược động học dùng cho phân tích

thống kê 56

Bảng 3.17 Giá trị log10 của các thông số DĐH dùng cho phân tích

phương sai 57

Bảng 3.18 Phân tích phương sai đối với AUC0- 57

Bảng 3.19 Kết quả phân tích phương sai đối với Cmax 59

Bảng 3.20 So sánh giá trị Tmax theo phương pháp thống kê không

tham số 60

Bảng 4.1 Thông số DĐH đối với Azithromycin sau khi uống liều

500mg Azithromycin trong các tài liệu công bố 68

Hình 1.1 Sơ đồ khối của máy khối phổ 21

Hình 1.2 Sơ đồ bộ tứ cực chập ba 22

Hình 2.1 Qui trình xử lý mẫu trong huyết tương 26

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng 36

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng chứa chuẩn AZI (m/z = 591,6) 37

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng chứa chuẩn ROXI (m/z=158,2) 37

Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng chứa chuẩn AZI và ROXI, AZI (tR= 2,90 phút, m/z = 591,6) và ROXI (tR = 2,60 phút, m/z =158,2) 38

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic AZI/IS và nồng độ AZI trong HT 41

Hình 3.6 Sắc ký đồ định lượng AZI trong huyết tương NTN 14 sau khi uống 2 viên chế phẩm đối chiếu tại thời điểm 2 giờ 50

Hình 3.7 Sắc ký đồ định lượng AZI trong huyết tương NTN 14 sau khi uống 2 viên chế phẩm thử tại thời điểm 2 giờ 50

Hình 3.8 Đường cong dược động học ở NTN 14 sau khi uống 2 viên chế phẩm thử và 2 viên chế phẩm đối chiếu 52

Hình 3.9 Đường cong dược động học của Azithromycin của 14 NTN uống 2 viên chế phẩm thử hoặc 2 viên chế phẩm đối chứng 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự phát triển nhanh chóng của nền công nghiệp Dược Việt Nam trongthời gian gần đây làm nảy sinh khá nhiều vấn đề về chất lượng thuốc Do đó,việc quản lý chất lượng thuốc ngày càng chặt chẽ hơn và thu hút nhiều hơn sựquan tâm của xã hội Một trong những vấn đề được quan tâm nhiều nhất, đó

là tương đương sinh học (TĐSH)

Tương đương sinh học được sử dụng để chỉ các sản phẩm cùng dạngbào chế, chứa một lượng dược chất như nhau và có sinh khả dụng tương tựtrong cùng điều kiện thử nghiệm Trên thực tế, nhiều chế phẩm thuốc có cùnghoạt chất, cùng dạng bào chế nhưng tốc độ và mức độ hấp thu vào tuần hoànlại khác nhau nên tác dụng điều trị không hoàn toàn giống nhau Chất lượngnguyên liệu, thành phần tá dược và kỹ thuật bào chế là những yếu tố có nhiềuảnh hưởng tới sự hấp thu của thuốc Trong quá trình phát triển sản phẩm,đánh giá TĐSH là một trong những phương pháp thường được sử dụng để lựachọn công thức và kỹ thuật bào chế Kết quả đánh giá TĐSH là bằng chứng

về hiệu quả điều trị của thuốc và làm cơ sở cho việc lựa chọn và thay thếthuốc trong lâm sàng Dựa vào kết quả đánh giá TĐSH, nhà sản xuất có thể tựkhẳng định chất lượng đích thực cho sản phẩm của mình; nhà quản lý có cơ

sở để xem xét, thẩm định khi cấp giấy phép lưu hành và thầy thuốc có thêmcác thông tin về dược động học để lựa chọn, thay thế thuốc trong điều trị

Sau hàng loạt các nghiên cứu, các bộ phận đăng ký thuốc ở các nướcphát triển lớn như Mỹ [45], Úc [15] hoặc Châu Âu [43]… nhận thấy rằngTĐSH là cách thích hợp nhất để chứng tỏ sự tương thích trị liệu giữa thuốcgeneric và thuốc phát minh

Hiện nay, tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng kháng sinh rất lớn Một trongcác loại kháng sinh đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị là Azithromycin

(AZI) Chế phẩm kháng sinh Azithromycin được cung cấp bởi nhiều doanhnghiệp dược phẩm trong nước và ngoài nước, với nhiều dạng bào chế khácnhau như: viên nang, viên nén, viên phân tán, thuốc bột, hỗn dịch uống…Trong đó, viên nang là dạng chế phẩm đã được các doanh nghiệp Việt Namsản xuất và lưu hành với tỉ trọng lớn Tuy nhiên, về giá cả, có sự chênh lệchrất lớn giữa các chế phẩm của Việt Nam và ngoại nhập Do tính đa dạng kếthợp với tính phổ biến trong sử dụng Azithromycin ở nước ta, chúng tôi thấyviệc đánh giá TĐSH cho chế phẩm này là rất cần thiết

Để so sánh chất lượng của chế phẩm Azithromycin sản xuất trong nướcvới chế phẩm thuốc nước ngoài có cùng hoạt chất có uy tín trên thị trường,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tương đương sinh học của

viên Azithromycin 250mg sản xuất tại Việt Nam”.

Mục tiêu của đề tài là:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích Azithromycin trong huyết tương nhằm ứng dụng để nghiên cứu tương đương sinh học.

2 Đánh giá tương đương sinh học của viên nang Azithromycin 250mg sản xuất trong nước so sánh với viên nén Zitromax 250mg của hãng dược phẩm Pfizer-Bỉ.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

1.1.1 Sinh khả dụng (Bioavailability) 5, 6, [21], [25]

Sinh khả dụng (SKD) là đặc tính biểu thị mức độ và tốc độ hấp thu củamột dược chất hoặc nhóm chất còn nguyên hoạt tính từ dạng bào chế vào hệđại tuần hoàn và đưa đến nơi tác dụng

Mức độ hấp thu được phản ánh bằng diện tích dưới đường cong nồngđộ-thời gian (AUC: Area Under Curve) AUC cho biết tổng lượng dược chấtđược hấp thu từ dạng bào chế vào hệ tuần hoàn

Tốc độ hấp thu được phản ánh bởi thời gian thuốc đạt cực đại (Tmax) vànồng độ cực đại của thuốc (Cmax) trong máu

Có 2 cách đánh giá SKD in vivo: SKD tương đối và SKD tuyệt đối,

trong đó SKD tương đối được dùng nhiều hơn trong nghiên cứu phát triển cácsản phẩm generic

1.1.2 Tương đương sinh học [25], [47], [46]

Hai chế phẩm được coi là TĐSH nếu chúng là những chế phẩm tươngđương bào chế, chứa một lượng dược chất như nhau, được dùng với liều nhưnhau và có SKD tương tự trong cùng điều kiện thử nghiệm

TĐSH là cơ sở cho việc lựa chọn và thay thế thuốc trong lâm sàng Haichế phẩm đạt TĐSH có thể được sử dụng thay thế nhau trong điều trị Kết quảđánh giá TĐSH khẳng định chất lượng đích thực của thuốc

Để đánh giá TĐSH của một thuốc, người ta dùng 4 phương pháp sau:

- Phương pháp Dược động học

- Phương pháp Dược lực học

- Thử nghiệm lâm sàng

- Thử độ hoà tan in vitro.

Trong đó phương pháp Dược động học (DĐH) được dùng phổ biến nhất để đánh giá TĐSH cho các thuốc tác dụng toàn thân, giải phóng thuốc vào hệ tuần hoàn Nội dung chính của phương pháp này

là dựa vào các thông số DĐH trung bình thu được từ nhiều cá thể Phương pháp này thường được bố trí theo 2 mô hình: mô hình chéo

và mô hình song song 21, 25 Trong mỗi mô hình có thể tiến hành nghiên cứu theo thử nghiệm đơn liều hoặc đa liều.

♦ Mô hình nghiên cứu chéo

+ Chéo 2 thuốc, 2 giai đoạn : áp dụng khi cần so sánh 1 thuốc thử với 1thuốc chứng Người tình nguyện (NTN) được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm,

2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Nhóm 1 sử dụng thuốc thử, nhóm 2 sử dụng thuốc chứng

Giai đoạn 2: Nhóm 2 sử dụng thuốc thử, nhóm 1 sử dụng thuốc chứng

+ Chéo 3 thuốc, 3 giai đoạn: Áp dụng khi so sánh 2 thuốc thử A, B với

1 thuốc chứng NTN được chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm, 3 giai đoạn

Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3

Ưu điểm: Mỗi nhóm NTN đều uống thuốc thử và thuốc chứng nên hạn

chế ảnh hưởng của yếu tố cá thể

Số NTN tham gia nghiên cứu ít nên tiết kiệm được kinh phí, nhân lực

Nhược điểm: Thời gian nghiên cứu kéo dài, NTN có thể bỏ giữa chừng

nên ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu

♦ Mô hình nghiên cứu song song: NTN được chia thành 2 nhóm.

Nhóm 1: Sử dụng thuốc thử

Nhóm 2: Sử dụng thuốc chứng

Ưu điểm: Thời gian nghiên cứu ngắn nên mô hình này thích hợp khi thuốc có

thời gian bán thải kéo dài

Nhược điểm: Do mỗi nhóm chỉ sử dụng 1 thuốc nên khó đánh giá được ảnh

hưởng của cá thể NTN, của quá trình dùng thuốc Vì vậy số NTN phải nhiều

để loại bớt ảnh hưởng của cá thể

1.1.3 Tình hình nghiên cứu TĐSH ở Việt nam và thế giới

1.1.3.1 Trên thế giới

Đánh giá TĐSH được thực hiện từ nhiều thập kỷ trước, ở các nước vàkhu vực có nền công nghiệp Dược phát triển như Canada, Mỹ [46], Pháp,Đức, Australia [15], Châu Âu 43 … và các nước trong khu vực như Thái lan[42], Indonesia [33], Singapore [40], Philippines, Malaysia, Trung quốc 36đều có quy chế đánh giá SKD và TĐSH Tại Mỹ, từ năm 1962, cơ quan Quản

lý thuốc và thực phẩm (FDA) [21], [46] đã nghiên cứu, xem xét lại tính hiệuquả của gần 3400 chế phẩm thuốc đã được xét duyệt và lần đầu tiên thuật ngữ

“Sinh khả dụng” được dùng để đánh giá, so sánh thuốc nghiên cứu với thuốc

đối chiếu Hướng dẫn thử TĐSH in vivo đã được ghi trong Dược điển Mỹ

45, trong đó có hướng dẫn thử TĐSH in vivo cho một số thuốc cụ thể và

những trường hợp có thể miễn thử TĐSH in vivo.

Ở các nước Châu Âu, năm 1987 đã có hướng dẫn về nghiên cứu SKD(Investigation of Bioavailability), năm 1991 ra quy định chính thức đầu tiên

về nghiên cứu SKD và TĐSH

Nhằm tạo sự thống nhất trong khối EU về đánh giá hiệu quả điều trịcủa thuốc, tháng 6/2001 Uỷ ban về các chế phẩm thuốc độc quyền (CPMP)thuộc cơ quan Châu Âu đánh giá thuốc đã ban hành hướng dẫn về nghiên cứuSKD và TĐSH 22

1.1.3.2 Trong nước

Ở nước ta, khái niệm TĐSH mới được phổ biến trong vài năm trở lạiđây, chưa có văn bản chính thức quy định về đánh giá TĐSH Trong hồ sơ xinxét duyệt thuốc sản xuất trong nước chưa yêu cầu có số liệu đánh giá SKD và

TĐSH, riêng thuốc giải phóng có kiểm soát yêu cầu đánh giá TĐSH in vivo.

Hiện nay, Cục quản lý Dược Việt Nam, Trung tâm đánh giá TĐSH kết hợpvới một số đơn vị và các nhà khoa học đang soạn thảo quy chế đánh giáTĐSH ở Việt Nam

Khoảng 3-5 năm trở lại đây, những nghiên cứu về lĩnh vực này đã đượcquan tâm nhiều hơn Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu cũng mới chỉ thựchiện tại các Trường Đại học và một số Viện nghiên cứu với mục đích đào tạo

1, 2, [10], [12], [11], [13] Việc ứng dụng các quy trình phân tích cũng nhưtiến hành các đánh giá thử nghiệm còn hạn chế Nguyên nhân là do chưa cóquy chế, hướng dẫn; cán bộ chưa được đào tạo chuyên sâu Mặt khác, nồng

độ thuốc trong các dịch sinh học thường rất thấp, nên đòi hỏi phải có cácphương tiện phân tích hiện đại, có độ nhạy cao Phòng thí nghiệm phải đượcquản lý theo tiêu chuẩn thực hành tốt phòng thí nghiệm (GLP) và ISO để đảmbảo kết quả nghiên cứu có độ tin cậy

Từ các nghiên cứu thu được, chúng tôi nhận thấy một số thuốc của ViệtNam sản xuất không thua kém về SKD so với chế phẩm nổi tiếng cùng loạicủa nước ngoài Ví dụ: viên nang Cefaclor 250mg của Stada 10, Viên nénbao film Vigentin 500mg/125mg của Xí nghiệp Dược phẩm TW I 1…, cácchế phẩm nghiên cứu đều TĐSH với chế phẩm đối chiếu, nhưng giá thànhchênh lệch nhau gấp 10 lần, thậm chí 30-40 lần Về giá bán cũng đúng vớitrường hợp chế phẩm Azithromycin, trong khi viên Zithromax® 250mg củaPfizer giá 80.000-90.000đ/viên, viên Usmax 250mg của Dong in DangPharmaco (Hàn Quốc) giá khoảng 34.000đ/viên…thì viên Azimax 250mg củaStada hoặc viên Azithromycin 250mg của Công ty Traphaco giá chỉ khoảng

Do đó đánh giá SKD và TĐSH của chế phẩm Azithromycin nói riêng

và các thuốc của Việt Nam sản xuất nói chung so với chế phẩm đối chiếu làmột việc làm hết sức cần thiết nhằm mục đích phục vụ người bệnh nhữngthuốc chất lượng cao, giá cả hợp lý, phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam,đồng thời thúc đẩy nhà sản xuất không ngừng nâng cao chất lượng để sảnphẩm của mình có tính cạnh tranh cao

1.1.4 Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

Tổ chức Y tế thế giới, hiệp hội các nước Đông Nam Á, và một số nước

đã có ban hành tài liệu hướng dẫn, quy định chung cho việc đánh giá SKD vàTĐSH [21], [22], [33], [36], [40], [45]

Nói chung, các nghiên cứu SKD và TĐSH in vivo phải tuân thủ theo

các qui chế GCP; GLP và phải đảm bảo vấn đề đạo đức trong khi tiến hành.Nghiên cứu chỉ được bắt đầu khi được sự chấp thuận của Hội đồng đạo đức[43], [45], [46]

Hội đồng đạo đức (HĐĐĐ) bao gồm các chuyên gia đầu ngành, cácnhà khoa học độc lập với nhóm nghiên cứu, bác sỹ lâm sàng và người đạidiện cho quyền lợi của NTN Hội đồng được thành lập để đảm bảo nghiên

cứu đánh giá SKD và TĐSH nếu được tiến hành, sẽ tuân thủ đầy đủ “đạo đức trong nghiên cứu Y-Sinh học” Hội đồng xem xét các khía cạnh đạo đức và

khoa học của nghiên cứu như mục đích, sự cần thiết phải tiến hành nghiêncứu; tính khoa học của đề cương nghiên cứu; sự đảm bảo quyền lợi và cácbiện pháp phòng ngừa các nguy cơ có thể xảy ra đối với NTN của nhómnghiên cứu…Vì vậy, trước khi tiến hành đánh giá SKD và TĐSH, nhómnghiên cứu phải xây dựng đề cương nghiên cứu, nộp đơn xin đánh giá SKD

và TĐSH lên thường trực HĐĐĐ

Ngoài vấn đề đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu, các qui định, hướng dẫn

về đánh giá SKD và TĐSH bao gồm những nội dung cơ bản và cụ thể sau:

1.1.4.1 Chế phẩm cần và không cần đánh giá TĐSH 43

♦ Các chế phẩm cần đánh giá TĐSH

- Dạng thuốc uống giải phóng nhanh

+ Thuốc cần đảm bảo hiệu quả điều trị

+ Khoảng điều trị hoặc khoảng an toàn hẹp (chỉ số điều trị nhỏ hơn 2) + DĐH phức tạp do hấp thu, DĐH không tuyến tính, chuyển hoá cao (lớnhơn 70%), đào thải trước khi vào máu

+ Tính chất hoá lý của hoạt chất không thuận lợi: độ tan thấp, tính thấmkém, kém bền vững

+ Thuốc có vấn đề về SKD do cấu trúc hoặc do công thức bào chế

+ Tỷ lệ tá dược quá nhiều so với hoạt chất

- Thuốc tác dụng toàn thân đưa vào cơ thể qua các đường khác nhau như qua

- Thuốc dạng khí

- Thuốc dạng bột để pha thành dung dịch tiêm hoặc uống

- Thuốc nhỏ mắt, tai dạng dung dịch nước có cùng nồng độ, hoạt chất

và cùng các tá dược chính

- Các thuốc hít, xịt mũi có cùng hoạt chất, nồng độ và tá dược chính,cách sử dụng giống nhau

1.1.4.2 Phương pháp DĐH đánh giá TĐSH

Dựa vào các thông số DĐH để đánh giá TĐSH giữa chế phẩm thử vàchế phẩm đối chiếu Gồm 6 nội dung:

 Chọn mô hình thử nghiệm 45

Nghiên cứu cần được thiết kế sao cho có thể phân biệt được ảnh hưởngcủa thuốc với các ảnh hưởng khác Trong đánh giá TĐSH cần chọn mô hìnhthử nghiệm phù hợp Mô hình hay được lựa chọn để đánh giá TĐSH là bố tríchéo đôi, hai giai đoạn (cross over design, two sequences, two treatments)

Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn phải đủ dài để liều đã dùng ở giai đoạntrước được thải loại hết trước khi dùng liều sau Thời gian này thường đượctính ít nhất bằng 5 lần thời gian bán thải (T1/2) của dược chất

Thông thường nghiên cứu liều đơn có thể đủ để đánh giá TĐSH, nhưngmột số trường hợp nghiên cứu ở trạng thái ổn định, nên sử dụng thuốc theochế độ thường dùng đã được khuyến cáo:

- Động học không tuyến tính, đặc biệt có bão hoà liên kết với proteinhuyết tương

- Thuốc có tác dụng kéo dài

- Thuốc có quá trình hấp thu thay đổi nhiều theo cá thể

- Thuốc có khoảng điều trị hẹp

- Thuốc phối hợp nhiều thành phần nhưng tỷ lệ giữa các thành phần

khác nhau nhiều

Số lượng người tình nguyện (NTN) cần thiết được xác định dựa vào:

- Biến thiên do sai số liên quan tới các tính chất cơ bản của dược chất,ước tính được từ thí nghiệm thăm dò, từ các nghiên cứu trước đó hoặc tài liệu

đã công bố

- Mức ý nghĩa thống kê công bố

- Độ lệch mong muốn so với thuốc đối chứng phù hợp với TĐSH

Tuy nhiên, số lượng NTN (cỡ mẫu) trong nghiên cứu TĐSH thườngđược sử dụng là 18, 24, 30 hoặc 36, thấp nhất không ít hơn 12

 Chọn đối tượng nghiên cứu [45]

Đối tượng nghiên cứu trong đánh giá TĐSH là người tình nguyện thửthuốc, chế phẩm nghiên cứu và chế phẩm đối chiếu.

Chọn người tình nguyện

Người tình nguyện phải được lựa chọn sao cho có thể hạn chế đến mứctối thiểu sự biến thiên và cho phép phát hiện được sự khác nhau giữa cácthuốc Do đó thường lựa chọn NTN khoẻ mạnh dùng cho nghiên cứu SKD vàTĐSH Nên chọn người tình nguyện đáp ứng các yêu cầu:

- NTN phải khoẻ mạnh đồng nhất, chênh lệch trong khoảng 10% vềchiều cao, 15% về trọng lượng

- Độ tuổi: 18-50 tuổi

- Không hút thuốc lá, không nghiện rượu và ma tuý

- Không dị ứng với thuốc cần nghiên cứu

- Nếu là nữ không được có thai

- Kiểm tra sức khoẻ: đạt các yêu cầu về thể trạng, tiền sử bệnh tật, cácphép thử lâm sàng, cận lâm sàng

- Người tình nguyện phải tuân thủ nghiêm ngặt các quy định của thửnghiệm và các điều kiện thử nghiệm

Chế phẩm nghiên cứu

Chế phẩm nghiên cứu để đánh giá TĐSH phải đảm bảo các yêu cầu:

- Được sản xuất theo tiêu chuẩn GMP

- Chế phẩm nghiên cứu cần giống với chế phẩm đang lưu hành

- Mẫu nghiên cứu lấy từ lô sản xuất công nghiệp, nếu lấy từ lô sản xuấtthử thì lô này không dưới 10% cỡ lô của sản xuất chuẩn

- Độ hoà tan và hàm lượng hoạt chất không được khác nhau quá 5%.Nếu có thì phải hiệu chỉnh cho các thông số phụ thuộc vào liều để dễ so sánhđánh giá

Chế phẩm đối chiếu

Chế phẩm đối chiếu phải là loại phát minh cùng loại

Chế phẩm phát minh là những chế phẩm bản quyền được cấp phép lưu

thông trên cơ sở có đủ hồ sơ nghiên cứu về hoá học, sinh học, bào chế, dược

lý, độc chất, thử lâm sàng

Hiện nay chưa có quy định rõ ràng về chế phẩm đối chiếu, do đó sự lựachọn tuỳ thuộc vào từng quốc gia Một số tiêu chuẩn thường được dùng đểxem xét, lựa chọn chế phẩm đối chiếu:

- Là thuốc chiếm vị trí chủ yếu trên thị trường nước đó

- Thuốc được cấp phép đầu tiên

Với trường hợp đánh giá SKD tương đối, nếu thuốc gây độc khôngtiêm được tĩnh mạch thì dùng dung dịch uống Nếu vì hạn chế độ tan khôngpha được dung dịch thì dùng hỗn dịch tiêm bắp hoặc uống, hay các dạngthuốc rắn khác như bột, nang…

 Các thông số DĐH dùng cho đánh giá TĐSH

Đánh giá TĐSH thường dựa trên cơ sở đo nồng độ dược chất trong cácdịch sinh học như máu, nước tiểu, nước bọt, huyết tương…Phổ biến nhất là sửdụng các thông số DĐH trong huyết tương như AUC, Cmax, Tmax để đánh giáTĐSH

Chế phẩm thử T được coi là TĐSH với chế phẩm đối chiếu R nếu:

R

T AUC

C

C  ln 1,25

 Chương trình lấy mẫu và uống thuốc

Cần xây dựng một chương trình lấy mẫu phù hợp để có thể thu đượcđường cong DĐH phản ánh đúng mức độ hấp thu và thải trừ của thuốc.

- Uống thuốc

Người tình nguyện tham gia thử thuốc cần tuân thủ các quy định sau:

- Trong khoảng thời gian thích hợp trước và trong quá trình thử nghiệmkhông được uống các thuốc khác, và không được dùng thức ăn và đồ uống cótác động lên chức năng tuần hoàn, tiêu hoá, gan và thận

- Người tình nguyện được phân ngẫu nhiên vào nhóm uống thuốc đốichiếu hoặc thuốc nghiên cứu Uống thuốc với 240mL nước ấm Nếu cần uốngnước thêm phải đợi 1 giờ sau khi uống thuốc

Trong và sau giai đoạn thử nghiệm, việc theo dõi sức khoẻ người tìnhnguyện phải do bác sĩ có chuyên môn đảm nhiệm

- Chương trình lấy mẫu

Chương trình lấy mẫu phải được thiết lập sao cho có thể ước lượngtương đối chính xác giá trị Cmax và thu được đường cong nồng độ thuốc tronghuyết tương theo thời gian đủ để ước lượng chính xác mức độ hấp thu Thờigian lấy mẫu đáp ứng khi giá trị AUC0-t ítnhất bằng 80% AUC0- Số lượngmẫu thử phải đủ đặc trưng cho pha hấp thu và pha thải trừ Vì vậy thường xâydựng đường cong DĐH tối thiểu đến thời gian bằng 3 lần thời gian bán thải.Nếu thử đơn liều theo phương pháp thiết kế chéo thì thường lấy 12-15 mẫu(theo quy định của Dược điển Mỹ [45]), bao gồm 3 điểm ở pha hấp thu, 3điểm ở xung quanh Tmax, 6 điểm ở pha thải trừ

1.1.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 45, 38

Phân tích hàm lượng dược chất trong dịch sinh học là phương phápđánh giá SKD trực tiếp và chính xác Mẫu sinh học thường chứa nhiều tạpchất, lượng mẫu ít và nồng độ chất phân tích thường thấp Do vậy, phươngpháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phântích mẫu Đây là nội dung quan trọng có tính quyết định độ chính xác củakết quả đánh giá TĐSH Nội dung và các phương pháp thẩm định được

hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và trong các D ược điển [37], [46],gồm các chỉ tiêu:

+ Tính đặc hiệu (specificity)

+ Độ đúng (accuracy)

+ Độ chính xác (precision)

+ Khoảng nồng độ tuyến tính

+ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

+ Hiệu suất chiết

+ Độ ổn định của hoạt chất trong điều kiện bảo quản và xử lý mẫu

1.1.4.4 Phân tích số liệu và đánh giá TĐSH 45, [21], [18], [5]

* Phân tích thống kê

Phương pháp thống kê để xác định SKD tương đối là xác định khoảngtin cậy 90% tỷ lệ các giá trị trung bình giữa chế phẩm thử và chế phẩm đốichiếu, với các thông số cần quan tâm

Thông số dược động học được tính toán từ nồng độ như AUC,Cmax đượcphân tích chuyển dạng logarit cơ số 10 hoặc cơ số e Riêng với Tmax khôngchuyển dạng logarit, được xử lý theo phương pháp thống kê phi tham số

Phân tích phương sai được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của cácnguồn biến thiên như: trình tự, giai đoạn, cá thể, chế phẩm đến kết quả Vớicác thông số dược động học được đề cập, ngoài khoảng tin cậy 90% dùng để

so sánh 2 chế phẩm, cần đưa thêm các giá trị thống kê trung bình, giá trị tốithiểu và giá trị tối đa

* Khoảng chấp nhận đối với các thông số dược động học

- Với AUC và Cmax: Khoảng tin cậy 90% cho giá trị SKD tương đốiphải trong khoảng 0,80-1,20, hoặc ln 0,80-ln1,25

+ Đối với các chế phẩm có khoảng điều trị hẹp, khoảng chấp nhận phảinhỏ hơn

+ Một số trường hợp, chấp nhận khoảng tin cậy lớn hơn (70%-145%)nhưng cần xem xét các dữ liệu lâm sàng

- Các thông số khác:

Giá trị Tmax có thể đánh giá, tuy nhiên giá trị so sánh này chỉ có ý nghĩakhi cần công bố các thông tin liên quan đến lâm sàng như thuốc tác dụngnhanh hay tác dụng bất lợi của thuốc

Trong các nghiên cứu SKD tương đối, có thể đánh giá một số thông sốDĐH khác như Cmin, độ dao động, T1/2 nếu cần

1.1.5 Sinh khả dụng của thuốc dạng rắn [6]

Thuốc dạng rắn (viên nén, viên nang…) là những dạng thuốc được sửdụng rộng rãi nhất trong lâm sàng Trong thực tế, các dạng thuốc rắn thường

có vấn đề về SKD, nhất là các chế phẩm chứa dược chất ít tan Khi vào cơthể, nó trải qua các giai đoạn giải phóng, hoà tan, hấp thu và thải trừ

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến SKD của thuốc dạng rắn như: đặc tính

lý hoá của dược chất, tá dược, kỹ thuật bào chế và các yếu tố của người dùng.Muốn làm tăng SKD của thuốc dạng rắn, ta phải chú ý đến những yếu tố trên

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ AZITHROMYCIN [4] [8], [9], [19], [32], [45]

1.2.1 Tính chất lý-hoá của Azithromycin

8 9 10 12

14 15

- Công thức phân tử: C38H72N2O12.2H2O

- Trọng lượng phân tử: 785,02

- Tên khoa học: Methyl-aza-11-Desoxo-10 homoerythromycin A

Trong cấu trúc của AZI không có dây nối đôi liên hợp và các nhóm

mang màu nên nó hấp thụ UV kém, đây là điều khó khăn để định lượng AZItrong dịch sinh học.

- Nguồn gốc: Macrolid bán tổng hợp từ Erythromycin A, trong đó đưathêm vào khung 1N (Macrolid 15 nguyên tử, là cấu trúc chưa phát hiện thấytrong thiên nhiên)

 Tính chất [44], [8]

√ Tính chất vật lý:

- Bột kết tinh màu trắng, hoặc trắng ngà, không mùi, vị đắng

- Thực tế khó tan trong nước; dễ tan trong một số dung môi hữu cơ:methanol, ethanol, diethyl ether, cloroform và dung dịch acid hydrocloric loãng

- Dung dịch 0,2% trong hỗn hợp methanol-nước (1:1) có pH là 9,0- 10,0

- Năng suất quay cực là -450 đến -490 (dung dịch 20mg/mL ethanol)

√ Tính chất hoá học:

- Tính base: do các osamin (đường amin) gây ra, pKa = 8,74

- Tạo muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ

- Phản ứng màu: Với các acid như HCl, H2SO4

1.2.2 Tính chất dược lý và dược động học [4], [14], [31]

 Dược động học

- Hấp thu: AZI hấp thu nhanh và SKD đường uống đạt khoảng 40%.

Azithromycin được hấp thu nhanh nhưng không hoàn toàn qua đường tiêuhoá, sinh khả dụng tuyệt đối của các dạng thuốc nằm trong khoảng 34%-52%,biến đổi tuỳ thuộc vào từng dạng bào chế (viên nang, viên nén, hỗn dịchuống) SKD của Azithromycin thấp chủ yếu do hấp thu tại ruột kém Thức ănlàm giảm hấp thu của Azithromycin khoảng 50% Sau khi uống liều 500 mg,nồng độ đỉnh huyết tương đạt tối đa khoảng 0,5µg/ml sau 3 giờ

- Phân bố: Phân bố rộng khắp cơ thể, chủ yếu vào các mô như phổi,

amidan, tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt và đại thực bào

- Chuyển hoá-thải trừ: Một lượng nhỏ AZI bị khử methyl trong gan,

được đào thải qua mật ở dạng không biến đổi và một phần ở dạng chuyển hoá.Azithromycin có thời gian bán thải là khoảng 55-56 giờ và chủ yếu được thảiqua phân, chỉ có 6% Azithromycin được thải trừ qua nước tiểu trong vòng 72giờ dưới dạng không chuyển hoá

 Cơ chế và tác dụng dược lý

- AZI tác động bằng cách gắn kết vào tiểu đơn vị 50S của ribosom và

qua đó ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn Nồng độ đỉnh trong huyếttương đạt được sau 2-3giờ

- AZI là một loại kháng sinh mới có hoạt phổ rộng, có tác dụng tốt trên

các vi khuẩn gram dương như Streptococcus, Pneumococcus, Staphylococcus aureus và một số vi khuẩn khác như Corynebacterium diphtheriae, Clostridium perfringens, Peptostre ptococcus và Propionibacterium acnes AZI có tác dụng tốt trên các vi khuẩn Gram âm như Haemophilus influenzae, Parain fluenzae, Ducreyi.

 Chỉ định

AZI được chỉ định dùng trong các trường hợp nhiễm khuẩn do các vikhuẩn nhạy cảm với thuốc

 Tác dụng không mong muốn

- Hay gặp nhất là chứng rối loạn tiêu hoá (khoảng 10%)

- Ảnh hưởng thính giác: nếu sử dụng lâu dài ở liều cao

♦ Liều lượng và cách dùng

AZI dùng một lần/ ngày, uống 1 giờ trước bữa ăn hoặc 2 giờ sau khi ăn Điều trị bệnh lây qua đường sinh dục: liều duy nhất 1g

Các chỉ định khác: ngày đầu tiên uống một liều 500mg và dùng 4 ngàynữa với liều đơn 250mg/ngày.

1.2.3 Một số chế phẩm chứa AZI trên thị trường [9]

Bảng 1.1 Một số chế phảm chứa Azithromycin trên thị trường

Tên

chế phẩm

Hãng

Bột uống

250 mg1,5gam/gói

Bột pha hỗn dịchViên nang

250 mg250mg

Azimax Imexpharm Viên nang

Viên bao phim

250 mg

500 mgAziphar Mekophar Viên nang

Viên bao phim

250 mg

500 mg

Nadymax CTCPDP 2/9 Viên nén dài bao phim

Gói bột uống

250 mg250mg

500mg

1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng Azithromycin trong dịch sinh học

1.2.4.1.Định lượng AZI bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Bảng 1.2 Một số phương pháp định lượng AZI trong dịch sinh học bằng

HPLC

Acquity UPLC

- Dung môi chiết: Diethyl ether.

- Pha động: MeCN– Amoni acetat 0,05M

- Chuẩn nội: ROXI.

10ng/mL-Điện hoá

người

Symmetry C18 (250 x 2,1mm;

- Dung môi chiết: Hexan

người

Chromegabond alkylphenol

- Pha động:

Điện hoá

Spheri-5 cyano (100 x 4,6mm;

5m), Norwark USA

- Dung môi chiết: Ethyl hexan (1:1).

acetat Pha động: MeCNacetat MeOHacetat đệm phosphat 0,04M (52: 9:39).

- Tốc độ dòng: 1mL/phút.

- Đường chuẩn: 40-800ng/mL

Điện hoá

HT người

Zorbax SBICN (150 x 4,6mm;

Nhận xét: Từ các tài liệu thu thập được, định lượng AZI trong huyết

tương có thể phát hiện bằng HPLC với detector huỳnh quang, điện hoá, khốiphổ Với detector huỳnh quang, AZI cần được dẫn chất hoá, đáp ứng phântích phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thời gian dẫn chất, môi trường phản ứng,nồng độ thuốc thử, do đó kết quả thu được không ổn định Detector điện hoá

và khối phổ có thể phát hiện trực tiếp AZI, nhưng giới hạn định lượng khidùng detector điện hoá không đáp ứng yêu cầu nghiên cứu TĐSH (LOQ=90ng/mL) Detector khối phổ định lượng nhanh, nhạy, tính chọn lọc cao, giớihạn định lượng thấp, rất phù hợp xác định các chất trong mẫu thử có nền mẫuphức tạp, đặc biệt là dịch sinh học Do đó chúng tôi sẽ sử dụng phương pháp

LC-MS trong nghiên cứu này.

1.2.4.2 Các phương pháp khác ngoài sử dụng sắc ký

- Phương pháp Cực phổ, mẫu thử là dịch sinh học [39]

- Phương pháp Vi sinh [17]: Pha loãng HT bằng ethanol (1:1), ủ ở 4oC, lytâm 12000 vòng/phút, lấy dịch nổi trên cô ở 55oC đến thể tích ban đầu của mẫu

Định lượng trong môi trường thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là Micrococcus luteus NCTC 8440, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,005 đến 1mg/L.

1.3 PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) 7

LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năngcao và phân tích khối phổ Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứngdụng rộng lớn trong phân tích

1.3.1 Nguyên tắc

Khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khốilượng và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặcnguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên

1.3.2 Máy khối phổ

1.3.2.1 Bộ nạp mẫu (Inlet)

Đưa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn phải chuyển mẫu sangdạng hơi bằng cách thích hợp Có thể nạp mẫu trực tiếp hoặc nối với đầu racủa một thiết bị phân tích khác như sắc ký khí, sắc ký lỏng siêu giới hạn(SFC), điện di mao quản (CE)

Hình 1.1 Sơ đồ khối của máy khối phổ

Hình 1.1 mô tả sơ đồ khối của một máy khối phổ, gồm 5 bộ phận sau:

1.3.2.2 Bộ nguồn ion (Ion source)

Ion hoá các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi, khửdung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suấtkhí quyển với bộ phận nằm trong chân không sâu, và rút ra ngoài các phân tửtrung hòa, ion khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo

Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạmelectron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ionhóa hóa học ở áp suất khí quyển, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp

Kỹ thuật sử dụng trong luận văn này là ion hóa bằng nguồn ion phunsương khử solvat hay gọi tắt là kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử -Electronspray ionization, ESI

1.3.2.3 Bộ phân tích khối (Mass Analyzer)

Tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tácdụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Có thể phân bộ phân tíchkhối thành 4 loại:

- Bộ phân tích từ (Magnetic Analyser)

- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)

- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser-TOF)

- Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance

Đề tài này chúng tôi sử dụng máy khối phổ có bộ phân tích khối là bộphân tích tứ cực chập ba

Bộ tứ cực chập ba (Triple Quadrupole Analyser): Bộ phân tích khối

gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau Bộ Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối,

bộ Q2 làm nhiệm vụ va chạm ion để phân tách thành các mảnh khối nhỏ hơn,

đó là ion con Sơ đồ bộ tứ cực chập ba được trình bày ở hình 1.2

Hình 1.2 Sơ đồ bộ tứ cực chập ba

Bộ phân tích tứ cực chập 3 còn được gọi là Tandem Mass Analyser Kỹthuật phân tích khối phổ kiểu này là khối phổ 2 lần (MS/MS) Kỹ thuật nàythường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗnhợp nhiều thành phần chưa được tinh chế sạch

1.3.2.4 Detector

Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng

hệ điện tử của máy khối phổ Hiện có 2 dạng truyền thống:

- Nhân electron (electron multiplier)

- Nhân quang (photomultiplier)

Trong luận văn này, bộ phận phát hiện ion là dạng nhân quang

1.3.2.5 Bộ xử lý dữ liệu (Data System)

Tín hiệu điện từ detector được khuyếch đại trước khi chuyển thành tínhiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, sosánh với thư viện phổ, định lượng

1.3.3 Một số kỹ thuật LC-MS

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN)

Cho đầy đủ thông tin về các chất phân tích trong mẫu hơn, tuy nhiênphương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theothời gian Kỹ thuật SIM nhạy hơn FULL SCAN từ 10 đến 100 lần tuỳ theothiết bị

- Kỹ thuật MS/MS

Trong kỹ thuật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phântích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion conđặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/MS được sử dụng đểtăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật MS/MS để địnhlượng AZI trong huyết tương

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Chất nội chuẩn: Chất chuẩn Roxithromycin của Viện Kiểm nghiệmthuốc Trung ương-Bộ Y tế, hàm lượng 98,98% C22H23N3O7S (khan); nước:0,39%; Số kiểm soát: WS 0107219

- Diethyl Ether, Methanol, Cloroform, Isopropanol, MeCN: loại tinhkhiết HPLC- Merck

- Amoni acetat, Amoniac : Loại tinh khiết phân tích-Merck

- Các nguyên liệu và hoá chất khác đều đạt tiêu chuẩn do các nguồn tincậy cung cấp theo yêu cầu của thực nghiệm

- Huyết tương trắng của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương

Số lô: H1510073147, H1510073184, H1510073185, H1010072056

2.1.3 Thiết bị

● Dụng cụ thiết bị dùng trong phân tích: Tất cả dụng cụ thiết bị đều

được chuẩn hoá theo ISO/IEC 17025-2005 và GLP bao gồm:

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Thermo: Bơm 700512kiểu gradient; Bộ phận tiêm mẫu tự động 750145; Máy sinh khí Nitơ có dunglượng 30L/phút; Detector LC-MS/MS TQUO 2112; Phần mềm điều khiển và

xử lý kết quả Software Multi-System Manager.

- Cân phân tích Sartorius CP-224S (d = 0,1mg; e = 0,1mg)

- Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2-16K

- Máy ly tâm thường Hermle

- Tủ lạnh sâu T0 = -400C, Sanyo MDF-236

- Tủ lạnh sâu (T0 = -800C) MDF-192

- Bộ bốc hơi dung môi sử dụng khí Nitơ

- Micropipet Eppendorf 1-10l, 10-100l, 100-1000l

- Ống nghiệm lấy máu chứa EDTA

- Bình định mức, dụng cụ thuỷ tinh đạt tiêu chuẩn (class A) dùng trongphân tích

● Dụng cụ thiết bị dùng trong lâm sàng (xét nghiệm, lấy mẫu máu

NTN):

- Các xét nghiệm lâm sàng thực hiện tại Bệnh viện Đống Đa-Hà Nội

- Các dụng cụ lấy mẫu: kim luồn, bơm tiêm và kim tiêm vô khuẩn

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Phương pháp phân tích Azithromycin trong huyết tương

- Chuẩn bị mẫu chuẩn :

Dung dịch chuẩn gốc Azithromycin : Cân một lượng chính xác

khoảng 25mg Azithromycin chuẩn cho vào bình định mức 50mL, hoà tan vàthêm Methanol vừa đủ đến vạch Từ dung dịch chuẩn gốc này, pha loãngthành các dung dịch có nồng độ khác nhau, từ các dung dịch này, pha tronghuyết tương trắng sao cho thu được mẫu huyết tương chứa Azithromycin cónồng độ từ 5ng/mL÷500ng/mL

Dung dịch chuẩn nội : Cân chính xác một lượng khoảng 25mg ROXI

chuẩn, cho vào bình định mức 50mL Hoà tan và thêm MeOH đến vạch Phaloãng đến nồng độ 250ng/mL

- Xử lý mẫu :

Azithromycin trong huyết tương được xử lý theo sơ đồ hình 2.1 :

Hình 2.1 Qui trình xử lý mẫu trong huyết tương

5 phút (4000v/ph)

+ 0,5mL NH4OH 0,05M Lắc xoáy 30 giây

Cắn khô

Dung dịch trongTiêm LC-MS/MS

Bay hơi dung môi bằng khí

Nitơ

+ 1mL pha động lắc xoáy

60 giâyHuyết tương 1,0mL

+ IS 0,05mL

+ Pha động: MeOH-IPA-COONH4 2mM-MeCN (5:1:1:3).

+ Tốc độ dòng 0,5 mL/phút

+ Thể tích tiêm mẫu: 25 L

+ Nội chuẩn: ROXI

- Điều kiện khối phổ: Sử dụng chế độ MS/MS với điều kiện khối phổ dựa

vào tối ưu hoá cụ thể trên máy

2.2.2.Thẩm định phương pháp phân tích Azithromycin trong huyết tương

2.2.2.1.Tính chọn lọc (Selectivity)

Tính chọn lọc-đặc hiệu là khả năng phân biệt các chất trong mẫu thửkhi tách và định lượng 2 thành phần trở lên trong một hỗn hợp chất Trongthực nghiệm này, tính chọn lọc-đặc hiệu của phương pháp được xác địnhbằng cách so sánh sắc đồ của 3 mẫu trắng và 3 mẫu thêm chuẩn AZI

Yêu cầu tại vị trí tương ứng thời điểm trùng với thời gian lưu của picAZI, kết quả phân tích của mẫu trắng không được xuất hiện pic

2.2.2.2.Khoảng nồng độ tuyến tính

Độ tuyến tính của phương pháp phân tích là sự tương quan giữa đápứng phân tích và nồng độ chất phân tích trong một khoảng nồng độ xác định

Nó được biểu thị bằng hệ số tương quan r

Trường hợp định lượng AZI trong huyết tương bằng LC-MS, dùngnội chuẩn, đáp ứng phân tích là tỷ số giữa diện tích pic của chất phân tích

và nội chuẩn

Mẫu huyết tương trắng được thêm AZI chuẩn sao cho có nồng độ từ1/10 đến 1/30 Cmax tới 2-3 lần Cmax (dự đoán) Thường làm từ 5-7 điểm nồng độcủa chất phân tích Mối tương quan giữa tín hiệu đáp ứng của pic (tỷ số diện tíchpic) và nồng độ AZI được biểu diễn bằng phương trình và hệ số tương quan hồiquy Yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương quan lớn hơn 0,99 và ít nhất 75%

số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có

nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêngđiểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%.

2.2.2.3 Độ đúng

Độ đúng của phương pháp là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy sovới giá trị thực Độ đúng thường được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm thu hồikhi thêm một lượng xác định chất phân tích

2.2.2.4 Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của phương pháp biểu thị bằng mức độ thống nhất giữa cáckết quả riêng biệt khi quá trình phân tích được lặp đi lặp lại nhiều lần trêncùng một mẫu đồng nhất

Xử lý huyết tương ở 3 mức nồng độ: thấp, trung bình và cao Ở mỗimức nồng độ tiến hành với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của tỷ lệ diệntích pic của AZI/IS Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào RSD%

Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các mẫu trong cùng nồng độ biểu thịbằng độ lệch chuẩn tương đối RSD% phải nhỏ hơn 15% Tại nồng độ giới hạnđịnh lượng (LOQ) thì RSD không vượt quá 20%

2.2.2.5 Giới hạn định lượng (Limit of quantification-LOQ)

Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của mẫu thử có thể địnhlượng được với tính đúng và tính chính xác có thể chấp nhận được LOQđược chấp nhận với điều kiện:

+ Đáp ứng của chất phân tích bằng hoặc lớn hơn 10 lần đáp ứng củamẫu trắng

+ Pic của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứnglặp lại với độ chính xác 20%

Giới hạn định lượng của AZI trong huyết tương được xác định trực tiếpbằng cách thêm AZI chuẩn có nồng độ thấp dần vào từng mẫu huyết tươngtrắng, mỗi nồng độ 3 mẫu Tiến hành phân tích và xác định LOQ

2.2.2.6 Hiệu suất chiết

Chuẩn bị tương tự như mẫu chuẩn Mẫu phân tích gồm các mẫu kiểmchứng nồng độ thấp, trung bình và cao (LQC, MQC và HQC) theo quy trình

đã xây dựng Song song tiến hành định lượng với các mẫu chuẩn pha trongpha động, có nồng độ tương ứng Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh kếtquả định lượng AZI của mẫu có qua chiết tách với mẫu chuẩn pha trong phađộng (không qua chiết tách) Phương pháp chiết tách, xử lý là thích hợp khihiệu suất chiết không quá 110% và không thấp hơn 30%; RSD của giá trị hiệusuất chiết tại các nồng độ lệch nhau không quá 15%

2.2.2.7 Độ ổn định của hoạt chất

Độ ổn định của hoạt chất là khả năng của hoạt chất được bảo quảntrong điều kiện xác định có thể giữ được những đặc tính vốn có trong nhữnggiới hạn nhất định

Thêm AZI chuẩn vào huyết tương trắng ở nồng độ QC: thấp, trungbình, cao Các mẫu huyết tương được bảo quản ở T0 = -400C Sau nhữngkhoảng thời gian nhất định tiến hành phân tích và tính nồng độ hoạt chất đểđánh giá độ ổn định của mẫu trong thời gian bảo quản So sánh giá trị của cáclần phân tích sau với giá trị của lần phân tích đầu tiên Yêu cầu lượng hoạtchất thay đổi phải nhỏ hơn 5%

Nếu mẫu AZI không ổn định khi bảo quản ở T0 = -400C thì nghiên cứu

độ ổn định khi bảo quản ở T0 = -800C tương tự như trên

2.2.3 Đánh giá tương đương sinh học

Phương pháp đánh giá TĐSH được lựa chọn trên cơ sở các quy địnhcủa FDA, EU, WHO

2.2.3.1 Chọn người tình nguyện

Lựa chọn NTN thử thuốc theo các quy định về lứa tuổi, cân nặng, chiềucao Không hút thuốc lá, không nghiện rượu, không nghiện ma tuý, khôngnhiễm HIV Đạt yêu cầu với các chỉ tiêu xét nghiệm hoá sinh và huyết học

Sau khi được tuyển chọn theo tiêu chuẩn, được đọc và nghe phổ biến,giải thích các thông tin liên quan đến nghiên cứu, NTN phải tự nguyện camkết tham gia nghiên cứu và ký tên vào Bản cam kết theo mẫu đã được Hộiđồng đạo đức thông qua.

Trong số 17 người tình nguyện: 3 NTN tham gia nghiên cứu khảo sátban đầu để xây dựng mô hình thực nghiệm, 14 NTN tham gia vào nghiên cứuTĐSH Kết quả kiểm tra sức khoẻ NTN được trình bày ở phụ lục 1

2.2.3.2 Phương pháp thăm dò SKD in vivo

- Tiến hành thăm dò SKD in vivo trên 3 người tình nguyện nam giới

khoẻ mạnh, đã được kiểm tra các chỉ tiêu sinh hoá và huyết học trước khi thử

- Cho NTN uống 2 viên chế phẩm thử với 240mL nước ấm NTNkhông được ăn trong vòng 10 giờ trước khi uống thuốc và ít nhất 4 giờ saukhi uống thuốc; không được nằm ít nhất 2 giờ sau khi uống thuốc

- Lấy máu trực tiếp từ tĩnh mạch qua kim luồn đặt ở cánh tay NTN Lấy

01 mẫu trong vòng 1 giờ trước khi uống thuốc và lấy tiếp vào các thời điểmsau khi uống 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 6; 8; 12; 24; 48; 72; 96 giờ Lấy3mL máu vào các ống nghiệm có chứa sẵn chất chống đông EDTA, đậy nắp

và lắc nhẹ ngay sau khi lấy, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian

5 phút Tách lớp huyết tương vào ống nghiệm bảo quản ở tủ lạnh sâu -800Ccho đến khi phân tích

- NTN được theo dõi huyết áp và nhịp tim trước khi uống thuốc và khikết thúc giai đoạn lấy mẫu

2.2.3.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá TĐSH

- Sử dụng phương pháp mù đôi, chéo 2 giai đoạn, đơn liều Phân ngẫunhiên (gắp thăm) người tình nguyện vào nhóm thử

- 14 NTN được phân ngẫu nhiên thành 2 nhóm, mỗi nhóm 7 người

- Thử nghiệm được tiến hành 2 giai đoạn, mỗi người tình nguyện trong