- Hiệu suất chiết nội chuẩn:
Chương 4 BÀN LUẬN
4.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AZI TRONG HUYẾT TƯƠNG
Phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học đóng vai trò quyết định trong đánh giá và diễn giải các số liệu nghiên cứu SKD và TĐSH và DĐH của thuốc. Để làm được điều này, các phương pháp phân tích sinh học dựa trên kỹ thuật hoá lý và sinh học hiện đại được phát triển và được ứng dụng rộng rãi. Các phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước và trong quá trình phân tích, để đảm bảo kết quả thu được là chính xác, đáng tin cậy. Việc thiết lập một quy trình và các tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích sinh học đã được thảo luận ở rất nhiều hội nghị quốc tế lớn về công nghiệp dược phẩm. Nhiều nước châu Âu, châu Mỹ đã có những quy định pháp lý và hướng dẫn cụ thể về cách thức tiến hành thẩm định phương pháp phân tích sinh học.
Khi nghiên cứu TĐSH của viên Azithromycin 250mg, phải tiến hành định lượng thuốc trong huyết tương, nền mẫu phức tạp hơn nhiều so với chế phẩm bào chế. Phương pháp phân tích phải đồng thời tách, định tính, định lượng. Ngoài các chỉ tiêu thẩm định chung đối với tất cả các phương pháp phân tích, thì phân tích sinh học phải chú ý đến đặc thù mẫu nghiên cứu, đó là nồng độ dược chất thấp, cỡ vài nanogam, do đó bắt buộc phải xác định giới hạn định lượng. Khi tiến hành thẩm định, sử dụng mẫu trắng là mẫu sinh
học ,thêm chất chuẩn vào. Thể tích dung dịch mẫu chuẩn cho vào mẫu sinh học phải dưới 5% thể tích mẫu thử nhằm đảm bảo đặc tính vốn có của mẫu
[38]. Mỗi mẫu có thể phân tích 1 hoặc nhiều lần.
Phương pháp đã xây dựng được thẩm định 6 chỉ tiêu: độ đúng, độ chính xác, tính chọn lọc, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và độ ổn định của AZI trong huyết tương. Phương pháp hoàn toàn đáp ứng với các quy định của FDA, EU và khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới.
− Tính chọn lọc được xác định dựa trên phổ vạch của ion mẹ và ion con ứng với pic của AZI và chuẩn nội với độ phân giải thích hợp. Phương pháp phân tích LC-MS/MS dùng trong nghiên cứu này có độ chọn lọc rất cao vì mỗi khi lấy MS, có một kiểu phân mảnh rất khác nhau. Mặt khác, điểm mạnh của detector này cho phép có kết quả định lượng đúng ngay cả khi pic chất cần lấy giá trị bị xen phủ. Do giá trị đáp ứng của pic chất cần phân tích lấy pic ứng với tỷ số m/z riêng của chất đó chứ không phải chung một điều kiện như đối với các detector thông thường khác. Sự khác biệt này làm cho các phép phân tích bằng sắc ký trở nên dễ dàng hơn, và đây cũng là một ưu điểm nổi trội của LC-MS.
− Giới hạn định lượng được xác định bằng thực nghiệm. Giảm nồng độ hoạt chất định lượng trong mẫu cho đến khi tỷ số S/N bằng khoảng 10 và sai số tương đối không lớn hơn 20% [38], [45]. LOQ của AZI thu được là 1,1ng/mL. Kết quả này ngang bằng kết quả các nghiên cứu đã công bố khi dùng LC-MS/MS và detector huỳnh quang: 1ng/mL [16]; 2ng/mL [30],
[20], nhưng nhạy hơn so với dùng LC-EC 90ng/mL [27]. Độ nhạy này cho phép theo dõi nồng độ thuốc trong huyết tương đối tượng thử trong đánh giá TĐSH.
Nồng độ cao nhất của đường chuẩn xác định được dựa trên nồng độ dự đoán cao nhất Cmax khi định lượng mẫu thực trong định lượng AZI và cho pic
sắc nét, không bị biến dạng, đáp ứng phân tích tuyến tính với nồng độ. Giá trị này bằng 100 lần so với nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn đối với AZI
− Khoảng nồng độ tuyến tính được khảo sát trên nền mẫu huyết tương trắng khi cho thêm AZI (8 điểm nồng độ) và chất chuẩn nội. Khoảng nồng độ từ 5÷500ng/mL. Hệ số r giữa đáp ứng phân tích và nồng độ AZI trong khoảng khảo sát đều bằng khoảng 0,999, cho thấy phương pháp phân tích đạt yêu cầu thẩm định phân tích sinh học, là r lớn hơn 0,99 [38]. Hệ số tương quan này cũng tương đương như các kết quả đã được công bố: 0,9977 [20]; 0,9991
[23]; 0,9937 [50].
− Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào huyết tương trắng. Phân tích AZI trong huyết tương đều tính kết quả bằng phương pháp chuẩn hoá nhiều điểm, dùng chuẩn nội đối với phép phân tích này, nên kết quả thẩm định về độ đúng thu được rất cao (lần lượt là 105,9%; 96,3%; 97,6% ở 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao của khoảng nồng độ tuyến tính), đáp ứng yêu cầu đối với phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học (85-115%). Chứng tỏ phương pháp phân tích có khả năng định lượng AZI với kết quả tin cậy. Độ đúng thu được cũng tương đương như các kết quả đã được công bố: 98,7-105,7% [23]; từ 86,18-114,15% [50]; 93,0-111,9% [30].
− Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lặp lại. Kết quả phân tích lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất có RSD% đều dưới 3,0%, chứng tỏ phương pháp định lượng AZI trong HT có độ chính xác cao. Vì đối với phương pháp phân tích sinh học, RSD dưới 5% được coi là rất chính xác [38].
− Độ ổn định của AZI trong huyết tương bị ảnh hưởng bởi điều kiện bảo quản, đặc điểm hoá học, và vật liệu bao gói. Do đó đánh giá độ ổn định của chất phân tích trong huyết tương thường được đánh giá về độ ổn định của
mẫu khi để đông lạnh và để giải đông; trong thời gian bảo quản dài; và khoảng thời gian chờ phân tích (độ ổn định trong thời gian ngắn) [45], [38].
Trong thực nghiệm này, mỗi mẫu phân tích được chia vào các ống nghiệm riêng biệt. Khi lấy mẫu thử ra khỏi tủ lạnh sâu, sẽ phân tích hết 1 lần, nên chúng tôi không xác định độ ổn định của mẫu khi để đông lạnh và giải đông như yêu cầu [38], [45].
Thời gian theo dõi độ ổn định của mẫu phân tích phải lớn hơn thời gian dự kiến sẽ bảo quản mẫu thực. Mẫu thử được thực hiện bằng cách cho AZI chuẩn vào HT trắng ở 3 mức nồng độ LQC, MQC, và HQC được đựng trong ống nghiệm thuỷ tinh khi bảo quản ở nhiệt độ -400C và đựng trong ống nghiệm polyethylen khi bảo quản ở -800C theo dõi trong vòng 30 ngày. So sánh giá trị của các lần phân tích sau với giá trị của lần phân tích đầu, thực nghiệm cho thấy sau 30 ngày bảo quản ở -400C trong điều kiện nghiên cứu, kết quả lượng AZI giảm mạnh ở cả 3 mức nồng độ, vượt quá giới hạn cho phép (5%) [38]. Còn khi bảo quản ở -800C, sau 30 ngày, lượng AZI giảm dưới 5% (cao nhất là 4,92%). Điều này có thể do ở nhiệt độ -800C, các men bị bất hoạt nên không ảnh hưởng tới hoạt chất. Thực tế, các mẫu thử thường được phân tích hết trong vòng 30 ngày sau khi lấy mẫu.
Phương pháp phân tích thẩm định đạt yêu cầu, được dùng trong nghiên cứu. Tuy nhiên mỗi lần tiến hành phân tích, chúng tôi đều kiểm tra độ phù hợp của hệ thống phân tích, dựa trên kết quả tiêm cùng 1 mẫu lặp lại 5 lần, cho các thông số thời gian lưu, tỷ số diện tích pic AZI và IS phải có RSD nhỏ hơn 2%. Nồng độ AZI trong mẫu thử được tính toán dựa trên đường chuẩn xây dựng trong mỗi ngày phân tích với hệ số tương quan giữa đáp ứng phân tích và nồng độ AZI không nhỏ hơn 0,99.