Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic và ứng dụng bổ sung vào thức ăn nuôi cá chim vây vàng

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Lê Đình Đức “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC VÀ ỨNG DỤNG BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN NUÔI CÁ CHIM VÂY VÀNG (Trachinotus blochii LACEPEDE, 1801) GIAI ĐOẠN GIỐNG” LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60.54.10 Hướng dẫn khoa học: 1. TS Vũ Ngọc Bội 2. PGS.TS Lại Văn Hùng Nha Trang - 4/2012 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự cho phép của cơ quan chủ quản - Trường Đại học Nha Trang. Các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả 2 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ niềm tự hào vì đã được học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Nha Trang, một trong những trường đầu ngành về nuôi trồng và chế biến thủy sản. Xin được gửi lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Vũ Ngọc Bội và PGS.TS Lại Văn Hùng, những người thầy kính mến đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ Thực phẩm đã giảng dạy và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện CNSH&MT, Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian đi học. Xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Duy, Th.S Ngô Văn Mạnh, các bạn bè, đồng nghiệp và các bạn sinh viên đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn đến gia đình thương yêu đã chia sẻ, động viên tôi hoàn thành khóa học và luận văn này! 3 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6 DANH MỤC BẢNG 7 DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ 8 MỞ ĐẦU 9 Chương 1. TỔNG QUAN 12 1.1. Giới thiệu về probiotic 12 1.2. Phân loại vi sinh vật probiotic 12 1.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi 14 I.4. Cơ chế tác động của probiotic 16 I.4.1. Cạnh tranh vị trí bám dính và loại trừ vi khuẩn gây bệnh 16 I.4.2. Sản sinh ra các chất ức chế 17 I.4.3. Kích thích hệ miễn dịch 20 I.4.4. Ức chế cơ chế dò tìm mật độ tới hạn của vi khuẩn gây bệnh 21 1.4.5. Khả năng kháng virus 23 1.5. Ứng dụng của probiotic 23 1.5.1. Ứng dụng trong y học và chăn nuôi 23 1.5.2. Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 24 1.6. Lactobacillus - vi khuẩn probiotic điển hình 25 1.7. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus làm probiotic 28 1.7.1. Trong y học và chăn nuôi 28 1.7.2. Trong nuôi trồng thủy sản 29 I.8. Sản xuất chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản 32 I.8.1. Phân lập và tuyển chọn giống vi khuẩn probiotic 32 1.8.2. Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic 35 I.9. Cá Chim vây vàng 36 I.9.1. Giới thiệu về cá Chim vây vàng 36 I.9.2. Tình hình bệnh dịch trong nuôi cá biển 37 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 4 2.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 40 2.1.1. Mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus 40 2.1.2. Vi sinh vật chỉ thị 40 2.1.3. Cá Chim vây vàng 40 2.1.4. Muôi trường nuôi cấy vi sinh vật 40 2.1.5. Các thiết bị chuyên dụng 41 2.2. Phương pháp nghiên cứu 42 2.2.1. Phân lập Lactobacillus 42 2.2.2. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio 42 2.2.3. Xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa 43 2.2.3.1. Quan sát đặc điểm hình thái 43 2.2.3.2. Xác định đặc tính sinh hóa 43 2.2.4. Xác định khả năng sinh trưởng 43 2.2.5. Bố trí thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp 43 2.2.6. Xác định các đặc tính probiotic 44 2.2.6.1. Xác định khả năng sinh enzym ngoại bào 44 2.2.6.2. Xác định khả năng sinh acid 44 2.2.6.3. Xác định khả năng sinh các chất kháng khuẩn 44 2.2.6.4. Xác định khả năng chịu mặn 45 2.2.6.5. Xác định khả năng chịu muối mật 45 2.2.7. Xác định chất phụ gia thích hợp cho quá trình đông khô 45 2.2.8. Bố trí thí nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng 45 2.2.9. Xác định khả năng tăng trưởng và chuyển hóa thức ăn ở cá 46 2.2.10. Xác định thành phần vi sinh đường ruột cá 47 2.2.11. Xử lý thống kê 47 2.3. Cách tiếp cận các vấn đề nghiên cứu 48 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1. Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus 49 3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá Chim vây vàng 49 3.1.2.Tuyển chọn chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio 49 3.1.3. Tuyển chọn chủng Lactobacillus sinh enzym ngoại bào 51 5 3.2. Xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng 52 3.2.1. Đặc điểm hình thái 52 3.2.2. Đặc tính sinh hóa 53 3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng 55 3.3.1. Đường cong sinh trưởng 55 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 56 3.3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường 58 3.3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 60 3.4. Một số đặc tính khác của các chủng probiotic 62 3.4.1. Khả năng sinh acid 62 3.4.2. Khả năng sinh bacteriocin 63 3.4.3. Khả năng chịu mặn 63 3.4.4. Khả năng chịu muối mật 65 3.5. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic ở dạng đông khô 67 3.5.1. Nghiên cứu lựa chọn chất chống đông 67 3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản 69 3.6. Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô 70 3.7. Thử nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng giai đoạn giống 71 3.7.1. Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến tăng trưởng và chuyển hoá thức ăn của cá 71 3.7.1.1. Chiều dài 71 3.7.1.2. Khối lượng và tốc độ sinh trưởng đặc trưng (SGR) 73 3.7.1.3. Hệ số phân đàn về chiều dài (CV L ) 73 3.7.1.4. Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) 74 3.7.3. Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến hệ vi sinh đường ruột cá 76 3.7.3.1. Tổng số Lactobacillus spp. 76 3.7.3.2. Tổng số Vibrio spp. 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHẦN PHỤ LỤC 89 6 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu OD CFU APW MRS TCBS MPN FAO Chữ viết tắt Optical Density (Mật độ quang) Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) Alkaline Peptone Water de Man, Rogosa and Sharpe Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose Most Probable Number Food and Agriculture Oganization of the United Nation LAB Lactic acid bacteria FCR Hệ số chuyển hóa thức ăn SGR Tốc độ tăng trưởng đặc trưng CV L Hệ số phân đàn theo chiều dài 7 DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Mô tả trạng thái Eubiosis và Dysbiosis 16 2 Bảng 2.1. Bố trí các nghiệm thức trong thí nghiệm 46 3 Bảng 3.1. Khả năng kháng Vibrio của các chủng Lactobacillus 50 4 Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym protease và amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn Lactobacillus 52 5 Bảng 3.3. Hình thái tế bào và khuẩn lạc của các chủng L1.2, L1.3 và L1.8 53 6 Bảng 3.4. Đặc tính sinh hóa của các chủng L1.2, L1.3 và L1.8 54 7 Bảng 3.5. Mật độ tế bào (OD 620 ) theo thời gian nuôi cấy 55 8 Bảng 3.6. Khả năng sinh acid của chủng L1.2 và L1.3. 62 9 Bảng 3.7. Khả năng sinh bacteriocin của chủng L1.2 và L1.3 63 10 Bảng 3.8. Quy trình đông khô chế phẩm probiotic 68 11 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chất chống đông đến tỷ lệ sống của chủng L1.2 và L1.3 68 12 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến tỷ lệ sống của chủng L1.2 và L1.3 69 13 Bảng 3.11. Chiều dài toàn thân, khối lượng, tốc độ sinh trưởng đặc trưng (SGR) và hệ số phân đàn về chiều dài (CV L ) của cá 71 14 Bảng 3.12. Thành phần của hệ vi sinh đường ruột cá Chim vây vàng trước và sau khi sử dụng chế phẩm probiotic 75 8 DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ TT Tên đ ồ thị, h ình v ẽ Trang 1 Hình 1.1. Sơ đồ tuyển chọn chủng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản 34 2 Hình 1.2. Sơ đồ quy trình sản suất chế phẩm probiotic dạng bột 35 3 Hình 2.1. Sơ đồ tiếp cận các vấn đề nghiên cứu 48 4 Hình 3.1. Khả năng kháng Vibrio của một số chủng Lactobacillus 49 5 Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2, L1.3 và L1.8 55 6 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của chủng L1.2 56 7 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của chủng L1.3 57 8 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của chủng L1.8 57 9 Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.2 58 10 Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.3 59 11 Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.8 59 12 Hình 3.9. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của chủng L1.2 61 13 Hình 3.10. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh của chủng L1.3 61 14 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ muối (%) đến sinh trưởng của chủng L1.2 64 15 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ muối (%) đến sinh trưởng của chủng L1.3 64 16 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ muối mật (%) đến sinh trưởng của chủng L1.2 66 17 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ muối mật (%) đến sinh trưởng của chủng L1.3 66 18 Hình 3.15. Ảnh hưởng của chất chống đông đến tỷ lệ sống của chủng L1.2 và L1.3 69 19 Hình 3.16. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm probiotic 70 20 Hình 3.17. Chiều dài trung bình của cá 71 21 Hình 3.18. Khối lượng trung bình của cá 73 22 Hình 3.19. Hệ số phân đàn về chiều dài (CVL) của cá 74 23 Hình 3.20. Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) của cá 75 24 Hình 3.21. Mật độ của Lactobacillus spp. tổng số trong đường ruột cá 77 25 Hình 3.22. Mật độ của Vibrio spp. tổng số trong đường ruột cá 78 9 MỞ ĐẦU I. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, nuôi trồng thuỷ sản trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Đây là ngành có tốc độ tăng trưởng nhanh, trung bình hàng năm (từ năm 1970) là 8,9% so với tốc độ tăng trưởng 1,2% của đánh bắt và 2,8% của nuôi động vật trên cạn trong cùng thời điểm. Tổng sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của toàn thế giới đạt 55,1 triệu tấn năm 2009 với giá trị khoảng 98,4 tỷ USD trong đó nuôi trồng thuỷ sản nước mặn đạt 20,1 triệu tấn và giá trị 30 tỷ USD. Sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của các nước châu Á đạt trên 40 triệu tấn tương đương với 80% sản lượng toàn cầu trong năm 2009, tiếp theo là Châu Âu (6%) và Mỹ (5%) (FAO, 2010) [34]. Để đáp ứng nhu cầu phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản, các cơ sở sản xuất với quy mô lớn ra đời, đã đặt các loài thuỷ sản phải tiếp xúc với những điều kiện bất lợi, chủ yếu là liên quan đến bệnh và các vấn đề về suy thoái môi trường thường xuyên xảy ra, dẫn đến thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế. Vi khuẩn và virus gây bệnh là các tác nhân gây bệnh chủ yếu trên động vật thuỷ sản. Để phòng chống, điều trị và kiểm soát bệnh trên động vật thuỷ sản do các tác nhân này gây ra đã dẫn tới việc tăng đáng kể việc sử dụng thuốc thú y (hoá chất, thuốc kháng sinh và vacxin). Trong đó thuốc kháng sinh được sử dụng phổ biến với số lượng rất lớn [6], [23]. Mỹ là nước sản xuất thuốc kháng sinh lớn nhất thế giới, khoảng 18.000 tấn mỗi năm với mục đích sử dụng cho y tế và nông nghiệp, trong đó 12.600 tấn (gần 70%) được sử dụng không phải để chữa bệnh mà dùng để thúc đẩy tăng trưởng (SCAN, 2003). Liên minh Châu Âu và Thụy Sĩ sản xuất 1600 tấn kháng sinh, trong đó khoảng 30% được sử dụng cho vật nuôi, với mục đích tương tự để tăng trưởng (SCAN, 2003). Như vậy, việc sử dụng kháng sinh lâu dài như một biện pháp phòng ngừa và yếu tố thúc đẩy tăng trưởng đã gây nên hiện tượng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh (tạo ra gen kháng kháng sinh). Nhiều nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn gây bệnh đã tăng lên theo từng năm. Đặc biệt, một số loài vi khuẩn gây bệnh có thể truyền gen kháng kháng sinh sang các loài vi khuẩn gây bệnh cho người. Tính chất nguy hiểm của tình trạng kháng thuốc ngày càng được ý thức hơn khi người ta thấy rằng những vi khuẩn kháng thuốc đã gây ra các bệnh [...]... các bệnh do vi khuẩn gây ra như bệnh xuất huyết trên da [09], [20] 10 Từ những phân tích ở trên, việc Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic và ứng dụng bổ sung vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng là cần thiết và là một hướng đi mới trong việc ứng dụng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản II Nội dung nghiên cứu 1 Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn probiotic thuộc giống Lactobacillus trên cá. .. năng phát triển và khả năng kháng Vibrio spp của các chủng vi khuẩn probiotic bổ sung trong đường ruột cá Chim vây vàng III Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1 Làm giàu bộ sưu tập chủng vi sinh vật probiotic biển 2 Xây dựng được quy trình phân lập, tuyển chọn và sản xuất chế phẩm probiotic để bổ sung vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng giai đoạn giống 3 Đánh giá được hiệu quả của việc bổ. .. trên cá Chim vây vàng 2 Thử nghiệm in vitro khả năng kháng khuẩn (Vibrio), khả năng sinh enzym ngoại bào (protease, amylase), acid và các hợp chất kháng khuẩn, khả năng chịu mặn, khả năng chịu muối mật 3 Sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô (lựa chọn chất chống đông phù hợp, xác định thời gian bảo quản) 4 Thử nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng giai đoạn giống nuôi. .. thêm bao gồm cả các chế phẩm vi sinh vật có nguồn gốc tự nhiên được bổ sung vào trong ao, đìa nuôi [20], [33], [40], [47] Chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản dưới hai phương 24 thức chủ yếu là bổ sung vào thức ăn hoặc thêm vào môi trường nước nuôi Rất nhiều công trình nghiên cứu đã công bố những lợi ích của việc sử dụng các chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản như [25], [26], [37],... được bổ sung vào chế phẩm proiotic trong chăn nuôi gia súc, gia cầm giúp tăng hiệu quả trong chăn nuôi Nhiều chế phẩm sử dụng Lactobacillus được sản xuất như DYO, BIO -PROBIOTIC dùng trong nuôi lợn thịt, lợn nái và gà đã cho hiệu quả rõ rệt 28 1.7.2 Trong nuôi trồng thủy sản Những nghiên cứu trên thế giới Theo nghiên cứu của Mohanty và cộng sự (1996) cho thấy chế phẩm vi sinh sử dụng Lactobacillus và. .. nhiễm môi trường ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên; nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn của thủy sản [10], [13], [33], [40] Những nghiên cứu trong nước Ở nước ta, các chế phẩm probiotic đã được đưa vào sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản từ đầu những năm 1995, gồm chủ yếu là các chế phẩm nhập ngoại từ Mỹ và Nhật Bản và một số chế phẩm được sản xuất trong nước Các chế phẩm được biết đến nhiều... nước) Chế phẩm có tác dụng kích thích sự phát triển của tảo khuê và tảo lục, hạn chế sự phát triển của các loại tảo có hại như tảo lam, tảo mắt , từ đó tạo môi trường thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cá Nhìn chung, những nghiên cứu trong nước còn ít, cơ bản vẫn tập trung vào việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm probiotic sử dụng trong các ao, đìa nuôi Việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm. .. bổ sung chế phẩm probiotic (tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và khả năng kháng Vibrio) trên cá Chim vây vàng khi được nuôi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm probiotic 11 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về probiotic Probiotic là một từ gốc tiếng Hy Lạp có nghĩa là "for life" Nó được dùng để mô tả các vi khuẩn "thân thiện" thường sống ở đường ruột và có đóng góp vào sức khỏe tốt của vật chủ Thuật ngữ Probiotic" ... (2006) đã nghiên cứu bổ sung chế phẩm LACBASAC gồm Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus và Saccharomyces cerevisiae vào thức ăn cá cảnh Kết quả cho thấy, chế phẩm thử nghiệm có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột như E coli, Samonella Và có khả năng kích thích tốt khả năng tiêu hóa thức ăn cho cá cảnh khi được phối trộn vào thức ăn viên với tỷ lệ là 5% Nghiên cứu của Nguyễn Thanh... Bản và các chế phẩm khác như: ACTIVE CARE, ACTIVE CLEANER, GEM-P … được sử dụng phổ biến để bổ sung vào ao nuôi nhằm cải thiện chất lượng nước và làm giảm streess cho động vật thuỷ sản đã mang lại nhiều hiệu quả và góp phần đáng kể vào việc phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản Nhược điểm lớn nhất của các chế phẩm này là chỉ sử dụng được trong các đìa, ao nuôi không sử dụng được cho phương pháp nuôi . 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Lê Đình Đức “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC VÀ ỨNG DỤNG BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN NUÔI CÁ CHIM VÂY VÀNG (Trachinotus. xuất chế phẩm probiotic để bổ sung vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng giai đoạn giống. 3. Đánh giá được hiệu quả của việc bổ sung chế phẩm probiotic (tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và khả năng. nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng 45 2.2.9. Xác định khả năng tăng trưởng và chuyển hóa thức ăn ở cá 46 2.2.10. Xác định thành phần vi sinh đường ruột cá 47