Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC CHỊU NHIỆT SỬ DỤNG TRONG THỨC ĂN CHO CHĂN NUÔI HEO, GÀ QUY MÔ PILOT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Huỳnh Ninh Sinh viên thực : Trần Lệ Quyên MSSV: 1311100608 Lớp: 13DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Sinh viên thực Trần Lệ Quyên LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đồ án tốt nghiệp tốt nghiệp Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, hướng dẫn tận tình Thầy Cơ, anh chị bạn, em hoàn thành tốt đồ án Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Em xin kính dâng lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Ba Mẹ tất người thân gia đình ni em khn lớn nên người tận tâm lo lắng, tạo điều kiện cho em học tập hoàn thành đồ án tốt nghiệp Ngôi trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, nơi em gắn bó suốt bốn năm qua, giúp em tiếp cận điều bổ ích, kinh nghiệm sống Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Thầy Cô môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh trang bị cho em kiến thức bản, làm móng để em thực đề tài làm tốt công việc sau TS Phạm Huỳnh Ninh, Phó mơn Dinh Dưỡng Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy tạo điều kiện cho em làm đề tài đây, nhiệt tình hướng dẫn hỗ trợ cho em q trình hồn thành đồ án tốt nghiệp Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh, anh Lê Quang Trí phòng Dinh Dưỡng Thức Ăn Chăn ni, Phân Viện Chăn Ni Nam Bộ tận tình bảo, giảng dạy giúp đỡ em suốt thời gian thực đồ án Cơ Nguyễn Hồi Hương, phòng vi sinh, khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh tận tình giúp đỡ em trình nhận đề tài MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC HÌNH ẢNH vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương probiotic .3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic 1.1.2 Định nghĩa probiotic 1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp 1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 1.1.5 Cơ chế tác động Probiotic 1.1.6 Vai trò probiotic vật nuôi .11 1.1.7 Probiotic từ bào tử 12 1.1.8 Tình hình nghiên cứu sử dụng Probiotic giới Việt Nam 13 1.2 Đại cương vi khuẩn Bacillus 18 1.2.1 Đặc điểm sinh học Bacillus 18 1.2.2 Bào tử Bacillus 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài…… ……… ………………………… .25 2.2 Vật liệu 25 2.2.1 Chủng vi sinh vật: ……………………………….……… .………25 2.2.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ……………………………………….… … 25 2.3 Môi trường nghiên cứu……………………………………………… …………26 2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)………… 30 2.5 Phương pháp nhuộm Gram……………………………………………… .…31 i 2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer Fulton ….32 2.7 Xác định mật độ TB phương pháp đếm khuẩn lạc……………… .…………32 2.7.1 Xác định mật độ TB phương pháp đo mật độ quang………… ….33 2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng……………………………… .34 2.7.3 Khảo sát tạo thành bào tử…………………………………… .35 2.8 Khảo sát đặc điểm probiotic……………………………………… … … ….35 2.8.1 Khảo sát khả chịu axit dày…………………………………… …35 2.8.2 Khảo sát khả chịu muối mật…………………………………… … 36 2.8.3 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào ….…………………… … 37 2.8.4 Khảo sát khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định phương pháp đường vng góc Cross Streak……………………………………………… .….40 2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử…………………………………… …….40 2.8.6 Khảo sát phương pháp tạo bào tử nhiều nhất…………………… .….41 2.8.7 Sản xuất bào tử dạng pilot…………………………………………… ….42 2.8.8 Phân tích thống kê liệu…………………………………………… ….44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………… ….45 3.1 Khảo sát đặc điểm probiotic………………………… ……………………… 45 3.1.1 Khả chịu axit dày…………………………………… ……………… 45 3.1.2 Khả chịu muối mật………………………………………… ………46 3.1.3 Khả sinh enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase)…… …48 3.1.4 Khả đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định phương pháp đường vng góc Cross Streak………………………………………….… ……51 3.2 Đặc tính sinh học phân loại chủng tuyển chọn………………… .………… 53 3.2.1 Đặc tính hình thái chủng Sub Yoi………………………… …… 53 3.2.2 Tổng hợp số đặc tính probiotic chủng Sub Yoi……… …… 54 3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub…………… .……………………….54 3.3.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… .… 54 ii 3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng……………………………… ……….56 3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi…………… ……………………….56 3.4.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… 56 3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng………………………… …………….58 3.5 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tạo thành bào tử chủng Sub Yoi…………………………………………………………… … .……58 3.6 Kết khảo sát điều kiện tạo bào tử tốt nhất………………… .…………… 59 3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot……………………………………………… .…… 61 3.7.1 Kết khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao với quy mô pilot………………………….……………………………………… … ……61 3.7.2 Tiến hành tạo bào tử………… ……………………………… .… … 62 3.8 Tạo chế phẩm……………………………………………………………… …… 64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ……………………… ………………… 65 4.1 Kết luận……………………………………………………… ……… … …….65 4.2 Kiến nghị……………………………………………………………….… ………65 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… …66 PHỤ LỤC…………………………………………………………………….… 74 Phụ lục I: Bảng biểu…………………………………………… ………………….….74 Phụ lục II: Hình ảnh……………………………… ………….….85 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT KL Khuẩn lạc MT Môi trường N Mật độ tế bào TB Tế bào TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tóm tắt số thơng tin vài sản phẩm probiotic có mặt thị trường 17 Bảng 1.2 Các đặc điểm khác tế bào sinh dưỡng bào tử .23 Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót 11 chủng vi khuẩn vi khuẩn môi trường pH thấp 45 Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót 11 chủng vi khuẩn mơi trường muối mật 2% 47 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng Bacillus 49 Bảng 3.4 Hoạt tính đối kháng chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định 51 Bảng 3.5 Tổng hợp số đặc tính probiotic chủng Sub Yoi 54 Bảng 3.6 Kết khảo sát đường chuẩn chủng Sub .55 Bảng 3.7 Kết khảo sát đường chuẩn chủng Yoi 57 Bảng 3.8 Tỷ lệ hình thành bào tử khoảng thời gian khác với quy mô pilot .63 Bảng 5.1 Số lượng khuẩn lạc mật độ tế bào vi khuẩn sống sót môi trường pH thấp 74 Bảng 5.2 Số lượng khuẩn lạc mật độ tế bào vi khuẩn sống sót mơi trường muối mật 2% 75 Bảng 5.3 Số liệu đường chuẩn chủng Sub 76 Bảng 5.4 Kết phân tích tuyến tính giá trị OD log N chủng Sub 77 Bảng 5.5 Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub 78 Bảng 5.6 Số liệu đường chuẩn chủng Yoi 79 Bảng 5.7 Kết phân tích tuyến tính giá trị OD log N chủng Yoi 80 Bảng 5.8 Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi 81 Bảng 5.9 Số liệu khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tạo thành tế bào bào tử chủng Sub 82 Bảng 5.10 Số liệu khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tạo thành tế bào bào tử chủng Yoi 82 Bảng 5.11 Tỷ lệ hình thành bào tử qua mơi trường chủng Sub Yoi 83 Bảng 5.12 Mật độ bào tử phương pháp tạo bào tử tốt khoảng thời gian khảo sát khác .83 Bảng 5.13 Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian phương pháp khác 84 Bảng 5.14 Kết khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao với quy mô pilot 85 Bảng 5.15 Kết khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot 86 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơ chế tác động chung probiotic động vật…… … Hình 1.2 Các cấu trúc bào tử B Subtilis 23 Hình 1.3 Chu trình hình thành bào tử nảy mầm trở lại Bacilllus .24 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .30 Hình 3.1 Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase) chủng Bacillus…… …………………………… 50 Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định chủng Bacillu… .52 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào bào tử chủng Sub 53 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào bào tử chủng Yoi 53 Hình 3.5 Đường tương quan giá trị OD Log N chủng Sub 55 Hình 3.6 Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian 56 Hình 3.7 Đường tương quan giá trị OD Log N chủng Yoi .57 Hình 3.8 Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian… 58 Hình 3.9 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến hình thành bào tử chủng Sub Yoi………………… ……………………59 Hình 3.10 Tỷ lệ hình thành bào tử phương pháp khác theo thời gian chủng Bacillus subtilis ……………… 60 Hình 3.11 Mật độ tế bào với quy mô pilot chủng Bacillus subtilis 61 Hình 5.1 Máy ly tâm Avanti JXN Series .87 Hình 5.2 Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis… 87 Hình 5.3 Hệ thống lên men L……………… 88 vii PHỤ LỤC PHỤ LỤC I: BẢNG BIỂU Bảng 5.1 Số lượng KL mật độ TB vi khuẩn sống sót mơi trường pH thấp S K T í h T i ệ 11 Kh M Kh M uẩ ậ uẩn ậ n t lạc t Khu M ật ẩn độ lạc tế lúc đ lúc lạc 1lúc 0 uB I B >2 I 50 >2 50 B >2 I 50 >2 50 B >2 I 50 >2 50 M >2 N 50 >2 50 M >2 N 50 >2 50 S u Y o L 1 ic N at B A 5 đ ộ2, 6, 1, 13 1, 02 7, 70 6, 80 2, 57 2, 27 1, 44 60 1 6 6 3 8 4 1 ộ 3, 1, 84 2, 90 1, 68 1, 98 3, 52 2, 24 9 2, 62 2, 91 5 1, 51 0 1 180 1 1 2 1 8 8 9 3 2 3 7 5 b 6, 04 6, 40 1, 43 1, 06 7, 60 7, 69 1,1 1, 10 0 6 0 Bảng 5.2 Số lượng khuẩn lạc mật độ tế bào vi khuẩn sống sót mơi trường muối mật 2% S T K Khu í ẩn lạc T h 1 i 0- 05 ệ B >2 I 50 >2 50 B I 2 B >2 I 50 >2 50 B >2 I 50 >2 50 M N 6 M >2 N 50 >2 50 S u 8 Y >2 o 50 >2 50 L >2 ic 50 >2 50 N >2 at 50 >2 50 11 B >2 A 50 >2 50 M Khu ậ ẩn t lạc đ 1 ộ 0- 0- M Khu ậ ẩn t lạc đ 1 ộ 0- 0- M ật đ ộ tế t4, 8 1, 76 8, 60 5 6, 00 2, 06 7 1, 19 1, 19 2, 50 1 7, 25 7, 95 1, 03 t 4, 23 b 7, 72 1, 48 2, 85 1, 28 2, 65 2, 32 3, 21 4, 23 2, 58 3, 90 4, 26 1 2 6 8 1 1 4 >2 50 >2 50 >2 50 1 3 7 9 6 8 4 6, 97 6, 50 6, 70 9, 31 8, 53 7, 67 6, 93 1, 30 1, 59 3, 29 Bảng 5.3 Số liệu đường chuẩn chủng Sub T K K ỷ h h u u l ẩ ẩ ệ n n : K M h ậ u t ẩ n đ 292 , 28 > 371 , > 32 > , > > , > > , > > , > > 96 , > 98 O D , , , , 76 Bảng 5.4 Kết phân tích tuyến tính giá trị OD log N chủng Sub Regr essio M 0, ul R 90, S A dj 0, us St an 0, da O 07 bs A N D R 1f eg R es T ot In te O D C o 7, 80, S 0, S 0, 00, St a n0, 00, Si M F g 0, 2, S ni 37 0, t 5St 72 3, P 2, 92, L o 7, 79 0, 78 77 Bảng 5.5 Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub Đ Log ộ 78 Bảng 5.6 Số liệu đường chuẩn chủng Yoi T K K ỷ h h u u l ẩ ẩ ệ n n : K h u ẩ n M ậ t O D đ , 14 , , 70 10 , 65 > 50 > 48 38 , , , , 29 201 , 15 , 42 79 Bảng 5.7 Kết phân tích tuyến tính giá trị OD log N chủng Yoi Regr essio M 0, ul 90, R S A dj 0, us St an 0, da O 05 bs A N D R 1f eg R es T ot In te O D C o 7, 02, S 0, S 0, 00, St a n0, 00, 11 Si M F g 0, 0, S ni 00 0, t 1St 81 7, P 3, 60, L o 6, 89 1, 66 80 Bảng 5.8 Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi Đ Log ộ 81 Bảng 5.9 Số liệu khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tạo thành tế bào bào tử chủng Sub M MM M ô ậậ ậ i tt t t đ r đđ ộ MT1 1, 2, , 43 03 MT2 1, 2, , 54 50 MT3 2, 2, , 68 10 MT4 7, 3, , 75 20 MT5 2, 1, , 81 55 1, 1, , 49 19 MT7 8, 5, , 70 35 Bảng 5.10 Số liệu khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tạo thành tế bào bào tử chủng Yoi MMM M ô ậ ậ ậ i t t t t đ đ ộ r 1, 2, , 15 98 MT2 1, 1, , 54 08 MT3 9, 1, , 90 47 MT4 8, 2, , 85 44 MT5 8, 2, , 15 55 MT6 2, 2, , 17 27 MT7 8, 2, , 60 07 82 Bảng 5.11 Tỷ lệ hình thành bào tử qua môi trường chủng Sub Yoi S T T M ôi tr M T M T M T M T M T M T M T S u 4, 6, 8, 1, 5, 9, 1, T ỷ Y oi 25 ,9 70 ,1 14 ,8 27 ,5 31 ,2 10 ,4 24 ,0 Bảng 5.12 Mật độ bào tử phương pháp tạo bào tử tốt khoảng thời gian khảo sát khác S P h T p H p H p H M T n g h C ô Nh iệt T ổ n g T 1, 9, 1, 1 3, g 5,0g 5× 7, 7,2 5× 6, 5,6 5× 7,5g 0× 2,5 2× 7,1 5× 6, × 1, 4, 8, × 5, 1, 6,6 0× 1,0 8× Mật độ bào tử khoảng 3 5 6,8g 6,6g 6,7g 6,8g 0× 0× 5× 0× 5,3 6,2 6,0 6,7 5× 0× 5× 5× 9,4 9,0 8,5 9,2 8× 5× 5× 4× 6,2 5,7 7,9 9,3 7,8 9,9 5× 0× 0× 0× 0× 0× 106 106 106 106 10 106 4,8 5× 1,0 3× 5,2 5× 1,1 6× 6,9 5× 9,6 2× 8,2 0× 9,0 5× 8,9 0× 9,0 5× 83 Bảng 5.13 Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian phương pháp khác SP Tỷ lệ hình thành Th bào tử theo thời Tư gian phương pháp n 9 3 p 6 H 7 p 8 6 H , p 7 H 4 M 1 1 T , , , , , , n 3 g h 5C ô N h i ệ 3 , , , , 5 , 2 , 7 , 8 2 , 84 Bảng 5.14 Kết khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao với quy mô pilot T h i K h u ẩ n 12 24 K h u ẩ n K h u ẩ n > > > > > > M L ậ o t g đ , N , , , , , , , , , 85 Bảng 5.15 Kết khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot G iờ 0 > > > > 2 3 K Khuẩ M h n lạc ậ u sau t ẩ 1 1 0 0 đ , 6 , > 1 , > > > > > > > > > > > 2 M ậ t đ 4, 3, 4, 6, 8, 86 PHỤ LỤC 2: HÌNH ẢNH Hình 5.1 Máy ly tâm Avanti JXN Series Hình 5.2 Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis 87 Hình 5.3 Hệ thống lên men L 88 ... Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot Mục đích đề tài Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot Nhiệm... hạn chế số lượng nghiên cứu Từ trạng nghiên cứu sản xuất probiotic cho thấy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus quy mô pilot yêu cầu cấp thiết nhằm tiến tới sản xuất. .. thiện tăng trọng giảm tiêu tốn thức ăn Năm 2009, Trần Quốc Việt cộng thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam nghiên cứu sản xuất probiotic enzyme tiêu hóa dùng chăn ni Kết tìm quy trình sản xuất chế phẩm probiotic