Nghiên cứu chiết và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của pectin thô từ vỏ và cùi bưởi citrus sp

Tuy nhiên tới đầu những năm 1970 công nghệ chiết xuất các hợp chất tự nhiên bằng dung môi CO2 siêu tới hạn SC-CO2 mới thực sự phát triển và đi vào ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, mỹ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn, tôi luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô hướng dẫn Nhân dịp này tôi xin chân thành bày tỏ sự biết

ơn sâu sắc tới :

ThS Đặng Xuân Cường- Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ThS Lê Nhã Uyên- Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, tuy luôn bận rộn với công việc và gia đình song vẫn dành cho tôi sự quan tâm trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn đến sự quan tâm của Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, tập thể Thầy Cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường cùng các bạn lớp 50SH- Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến và những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ tôi, người luôn theo tôi suốt quá trình học tập, người luôn tạo điều kiện tốt nhất, luôn động viên tôi trong những lúc tôi gặp khó khăn nhất, để tôi có thể hoàn thành tốt quá trình học tập của mình

Nha trang, tháng 7 năm 2012

Sinh viên

Đặng Thị Tuyết

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ vii

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về pectin 2

1.1.1 Nguồn gốc và cấu tạo pectin 2

1.1.1.1 Nguồn gốc pectin [5],[14] 2

1.1.1.2 Cấu tạo [4],[5],[19] .3

1.1.2 Phân loại pectin [33] 5

1.1.2.1 Theo phần trăm nhóm methoxyl có trong phân tử 5

1.1.2.2 Theo khả năng hòa tan trong nước 5

1.1.3 Tính chất, hoạt tính sinh học và ứng dụng của pectin 6

1.1.3.1 Tính chất của pectin [5],[7] 6

1.1.3.2 Hoạt tính sinh học của pectin [30] 9

1.1.3.3 Ứng dụng của pectin 10

1.1.3.4 Trong công nghệ dược phẩm [32],[35] 13

1.1.4 Tình hình nghiên cứu pectin ở Việt Nam và trên thế giới 14

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu pectin ở Việt Nam 14

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu Pectin trên thế giới 14

1.2 Tổng quan về nguyên liệu 15

1.2.1 Đặc tính thực vật của cây bưởi 15

1.2.2 Một số loại bưởi phổ biến 15

1.2.3 Thành phần hóa học của bưởi 16

1.2.4 Phế liệu bưởi 17

1.3 Một số phương pháp chiết pectin 17

1.3.1 Phương pháp CO2 siêu tới hạn 17

1.3.2 Phương pháp chiết hồi lưu (soxhlet) 20

1.3.3 Phương pháp ngâm chiết [8] 20

1.3.3.1 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation) 20

1.4 Một số quá trình xảy ra trong quá trình chiết [2] 21

1.4.1 Quá trình khuếch tán 21

1.4.1.1 Khuếch tán phân tử 22

1.4.1.2 Khuếch tán đối lưu 23

1.4.2 Quá trình thẩm thấu 23

1.4.3 Quá trình thẩm tích 23

1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết [2] 24

1.5.1 Dung môi 24

1.5.2 Nhiệt độ chiết 24

1.5.3 Thời gian chiết xuất 25

1.5.4 Độ mịn của nguyên liệu 25

1.5.5 Tỷ lệ dung môi - nguyên liệu 26

1.5.6 pH dung môi chiết 26

1.6 Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken 26

1.6.1 Cơ sở lý thuyết [3] 26

1.6.2 Các bước tiến hành [10] 27

1.7 Phân tích dữ liệu 29

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 30

2.1.1 Vật liệu 30

2.1.2 Hóa chất 30

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp chiết xuất 30

2.2.2 Phương pháp định lượng 30

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa [18] 31

2.2.4 Phương pháp xác định hàm ẩm 31

2.2.5 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu dữ liệu 32

2.3 Bố trí thí nghiệm 32

2.3.1 Quy trình chiết pectin dự kiến 32

2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp 33

2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi : nguyên liệu chiết 33

2.3.4 Bố trí thí nghiệm để xác định pH thích hợp 34

2.3.5 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp 34

2.3.6 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp 35

2.4 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa 36

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Khảo sát một số yếu tố đầu vào tới hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa tổng 37

3.1.1 Ảnh hưởng của loại dung môi chiết lên hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa 37

3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ DM:NL lên hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa… 39

3.1.3 Ảnh hưởng của pH lên hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa 41

3.1.4 Ảnh hưởng thời gian chiết lên hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa… 44

3.1.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết lên pectin và hoạt tính chống oxy hóa 47

3.1.5 Tối ưu hóa công đoạn chiết pectin và hoạt tính chống oxy hóa 49

3.1.6 Phân tích một số thành phần hóa học của pectin chiết từ vỏ và cùi bưởi Citrus sp…… 54

3.1.7 Đề xuất quy trình tách chiếc pectin từ vỏ và cùi bưởi Citrus sp 55

3.1.7.1 Sơ đồ quy trình 55

3.1.7.2 Thuyết minh quy trình 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Tiếng Việt 59 PHỤ LỤC 62

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc pectin 2

Hình 1.2 Cấu tạo pectin 3

Hình 1.3 (a) một đoạn lặp đi lặp của phân tử pectin và chức năng của nhóm: (b) carboxyl; (c) methoxyl; (d) admine trong chuỗi pectin 4

Hình 1.4 Công thức HM pectin 5

Hình 1.5 Công thức LM pectin 5

Hình 1.6 Công thức pectin được amide hóa 5

Hình 1.7 Cơ chế gel của pectin bằng lên kết hydro 7

Hình 1.8 Cơ chế tạo gel của pectin bằng liên kết với ion Ca2+ 8

Hình 1.9 Sản phẩm có sử dụng pectin 10

Hình 1.10 Ứng dụng pectin trong sản xuất bánh kẹo 11

Hình 1.11 Pectin trong công nghệ chế biến sữa 12

Hình 1.12 Pectin trong sản xuất đồ uống và nước sốt 13

Hình 1.13 Pectin trong công nghệ dược phẩm 13

Hình 1.14 Một số loại bưởi phổ biến ở Việt Nam 16

Hình 3.1 Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y1 52

Hình 3.2 Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y2 53

Hình 3.3a Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố lên hàm mục tiêu Y1 53

Hình 3.3b Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố lên hàm mục tiêu Y2 53

Hình 3.4 Mô hình bề mặt 2D trùng lắp của 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 54

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 1 Ảnh hưởng của các loại acid đến hàm lượng pectin thô thu được 37

Đồ thị 2: ảnh hưởng của loại acid đến hoạt tính chống oxy hóa của pectin 38

Đồ thị 3: Sự tương quan giữa hàm lượng pectin thô và hoạt tính chống oxy hóa tổng .38

Đồ thị 4 Ảnh hưởng của tỉ lệ DM:NL đến hàm lượng pectin thu được 39

Đồ thị 5 Ảnh hưởng của tỉ lệ DM:NL đến hoạt tính chống oxy hóa 40

Đồ thị 6: Sự tương quan giữa hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa 41

Đồ thị 7 Ảnh hưởng của pH đến lượng pectin thu được 42

Đồ thị 8 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chống oxy hóa của pectin 43

Đồ thị 9: Sự tương quan giữa hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa 43

Đồ thị 10 Ảnh hưởng của thời gian đến lượng pectin thu được 44

Đồ thị 11 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của pectin 45

Đồ thị 12: Sự tương quan giữa hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa 46

Đồ thị 13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng pectin thu được 47

Đồ thị 14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa của pectin 48

Đồ thị 15: Sự tương quan giữa hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa 49

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 1.1 hàm lượng pectin trong các nguyên liệu khác nhau 3

Bảng 1.2 Thể hiện phần trăm pectin trong các phế liệu của Bưởi 17

Sơ đố 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp 33

Sơ đồ 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ chiết thích hợp 33

Sơ đồ 2.6 Bố trí thí nghiệm xác định pH môi trường chiết thích hợp 34

Sơ đồ 2.5 bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp 35

Sơ đồ 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp 35

Bảng 2.1 Bảng quy đổi biến mã và biến thực 36

Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực bằng mô hình Box-behnken 36

Bảng 3.1 Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa 49

Bảng 3.2 Bảng thể hiện độ lệch chuẩn, độ tương tác và F của các yếu tố và hàm mục tiêu 50

Bảng 3.3 Bảng thể hiện xác suất và hệ số mô hình của 2 hàm mục tiêu 51

Bảng 3.4 Một số thành phần hóa học của pectin chiết từ vỏ và cùi bưởi 55

Sơ đồ 3.1 Quy trình tách chiết pectin đề xuất từ vỏ và cùi bưởi 56

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng pectin thu được và hoạt tính chống oxy hóa của pectin 62

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM:NL đến hàm lượng pectin thu được và hoạt tính chống oxy hóa của pectin 62

Bảng 4.3 Ảnh hưởng đến lượng pectin thu được và hoạt tính chống oxy hóa của pectin 63

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian đến lượng pectin thu được và hoạt tính chống oxy hóa của pectin 63

Bảng 4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng pectin thu được và hoạt tính chống oxy hóa của pectin 64

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DM:NL Dung môi: Nguyên liệu

SC-CO2 Supereritical carbon dioxide

TA Total antioxidant (Hoạt tính chống oxy hóa tổng)

SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

LỜI MỞ ĐẦU

Trong quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa, nhiều ngành công nghiệp trong nước ngày càng phát triển, trong đó ngành công nghệ thực phẩm hiện nay phát triển rất mạnh và góp phần cung cấp một lượng lớn thực phẩm cho xã hội, các sản phẩm của ngành như bánh kẹo, nước giải khát, sữa, mứt đông, mứt đáp ứng lượng lớn cho nhu cầu của Việt Nam cũng như trên thế giới hiện nay và sau này

Để có được những sản phẩm như vậy, một thành phần không thể thiếu và đóng vai trò quan trọng trong các sản phẩm đó là pectin Chúng là phụ gia quí và vô hại có khả năng tạo gel, tạo đông trong công nghệ chế biến để tạo ra các sản phẩm

đa dạng và phong phú, dễ bảo quản khi vận chuyển

Lượng pectin còn có nhiều trong phế liệu rau quả, trong công nghệ chế biến nước ép trái cây đặc biệt là vỏ - cùi bưởi Chúng là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, được thu nhận từ những phần không ăn được hay những phần kém giá trị dinh dưỡng Tái sử dụng phế liệu nông sản để chiết xuất pectin góp phần tạo sản phẩm giá trị gia tăng, bảo vệ môi trường và đem lại giá trị kinh tế cao

Vì những đặc điểm trên mà chúng tôi đã đưa ra hướng nghiên cứu của đề tài

“Nghiên cứu chiết và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của pectin thô từ vỏ và cùi bưởi Citrus sp” với các nội dung như sau:

- Nghiên cứu xác định dung môi chiết pectin (loại, nồng độ và tỷ lệ dung môi nguyên liệu)

- Nghiên cứu xác định nhiệt độ, thời gian chiết pectin

- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của pectin thô thu được

- Xác định một số thành phần hóa học của pectin thô

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về pectin

1.1.1 Nguồn gốc và cấu tạo pectin

Hình 1.1 Cấu trúc pectin Trái Thành tế bào thực vật Phải Trong thành tế bào thực vật

Pectin như một loại keo gắn chặt các tế bào thực vật với nhau, vì thế người ta gọi chúng là xi măng trong cấu trúc tế bào thực vật

Khi quả còn xanh, chúng là protopectin, protopectin chiếm tỉ lệ khá cao, protopectin không hòa tan trong nước giúp cho quả cứng

Khi quả chín dần, dưới tác dụng enzyme protopectinase, protopectin sẽ chuyển sang pectin hòa tan (pectin) và araban, làm giảm sự liên kết giữa các tế bào, quả trở nên mềm hơn Quá trình này xảy ra dưới tác dụng của acid và nhiệt độ trong quá trình chần ở 60-850C

 Nguồn nguyên liệu chứa pectin [6]

Pectin chứa nhiều trong các loại quả của trái cây: bưởi, táo, mận, cam, chanh,

cà rốt… Chúng tồn tại với những hàm lượng khác nhau trong quả, củ hoặc thân của một số loài thực vật Bảng 1.1 sau đây sẽ thể hiện một số loại nguyên liệu chứa pectin

Bảng 1.1 hàm lượng pectin trong các nguyên liệu khác nhau

Nguyên liệu Hàm lượng pectin

Hình 1.2 Cấu tạo pectin

Một chuỗi pectin bao gồm vài trăm đến khoảng 1.000 đơn vị saccharide, khối lượng phân tử phụ thuộc nguồn thu, trung bình từ 50 – 150kDa

Những acid galacturonic có chứa nhóm carboxyl, một số trong đó xuất hiện

tự nhiên như là este methyl và những chất khác sẽ được xử lý với amoniac để sản xuất hợp chất carboxamide

Hình 1.3 (a) một đoạn lặp đi lặp của phân tử pectin và chức năng của nhóm: (b) carboxyl; (c) methoxyl; (d) admine trong chuỗi pectin

Có 3 polysaccharide chính được nhận ra trong phân tử của pectin là:

Homogalacturonan(HG): HG là polymer mạch thẳng được hình thành bởi acid

D-galacturonic HG có thể bị acetyl hóa hoặc Methyl este hóa Chúng được gọi

là vùng mịn của pectin Các phân tử phân loại theo mức độ este của nó: pectin

có ít nhất 75% của nhóm cacboxyl methyl hóa, acid pectinic có ít hơn 75% của nhóm cacboxyl methyl hóa, acid pectic hay acid polygalacturonic không có nhóm cacboxyl methyl hóa [12]

Rhamnogalacturonan-І (RG-I): RG-I được tạo ra bởi sự lặp đi lặp lại

disaccharide rhamnose galacturonic acid Dư lượng galacturonic có thể được acetyl hóa và vừa có thể mang các chuỗi bên của đường galactose, arabinose và xylose [23]

Rhamnogalacturonan-II (RG-II): RGII là chuỗi homogalacturonic với chuỗi bên

phức tạp gắn liền với các dư lượng galacturonic [23] Vinken và đồng nghiệp [22] đã đề xuất một phân tử pectin mô hình cấu trúc trong đó HG và RGII là chuỗi bên dài của xương sống RG I cả hai chuỗi RG còn được gọi là vùng lông của phân tử pectin

1.1.2 Phân loại pectin [33]

1.1.2.1 Theo phần trăm nhóm methoxyl có trong phân tử

Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa, trong thương mại chia pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl hóa thấp

Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin – HMP): DE >50% hay MI >

7% Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm Muốn tạo đông cần phải có điều kiện pH = 3,1 – 3,4 và nồng độ đường trên 60%

Hình 1.4 Công thức HM pectin

Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin – LMP): DE < 50 % hay MI <

7%, được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân tử pectin Pectin methoxy thấp có thể tạo đông trong môi trường không có đường Chúng thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm

Hình 1.5 Công thức LM pectin

Ngoài ra pectin còn được tác dụng với amoniac (amide hóa) để sản xuất hợp chất carboxamide ứng dụng vào các lĩnh vực khác

Hình 1.6 Công thức pectin được amide hóa

1.1.2.2 Theo khả năng hòa tan trong nước

Pectin hòa tan (methoxyl polygalacturonic): là ester methylic của acid polygalacturonic

Pectin không hòa tan (protopectin): tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước Trong thành phần có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan

1.1.3 Tính chất, hoạt tính sinh học và ứng dụng của pectin

1.1.3.1 Tính chất của pectin [5],[7]

Đặc tính quan trọng của pectin là khi có mặt acid và đường sẽ tạo thành chất keo

- Pectin thuộc nhóm các chất đông tụ

- Là chất keo hút nước, dễ tan trong nước, không tan trong ethanol Khi hòa tan trong nước tạo dung dịch keo có độ nhớt cao

- Dung dịch pectin có độ nhớt cao Nếu muốn thu dịch quả ép thì dung dịch này bất lợi, người ta phải dùng enzyme pectinase để thủy phân pectin, giảm độ nhớt

- Pectin tự do mất khả năng tạo đông khi có đường Vì vậy để duy trì khả năng tạo gel của pectin hòa tan cần chú ý tránh môi trường kiềm hoặc tác dụng thủy phân của enzyme pectinase

- Đối với pectin tan thì dưới tác dụng của pectinase sẽ biến thành acid pectinic (thường dưới dạng muối Ca và Mg) và các chất đơn giản khác như rượu methylic, acid acetic, arabinose, galactose

- Cơ chế quá trình thủy phân pectin rất phức tạp, nó chia làm hai giai đoạn Quá trình chuyển hóa pectin có thể xảy ra trong điều kiện yếm khí, cả hai qúa trình đều xãy ra rất mạnh trong điều kiện tự nhiên

Ta có thể xem quá trình xảy ra từng bước đó như sau:

 Giai đoạn thứ nhất thủy phân chất pectin thành đường:

C46H68O40 + 10H2O = 4CHO(CHOH)4COOH + C6H12O6 + C5H10O5 + C5H10O5 + 2CH3COOH + 2CH3OH

 Giai đoạn thứ 2 là biến đường thành các sản phẩm lên men :

Khi lên men galactose sẽ tạo thành acid buthyric, khí cacbonic, hydro và tỏa một ít năng lượng:

C6H12O6 = CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2 + mKCal

Khi lên men arabinose sẽ tạo thành acid buthyric, khí cacbonic, nước và tảo một ít năng lượng:

- Khả năng tạo gel của pectin tùy vào mức độ methoxyl hoá khác nhau mà cơ chế tạo gel cũng khác nhau

 HMP : Tạo gel bằng liên kết hydro:

Nguyên tắc: Pectin là polysacharide tan được trong nước Khi phân tán trong nước

mỗi phân tử sẽ liên kết với các phân tử bên cạnh tạo thành một cấu trúc không gian

ba chiều nhốt các phân tử nước bên trong tạo thành khối gel

Hình 1.7 Cơ chế gel của pectin bằng lên kết hydro

 Điều kiện tạo gel: [Đường] > 50%, pH = 3 ÷ 3,5; [Pectin] = 0,5 ÷ 1%

- Đường có khả năng hút ẩm, vì vậy chúng làm giảm mức độ hydrat hóa của

phân tử pectin trong dung dịch

- Ion H+ được thêm vào hoặc đôi khi chính nhờ độ acid của quá trình chế biến trung hòa bớt các gốc COO-, làm giảm độ tích điện của các phân tử Vì vậy các phân tử có thể tiến lại gần nhau để tạo thành liên kết nội phân tử và tạo

gel

- Trong trường hợp này liên kết giữa các phân tử pectin với nhau chủ yếu nhờ các cầu hydro giữa các nhóm hydroxyl Kiểu liên kết này không bền, do đó các gel tạo thành sẽ mềm dẻo do tính di động của các phân tử trong khối gel,

loại gel này khác biệt với gel thạch hoặc gelatin

 Cấu trúc của gel: phụ thuộc vào hàm lượng đường, acid, pectin, loại pectin

và nhiệt độ

- 30 ÷ 50% đường thêm vào pectin là saccharose Do đó cần duy trì pH acid để khi đun nấu sẽ gây ra quá trình nghịch đảo đường saccharose, ngăn cản sự kết tinh của đường saccharose Tuy nhiên cũng không nên dùng quá nhiều acid, vì pH quá thấp sẽ gây ra nghịch đảo một lượng lớn saccharose gây kết tinh glucose và hóa gel nhanh tạo nên các vón cục

- Khi dùng lượng pectin vượt quá lượng thích hợp sẽ gây ra gel quá cứng, do

đó khi dùng một nguyên liệu có chứa nhiều pectin cần tiến hành phân giải bớt chúng bằng cách đun lâu hơn

- Khi sử dụng một lượng cố định bất cứ một loại pectin nào pH, nhiệt độ càng giảm và hàm lượng đường càng cao thì gel tạo thành càng nhanh

 LMP : Tạo gel bằng liên kết với ion Ca 2+

Nguyên tắc: Gốc acid của phân tử pectin liên kết với ion Ca2+ tạo nên khối gel

Hình 1.8 Cơ chế tạo gel của pectin bằng liên kết với ion Ca 2+

 Điều kiện tạo gel: khi có mặt Ca2+, ngay cả ở nồng độ < 0,1% miễn là chiều dài phân tử pectin phải đạt mức độ nhất định Khi đó gel được tạo thành ngay

cả khi không thêm đường và acid

- Khi chỉ số methoxyl của pectin thấp, cũng có nghĩa là tỷ lệ các nhóm – COOcao, thì các liên kết giữa những phân tử pectin sẽ là liên kết ion qua các ion hóa trị hai đặc biệt là Ca2+

- Cấu trúc của gel: phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ và chỉ số methoxyl Gel pectin

có chỉ số methoxyl thấp thường có tính chất đàn hồi giống như gel agar-agar

1.1.3.2 Hoạt tính sinh học của pectin [30]

Pectin là chất xơ hoà tan trong nước Chúng không cung cấp năng lượng, nhưng có nhiều giá trị phòng, chữa bệnh như:

Kéo dài thời gian tiêu hoá thức ăn trong ruột, có tác dụng tăng hấp thu dưỡng chất trong thức ăn Giảm béo (do tạo cảm giác no bụng kéo dài, giảm năng lượng ăn vào, do đó giúp giảm cân ở người béo phì)

Giảm hấp thu lipid

Chống tiêu chảy Pectin sẽ được phân hủy trong ruột bởi các vi khuẩn tốt, tạo thành một lớp niêm mạc bảo vệ dạ dày, giúp xoa dịu và ngăn ngừa các chất gây kích thích ruột Quá trình phân hủy này cũng làm tăng lượng prebiotic, giúp tăng lượng prebiotic, giúp tăng số lượng vi khuẩn đường ruột “tốt”( tấn công các vi khuẩn gây tiêu chảy ngay khi chúng xuất hiện)

Giảm cholesterol toàn phần trong máu

Khống chế tăng đường huyết trước và sau bữa ăn ở người có bệnh tiểu đường

Hoa quả có nhiều pectin giúp cơ thể hấp thu tốt các acid hữu cơ và là chất trung gian thúc đẩy sự chuyển hóa, tăng khả năng sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn

1.1.3.3 Ứng dụng của pectin

 Trong công nghệ thực phẩm [35][36]

 Ứng dụng của pectin trong công nghệ chế biến rau quả

Pectin là tác nhân tạo gel quan trọng nhất được sử dụng để tạo ra cấu trúc gel cho thực phẩm, chủ yếu là những thực phẩm có nguồn gốc từ rau quả Khả năng tạo gel của chúng còn được sử dụng ở những thực phẩm cần sự ổn định của nhiều phụ gia, hoặc trong sản phẩm cuối, hoặc ở một giai đoạn tức thời trong qui trình sản xuất

- Tác dụng tạo gel của pectin được sử dụng chủ yếu ở những loại thực phẩm cần có hình dạng thật tự nhiên

Hình 1.9 Sản phẩm có sử dụng pectin

 Trong mứt trái cây và mứt đông

- Vai trò quan trọng của pectin là nhằm tạo ra một cấu trúc cho mứt đông và mứt trái cây, để những sản phẩm này khi vận chuyển vẫn không thay đổi cấu trúc, tạo ra mùi vị ngon cho sản phẩm, và giảm đến tối đa sự phân rã

- Quá trình sản xuất mứt đông và mứt trái cây phải đảm bảo tạo ra sự phân

bố đồng đều giữa các phân tử trong pha liên tục, ngay từ khi quá trình khuấy trộn

ngừng lại Hàm lượng pectin sử dụng trong mứt trái cây và mứt đông thường trong khoảng từ 0,1 - 0,4%

- Pectin có khả năng tạo gel nhanh có giá trị đặc biệt trong sản xuất mứt, vì yêu cầu của sản phẩm phải tạo được gel, tạo đặc trước khi đóng hộp

- Quá trình tạo gel của pectin có thể được tạo ra trong một qui trình lạnh bằng 2 cách:

+ Trộn syrup đường pectin có hàm lượng chất khô hoà tan từ 60 ÷ 65%, pH bằng 3,8 ÷ 4,2 với dịch acid trái cây để đạt được pH = 3

+ Trộn dung dịch pectin có pH = 2,9 và hàm lượng hoà tan là 25% với syrup đường để thu được hỗn hợp mới có hàm lượng chất khô 23%

- LMP: (tạo gel bằng liên kết với ion Ca2+) thường được ứng dụng trong mứt trái cây có hàm lượng chất khô hòa tan nhỏ hơn 55% Loại LMP được chọn lựa trên hàm lượng chất khô và pH trong sản phẩm có hàm lượng chất khô rất thấp, ví dụ như: mứt trái cây không đường cho người bị tiểu đường LMP khó tạo đủ liên kết với nước và carragenan thích hợp hơn Trong một số trường hợp người ta có thể sử dụng cả pectin và carragenan

 Sử dụng pectin trong sản xuất bánh kẹo

Hình 1.10 Ứng dụng pectin trong sản xuất bánh kẹo

Pectin tăng tính hấp dẫn, tạo cấu trúc đàn hồi, tăng mùi vị trái cây tự nhiên và

bề mặt bóng loáng cho sản phẩm Pectin là chất tạo gel tốt, tan nhanh, ổn định Vì vậy, pectin được ứng dụng nhiều trong công nghiệp bánh kẹo như: kẹo dẻo, bánh ngọt nhân hoa quả, lớp mặt bánh kem…

 Ứng dụng của pectin trong công nghiệp chế biến sữa

Pectin bổ sung hương vị trái cây cho các sản phẩm sữa chua Cho pectin vào sữa lên men với liều lượng vừa đủ, trộn đều để được dung dịch đồng nhất Trong yaourt trái cây, pectin tạo cấu trúc mịn, giúp phân bố đều các mẫu trái cây nhỏ trong sữa Chúng còn làm cho sản phẩm có bề mặt nhẵn bóng Trong các sản phẩm nhiều lớp, pectin còn có tác dụng ổn định và giữ cho trái cây không bị tách khỏi yaourt Trong yaourt uống, pectin từ bưởi bảo vệ protein không bị biến tính trong quá trình tiệt trùng, ngăn chặn protein kết tủa và sự kết đông, giúp sản phẩm ổn định và đạt tính chất cảm quan tốt nhất, không giảm chất lượng ngay cả khi bảo quản một thời gian dài, nhằm cải thiện cấu trúc yaourt, tạo kết tủa dạng mịn và làm tăng giá trị cảm quan thực phẩm trong sữa chua

Hình 1.11 Pectin trong công nghệ chế biến sữa

 Sử dụng pectin trong sản xuất đồ uống và nước sốt

Hình 1.12 Pectin trong sản xuất đồ uống và nước sốt

Việc sử dụng pectin trong các sản phẩm đồ uống rất phù hợp, vì chúng có cacbonhydrate tự nhiên năng lượng thấp và ổn định tính đục của sản phẩm

1.1.3.4 Trong công nghệ dược phẩm [32],[35]

Hình 1.13 Pectin trong công nghệ dược phẩm

Pectin được dùng để chế biến thuốc uống, thuốc tiêm để cầm máu trước và sau phẫu thuật răng hàm mặt, tai mũi họng, phụ khoa Chữa cháy máu đường tiêu hóa, tiết niệu

Dung dịch pectin 5% được sử dụng như thuốc sát trùng trong phẫu thuật răng hàm mặt, tai mũi họng, thấm bông nhét vào chỗ răng để cầm máu Trên thị trường hiện có dược phẩm Hacmophobin (Đức) và Arhemapctin (Pháp)

1.1.4 Tình hình nghiên cứu pectin ở Việt Nam và trên thế giới

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu pectin ở Việt Nam

- Năm 2008, tác giả Tạ Duy Tiên [24] đã tiến hành tách chiết, tinh sạch

pectin và điều chế dẫn xuất chlorophyllin tan trong nước từ lá dây sâm Cocculus sarmentosus (lour.) Diels,

- Năm 2009, tác giả Bùi Anh Võ [1] đã tiến hành nghiên cứu thu nhận pectin

từ vỏ cà phê Tác giả đã chỉ ra điều kiện chiết pectin từ vỏ cà phê là: tỷ lệ DM:NL là 19/1, nhiệt độ 1000C, pH = 1 và thời gian chiết là 1 giờ với acid H2SO4 được sử dụng để điều chỉnh pH

- Năm 2010, các tác giả Võ Thị Xuân Hạ và Trương Thị Thu Hà - Trường cao đẳng công nghệ đã công bố kết quả thu nhận pectin từ phế liệu quả bưởi và ứng dụng để sản xuất mứt xoài đông [31]

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu Pectin trên thế giới

- Việc sản xuất pectin thương mại đầu tiên được ghi nhận vào 1908 ở Đức

và quá trình sản xuất này được truyền nhanh chóng sang Hoa Kỳ, tại nơi này một bằng sang chế cổ điển được trao cho Douglas (US pat 1.082,682, 1913) [32]

- Tác giả Padivalet al (năm 1979) [18] đã nghiên cứu và công bố kết quả về các chỉ số của pectin

- Các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Thực phẩm Anh do giáo sư Vic Morris dẫn đầu, mới đây phát hiện một loại sợi gọi là pectin trong phần lớn rau quả tươi, có thể ngăn chặn nguy cơ phát triển ung thư [26]

- Mohnen năm 2002 đã nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của pectin [16]

- Một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mới từ Mỹ, được viết trên tạp chí Glycobiology cho thấy, pectin có thể gây chết tế bào lập trình trong các tế bào ung thư tuyến tiền liệt Những gì báo cáo này cho thấy là nếu bạn lấy tế bào ung thư tuyến tiền liệt của con người và thêm pectin, bạn có thể tạo ra tế bào chết được lập trình", ông Debra Mohnen nhà nghiên cứu tế bào "Nếu bạn làm như vậy không phải ung thư bằng tế bào chết không xảy ra" [13]

1.2 Tổng quan về nguyên liệu

1.2.1 Đặc tính thực vật của cây bưởi

Bưởi (có tên khoa học là Citrus grandis Linn hay Citrus grandis Osbeck

thuộc họ Cam_ Rutaceae)

+ Có thân gai cao từ 1,5 ÷ 4m hoặc hơn, nhiều nhánh, sống lâu năm

+ Lá lớn, dai nguyên Trong lá có dầu, chủ yếu Dipenten, Linalola và Xitrala + Hoa bưởi trắng, mọc đơn hay thành từng chùm từ 2 ÷ 10 hoa với 4 ÷ 5 lá đài, 4 ÷ 5 cánh hoa, nhiều nhị và 5 ÷ 10 tâm bì

+ Quả bưởi hình cầu, đường kính từ 10 ÷ 13 cm, màu xanh, khi chín hơi ngả vàng, có vỏ dày 1 ÷ 2 cm Vỏ ngoài chứa ester và khoảng 26% xitrala Vỏ trong có Nigin, đường Ramnoza, vitamin A , C , Hesperidin

+ Múi bưởi chứa 9% acid citric , 14% đường, các enzyme, các vitamin (A, C,

B1)

1.2.2 Một số loại bưởi phổ biến

Ở Việt Nam có rất nhiều loại bưởi, đa dạng và phong phú, có nhiều cách phân biệt loại bưởi: như bưởi Thanh (gốc Huế), bưởi Long (gốc Tiền Giang), bưởi năm roi (gốc Cần Thơ, Vĩnh Long), bưởi Xiêm Vang, bưởi đường lá cam ( lá như lá cam), bưởi đường hồng, bưởi đường núm, bưởi da láng, bưởi da xanh, bưởi da cóc, bưởi bung, bưởi chùm, bưởi ổi Mỗi năm, bưởi ra hoa khoảng 2 lần, nhất là những tháng mưa Dễ dàng ra trái vụ Bưởi thích hợp với đất phù sa, nhiều mùn và khí hậu mát mẻ Sau đây chúng ta có thể tìm hiểu một số loại bưởi sau:

Giống bưởi da xanh Bưởi đường lá cam Bưởi năm Roi

Bưởi Phúc Trạch Bưởi Đoan Hùng

Hình 1.14 Một số loại bưởi phổ biến ở Việt

Nam

1.2.3 Thành phần hóa học của bưởi

- Nước quả bưởi chứa nhiều chất bổ dưỡng, như các loại đường trái cây, đạm, béo, acid tannic, beta - caroten và các chất khoáng như phospho, magnesium, iron, calcium, kalium, các vitamin B1, B2, C

- Vỏ quả ngoài rất giàu narin – gosid, do đó có vị đắng, trong vỏ có tinh dầu,

tỷ lệ 0,8 ÷ 0,84% Tinh dầu vỏ quả chứa d – limemen, a – pinen, linadol, geraniol, citral, còn có các ancol, pectin, acid citric

- Quả chứa 0,5% tinh dầu

- Trong lá cũng có tinh dầu

- Dịch quả chín có nhiều chất bổ dưỡng: nước 49%, glucid 9%, protid 0,6%, lipid 0,1%, và các khoáng: Ca 20mg%, P 20mg%, K 190mg%, Mg 12mg%, S 7mg%, và Na, Cl, Fe, Cu, Mn…, các vitamin (tính theo mg%) C 40; B 0,07; B2 0,05; PP 0,3 và tiền sinh tố A 0,1 100ml dịch quả cung cấp cho cơ thể 43 calo

1.2.4 Phế liệu bưởi

Bảng 1.2 Thể hiện phần trăm pectin trong các phế liệu của Bưởi

Năm 2011, sản lượng bưởi đạt 417,6 nghìn tấn [10] Phế liệu bưởi được sử dụng không nhiều so với số lượng của chúng thải ra Chủ yếu phế liệu bưởi được sử dụng vào việc chăm sóc sức khỏe như:

- Hạt bưởi: dùng để chế nước pectin để uống, chữa ăn không tiêu

- Vỏ bưởi: Vị đắng ngọt, tính ấm Giảm ho long đờm, điều khí giảm đa Tinh dầu của vỏ bưởi chữa rụng tóc, hói đầu

- Cùi bưởi: sử dụng để nấu chè bưởi

1.3 Một số phương pháp chiết pectin

1.3.1 Phương pháp CO 2 siêu tới hạn

Là quá trình phân tách một hay một số chất từ hỗ hợp (dược liệu, hỗn hợp nguyên liệu) bằng cách sử dụng chất lỏng CO2 siêu tới hạn như một dung môi Gore (1891) là người đầu tiên phát hiện ra khả năng hòa tan tốt của Napptalen và Camphor trong CO2 lỏng

Sau đó Andrews (1875) đã nghiên cứu về đặt tính của CO2 ở trạng thái siêu tới hạn Tuy nhiên tới đầu những năm 1970 công nghệ chiết xuất các hợp chất tự nhiên bằng dung môi CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) mới thực sự phát triển và đi vào ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm như loại cafein trong

cà phê và chè xanh, chiết xuất dầu vừng đen, chiết polyphenol từ chè xanh, chiết xuất các hoạt chất chống oxy hóa, chiết xuất các tinh dầu, hương liệu từ thực vật sử dụng trong mỹ phẫm, thực phẩm…

Các phế liệu Khối lượng

( % )

Hàm lượng Pectin ( % )

Hiệu suất thu hồi ( % )

 Nguyên lý

Bất kỳ dung môi nào cũng sẽ ở trạng thái siêu tới hạn nếu tồn tại ở nhiệt độ

và áp suất trên giá trị tới hạn

Đối với mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng và khí Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở

đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical) Vật chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng [21]

Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ, áp suất tới hạn của nó (trên TC = 310C, PC = 73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn Tại trạng thái này CO2 mang hai đặc tính: Đặc tính phân tách của quá trình

trích ly và đặc tính phân tách của quá trình chưng cất [15]

Chúng có khả năng hoà tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được thoát ra ở bình hứng Ở mỗi điều kiện nhiệt độ, áp suất khác nhau sẽ tương ứng với mỗi một đối tượng cần chiết tách khác nhau Khi ở trạng thái này CO2 có đặt tính:

- Không còn ở thể lỏng, nhưng độ tan tương tự như một chất lỏng (do nhiệt độ cao)

- Nhưng chúng vẫn chưa thành thể khí, chúng có khả năng khuếch tán và hòa tan nhanh các hoạt chất trong dược liệu (do áp suất cao) Có độ nhớt phase lỏng (dễ xâm nhập vào mẫu)

- Có khả năng truyền khối lớn phase khí (chiết xuất được cạn kiện hoạt chất)

- Dung môi thông dụng nhất: Dioxytcarbon CO2 (không phân cực) điểm siêu tới hạn ở 310C/73atm nên dễ đạt, dễ duy trì Dễ áp dụng ở quy mô công nghiệp, không cháy nổ, anh toàn, than thiện với môi trường

- Hòa tan tốt các chất không phân cực các chất phân cực kém

- Hòa tan ít chlorophyll, sáp, carotenoid

- Không tan trong đường, protein, thuốc trừ sâu, acid amin, tannin

 Ưu điểm của phương pháp:

CO2 có điểm tới hạn thấp (gần với nhiệt độ phòng, áp suất thấp)

- Các hoạt chất ít bị oxy hóa hay phân hủy bởi nhiệt độ và oxy hòa tan Vấn đề thiết kế hệ thống chiết xuất đảm bảo đủ áp lực siêu tới hạn cũng dễ dàng hơn

- Khả năng ứng dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp cũng thuận lợi Thay thế hoàn toàn dung môi, không để lại dấu vết của các dung môi hữu cơ trong sản phẩm Sản phẩm sau khi chiết không còn tồn dư dung môi vì CO2 dễ dàng chuyển sang trạng thái khí và bay hơi toàn bộ sau khi giảm áp suất, nhiệt độ xuống điểm tới hạn Vì vậy hoạt chất chiết xuất theo phương pháp này rất phù hợp đối với các sản phẩm dung thực phẩm, thuốc, mỹ phẩm

- CO2 làm giảm đáng kể các hoạt động vi sinh

- Độ tan của SC-CO2 thay đổi khi áp suất và nhiệt độ đạt siêu tới hạn thay đổi, nên chúng sẽ hòa tan chọn lọc các chất khác ở nhiệt độ, áp suất tương ứng thông thường các tinh dầu được chiết ở áp suất dưới 100bar, trong khi các chất béo được chiết ở áp suất cao hơn

- Thời gian chiết xuất ngắn: Do chất lỏng siêu giới hạn có hệ số khuếch tán cao hơn chất lỏng, trong khi độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ nên khả năng khuếch tán cảu dung môi vào trong tế bào nhanh hơn vì vậy thời gian chiết được ngắn hơn chất lỏng thong thường

- Không thay đổi hoặc mất mùi hương thơm, màu sắc, tự nhiên ban đầu của hoạt chất không tạo ra mùi, vị lạ do SC-CO2 là chất trơ, không mùi vị và bay hơi hoàn toàn khi thay đổi trạng thái siêu tới hạn

- CO2 không ăn mòn thiết bị, không gây cháy nổ trong qáu trình vận hành, an toàn, thân thiện với môi trường, giá thành rẻ, dễ kiếm ngoài ra còn tái sử dụng trong thời gian dài

1.3.2 Phương pháp chiết hồi lưu (soxhlet)

Bộ chiết soxhlet là thiết bị ở phòng thí nghiệm được phát minh năm 1879 bởi Franz Von Soxhlet [22] Ban đầu được thiết kế để chiết tách lipid từ vật liệu rắn [20] Thông thường bộ chiết soxhlet chỉ cần được yêu cầu là nơi để hòa tan các hợp chất mong muốn vào dung môi, và không hòa tan các tạp chất vào dung môi đó Nếu các hợp chất mong muốn có mức hòa tan đáng kể vào trong dung môi, thì sau

đó chỉ cần một quá trình lọc đơn giản là có thể phân tách các hợp chất từ các chất không hòa tan

Thông thường thì nguyên liệu rắn có chứa một vài hợp chất cần tách chiết, sẽ được gói vào trong một loại giấy được làm từ giấy lọc dày, rồi được nạp vào buồng chính của bộ soxhlet (bình trụ chiết)

 Nguyên tắc hoạt động

Bộ soxhlet sẽ được đặt vào một bình có chứa dung môi để chiết tách Sau đó,

bộ soxhlet được lắp với một bình ngưng Dung môi được làm nóng để bay hơi Hơi dung môi sẽ đi lên theo ống dẫn hơi và tràn vào bình trụ chiết Bình ngưng đảm bảo hơi dung môi được làm mát, ngưng tụ rồi rơi lại xuống bình trụ chiết chứa gói mẫu Bình trụ chiết chứa mẫu sẽ từ từ được làm đầy bởi dung môi ấm, một vài hợp chất mong muốn sẽ được hòa tan vào dung môi ấm Khi bình trụ chiết gần như được làm đầy bởi dung môi, thì tự động dung môi sẽ theo ống xi-phông chạy xuống trở lại bình chứa dung môi Chu kì này được cho phép lặp lại nhiều lần trong giờ hoặc trong ngày

Trong mỗi chu kì, một phần các hợp chất không bay hơi sẽ hòa tan vào dung môi Sau nhiều chu kì, các hợp chất mong muốn sẽ được tập trung vào bình chưng cất

1.3.3 Phương pháp ngâm chiết [8]

1.3.3.1 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation)

Phương pháp ngấm kiệt là một trong những phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến nhất không đòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian

Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi đã bão hòa hoạt chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi mới Tuy vậy không thực hiện liên tục mà mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 12 giờ, cho dung môi bão hòa chảy ra rồi thay thế bằng dung môi mới và tiếp tục quá trình trích ly

1.3.3.2 Chiết bằng phương pháp ngâm dầm (Maceration)

Phương pháp ngâm dầm không hiệu quả gì hơn so với phương pháp ngấm kiệt Ngâm nguyên liệu vào trong bình chứa thủy tinh có nắp đậy Rót dung môi phủ lớp mẫu, để ở điều kiện nhiệt độ theo yêu cầu, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu và hòa tan các hoạt chất tự nhiên Sau một thời gian dung môi trong bình được đổ ra và rót dung môi mới vào

1.4 Một số quá trình xảy ra trong quá trình chiết [2]

Khi nguyên liệu và dung môi tiếp xúc nhau, lúc đầu dung môi thấm vào trong dược liệu, sau đó hoạt chất trong tế bào hòa tan vào dung môi, khi đó xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dung dịch chiết trong thành tế bào và dung môi bên ngoài Hoạt chất được khuếch tán ra ngoài tế bào Trong chiết xuất dược liệu tự nhiên xảy ra một số quá trình: khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích…

1.4.1 Quá trình khuếch tán

Quá trình di chuyển vật chất từ pha này sang pha khác khi hai pha tiếp xúc trực tiếp nhau gọi là quá trình khuếch tán (quá trình chuyển khối) Quá trình tách chất hòa tan trong nguyên liệu bằng dung môi chính là quá trình chiết và nguyên liệu là pha rắn, dung môi là pha lỏng

Khi hai pha chuyển động tiếp xúc nhau thì trên bề mặt phân chia pha tạo thành lớp màng, ở lớp màng luôn có chế độ chuyển động dòng và ở giữa dòng có thể có chuyển động xoáy Đặc trưng di chuyển vật chất trong màng và trong nhân của dòng khác nhau

Trong lớp màng, quá trình di chuyển vật chất cơ bản là nhờ sự tiếp xúc giữa các phân tử và sự tác dụng tương hỗ giữa chúng, do đó quá trình khuếch tán qua màng được gọi là quá trình khuếch tán phân tử Trong nhân, quá trình di chuyển vật chất nhờ sự xáo trộn các phân tử của dòng, vì thế gọi là khuếch tán đối lưu

Quá trình khuếch tán trong lớp màng xảy ra rất chậm so với quá trình khuếch tán trong nhân của dòng, do đó mặc dù lớp màng rất mỏng nhưng vẫn có giá trị quyết định đối với quá trình khuếch tán Vận tốc khuếch tán chung phụ thuộc nhiều vào vận tốc khuếch tán trong màng

1.4.1.1 Khuếch tán phân tử

Khuếch tán phân tử xảy ra trong lớp màng hay trong môi trương đứng yên Động lực của quá trình khuếch tán là gradien nồng độ theo hướng x, tức là sự biến đổi nồng độ trên một đơn vị đường đi

Bản chất của quá trình chiết xuất chất là quá trình khuếch tán nên người ta dựa vào định luật Fick để giải thích và tính toán

Vận tốc khuếch tán : lượng vật chất đi qua một đơn vị bề mặt trong một đơn

vị thời gian Theo định luật Fick, vận tốc khuếch tán tỷ lệ với gadien nồng độ = D

Trong đó:

: vận tốc khuếch tán

D: Hệ số tỷ lệ (hệ số khuếch tán)

: Gradient nồng độ

Dấu ( ) : Nồng độ giảm theo hướng khuếch tán

Hệ số khuếch tán phân tử là lượng vật chất đi qua một đơn vị bề mặt, trong một đơn vị thời gian khi nồng độ vật chất giảm đi một đơn vị trên một đơn vị chiều dài khuếch tán Hệ số khuếch tán của một chất đặc trưng cho tính chất khuếch tán của chất đó trong một môi trường nào đấy

Công thức tình hệ số khuếch tán: D =

Trong đó: R: hằng số khí

N: hằng số Avogadro

T: nhiệt độ tuyệt đối

r: bán kính của phân tử khuếch tán

Ứng dụng: trong quá trình chiết dược liệu, đặc trưng của quá trình khuếch tán qua màng tế bào chính là khuếch tán phân tử Dựa vào định luật Fick, thấy những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết là độ mịn của dược liệu, thời gian, nhiệt

độ và dung môi chiết, sự khuấy trộn, kích thước của phân tử khuếch tán

1.4.1.2 Khuếch tán đối lưu

Trong chiết xuất dược liệu, quá trình khuếch tán của chất tan trong dung môi được đặc trưng chủ yếu bằng khuếch tán đối lưu khuếch tán trong môi trường chất lỏng chuyển động được mô tả bằng phương trình vi phân

độ cao hơn, cho đến khi áp suất thủy tĩnh cân bằng với áp lực thẩm thấu

Ứng dụng: trong tế bào dược liệu có chất nguyên sinh có tính bán thấm, vì vậy khi còn tươi chỉ có dung môi thấm được vào tế bào, làm cho dược liệu bị trương nở, còn chất tan trong tế bào không khuếch tán ra ngoài được Do đó trong chiết xuất, người ta tìm cách phá hủy nguyên sinh chất bằng nhiệt hoặc cồn để thực hiện quá trình chiết xuất

1.4.3 Quá trình thẩm tích

Là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua một màng có tính chất thẩm tích, có nghĩa là màng không chỉ cho dung môi đi qua mà còn cho cả chất tan đi qua, nhưng chỉ cho qua các phân tử nhỏ

Ứng dụng: màng tế bào dược liệu có tính chất của một màng thẩm tích, do

đó khi chiết xuất nếu màng tế bào còn nguyên vẹn thì chỉ có chất tan là phân tử nhỏ

và ion (phần lớn là hoạt chất) khuếch tán qua màng tế bào, còn các chất có phân tử lớn (thường là chất keo, tạp chất…) thì không qua được màng tế bào nên không bị

chiết vào dịch chiết Như vậy có thế coi màng tế bào như một màng lọc sinh học có tính chọn lọc Đây chính là ưu điểm của màng tế bào đối với quá trình chiết xuất

Do đó trong quá trình chiết xuất không nên xay quá mịn, vì khi đi màng tế bào bị phá vỡ, tính chọn lọc của màng tế bào không còn, dịch chiết lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình nghiên cứu về sau

1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết [2]

1.5.1 Dung môi

- Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng chiết tách không giống nhau Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bê mặt

- Độ phân cực của dung môi: dung môi kém phân cực thì dễ hòa tan những

chất không phân cực, dung môi càng phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phân cực

- Độ nhớt và sức căng bề mặt: độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng

nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chất cần chiết Độ nhớt cao sẽ cản trở quá trình khuếch tán của chất chiết làm giảm hiệu quả chiết

1.5.2 Nhiệt độ chiết

- Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Eintein, khi nhiệt độ tăng thì hệ

số khuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:

+ Đối với hợp chất kém bền ở nhiêt độ cao: nhiêt độ tăng cao sẽ gây phá hủy

một số hoạt chất như vitamine, glycosid, alkaloid…

+ Đối với tạp: khi nhiêt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng

của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một số tạp như gôm, chất nhầy… khi nhiêt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế

+ Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiêt độ thì

dung môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi

+ Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độ

tăng, độ tan của chúng lại giảm Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt

độ

Từ những phân tích trên thấy tùy từng trường hợp cụ thể mà lựu chọn nhiệt

độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết…)

1.5.3 Thời gian chiết xuất

Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp như nhựa, keo…) Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết, thành phần dược liệu dung môi, phương pháp chiết… phù hợp

1.5.4 Độ mịn của nguyên liệu

Khi kích thước của nguyên liệu chiết thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt được dược liệu, hoạt chất khó hòa tan vào dung môi Khi độ mịn của nguyên liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu chiết và dung môi tăng lên; theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết sẽ nhanh hơn Tuy nhiên thực tế nếu nguyên liệu chiết quá mịn sẽ gặp một số bất lợi sau:

- Bột nguyên liệu bị dính bết vào nhau tạo thành dạng bột nhão vón cục, khi

đó sẽ làm chậm quá trình chiết xuất Mặt khác khi lọc dịch chiết dịch sẽ chảy chậm hoặc không chảy được vì bột nguyên liệu dính kết vào nhau và do các hạt kích thước nhỏ bít kín lỗ chảy của màng lọc

- Nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản

- Từ đó phải lựa chọn độ mịn nguyên liệu thích hợp, tùy trường hợp cụ thế, tùy vào nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết … Vd: với nguyên liệu đã già cần xay mịn; với nguyên liệu nhiều chất nhầy, chất nhựa nên xay thô Với dung môi dễ hòa tan nhiều tạp hoặc chiết ở nhiệt độ cao thì nguyên liệu không nên quá mịn

1.5.5 Tỷ lệ dung môi - nguyên liệu

- Tỷ lệ DM:NL góp phần quan trọng trong việc chiết xuất, tạo điều kiện khuếch tán các chất từ trong tế bào ra ngoài dung môi Nếu tỷ lệ DM: NL quá thấp dẫn đến tốc độ khuếch tán cơ chất chậm, có thể dẫn đến hiệu suất chiết thấp, ngược lại nếu tỷ lệ DM: NL cao quá sẽ tạo ra hiệu suất cao thời gian ngắn, nhưng tốn kém trong thu hồi dung môi và tốn dung môi

1.5.6 pH dung môi chiết

pH dung môi chiết ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng cũng như hoạt tính của các chất chiết được Nếu pH acid cao hay kiềm cao có thể gây phá hủy cấu trúc hoặc chuyển trạng thái hoạt chất chiết được, dẫn đến mất đi tính chất cơ bản của hoạt chất Nên nghiên cứu pH dung môi chiết là rất cần thiết

1.6 Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken

- Sử dụng thiết kế Behnken-Box trong thống kê để bố trí thí nghiệm tối ưu hóa Thiết kế Behnken-Box là thiết kế thử nghiệm cho phương pháp bề mặt phản

ứng, được nghĩ ra bởi George EP Box và Donald Behnken vào năm 1960, nhằm đạt được các mục tiêu sau đây:

+ Mỗi yếu tố, hoặc biến độc lập, được đặt tại một trong ba giá trị cách đều nhau (Ít nhất ba cấp độ là cần thiết cho mục tiêu tiếp theo)

+ Thiết kế nên vừa đủ để phù hợp với một mô hình bậc hai, đó là có chứa các giới hạn bình phương và các sản phẩm của hai yếu tố

+ Tỷ lệ của số lượng các điểm thử nghiệm với số lượng các hệ số trong mô hình bậc hai nên hợp lý (trên thực tế, các thiết kế thường giữ nó trong khoảng từ 1,5 đến 2,6)

+ Phương sai ước tính nên nhiều hoặc ít, chỉ phụ thuộc vào khoảng cách từ trung tâm ( điều này đạt được sự chính xác cho các thiết kế với 4 và 7 yếu tố), không nên thay đổi quá nhiều bên trong khối lập phương nhỏ nhất chứa các điểm thử nghiệm

+ Thiết kế với 7 yếu tố được tìm thấy đầu tiên trong khi tìm kiếm một thiết

kế tài sản mong muốn liên quan đến phương sai ước lượng, và sau đó các thiết kế tương tự đã được tìm ra cho số các yếu tố khác

+ Mỗi thiết kế có thể được xem như là một sự kết hợp của một thiết kế giai thừa bậc hai (đầy đủ hoặc phân đoạn) với một thiết kế khối không đầy đủ Trong mỗi khối, một số lượng nhất định các yếu tố được đặt thông qua tất cả các kết hợp cho thiết kế giai thừa, trong khi các yếu tố khác được giữ ở các giá trị trung tâm + Thiết kế cho 8 yếu tố không có trong giấy tờ gốc Thiết kế cho số lượng các yếu tố khác cũng đã được phát minh ra (ít nhất lên đến 21) Một thiết kế cho 16 yếu tố tồn tại chỉ có 256 điểm giai thừa Hầu hết những thiết kế này có thể được chia thành các nhóm (các khối), mỗi mô hình sẽ có một giới hạn hằng số khác nhau,

nói một cách khác là các hằng số khối sẽ không tương quan với các hệ số khác [15]

1.6.2 Các bước tiến hành [10]

Bước 1: Chọn thông số nghiên cứu:

Yếu tố đầu vào Yếu tố đầu ra

(Biến tiên đoán) (Hàm mục tiêu)

(Yếu tố ảnh hưởng) (Biến đáp ứng)

- Phải chọn hàm mục tiêu

- Chọn biến tiên đoán

Phân tích từ các biến tiên đoán để chọn ra các yếu tố ảnh hưởng chính, loại

bỏ những yếu tố không cần thiết nhằm đảm bảo tính khả thi và tính hiệu quả của thực nghiệm Những biến tiên đoán này phải điều khiển, kiểm tra, khống chế, kiểm soát được nó

Bước 2: Xác định miền thí nghiệm

Miền thí nghiệm là khu vực trong đó các nhân tố biến thiên hay nói cách khác

đó là miền mà chúng ta tiến hành thí nghiệm

Để xác định miền thí nghiệm có 3 cơ sở:

+ Dựa vào lý thuyết

+ Tham khảo các công trình nghiên cứu đã công bố

Bước 4: Chuyển biến thực qua biến mã

Diễn biến quá trình (Hộp đen)