Tối ưu quá trình thuỷ phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase và đặc trưng tính chất của dịch thuỷ phân

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng ...4 Bảng 2.1 Thể tích các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm...25 Bảng 2.2 Thể tích của các dung dịch

LỜI CẢM ƠN

Khoá luận tốt nghiệp là bước cuối cùng đánh dấu sự trưởng thành của một sinh viên ở giảng đường Đại học để đóng góp những gì mình đã học được cho sự phát triển đất nước

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Thị Kim Cúc và Th.S Ngô Thị Hoài Dương đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và truyền đạt kinh nghiệm và giúp

đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công Nghệ sinh học & Môi trường Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý báu để

em có được nền tảng kiến thức vững chắc

Con xin gửi tới bố mẹ sự biết ơn sâu sắc Bố mẹ luôn bên cạnh động viên, ủng hộ

và yêu thương con nhất Con sẽ luôn cố gắng sống tốt, xứng đáng với niềm tin yêu của

bố mẹ Con xin cảm ơn bố mẹ!

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Minh Nhật – cán bộ quản lý Phòng thí nghiệm Viện CNSH&MT, các bạn trong lớp 50CNSH đã quan tâm và nhiệt tình giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn

Chúc tất cả mọi người sức khỏe và thành công!

Nha Trang, tháng 7 năm 2012

Sinh viên Nguyễn Thị Chính

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan phế liệu tôm 3

1.1.1 Phế liệu tôm trong chế biến thủy sản 3

1.1.2 Thành phần hóa học của phế liệu tôm 3

1.1.3 Enzyme protease của tôm [6] 5

1.1.4 Các phương pháp thu nhận protein từ phế liệu tôm 7

1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hồi protein bằng enzyme 8

1.2 Tổng quan về chất chống oxi hóa 10

1.2.1 Khái quát chung về gốc tự do và chất chống oxi hóa 10

1.2.1.1 Gốc tự do, và sự oxy hoá .10

1.2.1.2 Chất chống oxi hóa 11

1.2.2 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 12

1.2.2.1 Các phương pháp HAT 12

1.2.2.2 Các phương pháp ET 13

1.2.3 Tình hình nghiên cứu khả năng chống oxi hóa từ phế liệu thủy sản 14

1.2.4 Ứng dụng của chất chống oxi hóa trong thực phẩm 15

1.3 Tổng quan về enzyme protease 15

1.3.1 Phân loại và đặc điểm các loại enzyme protease 15

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 18

1.3.3 Ứng dụng của enzyme protease 20

1.4 Tổng quan về enzyme Alcalase 21

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu 22

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 22

2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 23

2.2.2 Phương pháp xử lí số liệu 27

2.3 Bố trí thí nghiệm 27

2.3.1 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lí nhiệt đối với nguyên liệu trước khi thủy phân 27

2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thủy phân 29

2.3.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Alcalase 33

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Ảnh hưởng của xử lí nhiệt trước khi thủy phân và bổ sung enzyme alcalase đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân 35

3.2 Ảnh hưởng của xử lí nhiệt trước khi thủy phân đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân 36

3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân protein đầu tôm 37

3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm 41

3.5 Kết quả tối ưu quá trình thủy phân để thu dịch thuỷ phân có khả năng khử

gốc tự do DDPH 45

3.6 Đặc trưng tính chất của dịch thủy phân 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng 4

Bảng 2.1 Thể tích các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm 25

Bảng 2.2 Thể tích của các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm 26

Bảng 2.3 Ma trận thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt ban đầu 29

Bảng 2.4 Thiết kế mức thực nghiệm của các tham số trong quy trình xác định ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình thủy phân 31

Bảng 2.5 Mô hình thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân 31

Bảng 2.6 Thiết kế mức thực nghiệm của các tham số trong tối ưu theo phương pháp Box-Behnken 34

Bảng 2.7 Mô hình thí nghiệm tối ưu theo phương pháp Box-Behnken 34

Bảng 3.3 Kết quả phân tích mức độ ảnh hưởng của yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân protein đầu tôm trên phần mềm DX8 38

Bảng 3.4 Kết quả phân tích tương tác giữa các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm 41

Bảng 3.5 Kết quả nghiên cứu tối ưu theo mô hình Box-Behnken 45

Bảng 3.6 Kết quả phân tích sự tương thích của mô hình bậc hai đối với hàm lượng protein hòa tan 46

Bảng 3.7 Kết quả phân tích sự tương thích của mô hình bậc hai đối với hàm lượng DDPH bị khử 46

Bảng 3.8 Một số chỉ tiêu phân tích của dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm 48

Bảng 3.9 Thành phần acid amin của dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme Alcalase 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của chất chống oxi hóa [22] 11

Hình 1.3 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein 16

Hình 1.4 Phân loại enzyme protease [8] 16

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí trí thí nghiệm tổng quát 23

Hình 2.3 Sự bắt màu của phản ứng Biuret 24

Hình 2.5 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt trước thủy phân 27

Hình 2.6 Quy trình xem xét ảnh hưởng của các yếu tố thủy phân 30

Hình 2.7 Quy trình thí nghiệm tối ưu 33

Hình 3.2 Ảnh hưởng của xử lí nhiệt ban đầu đến hàm lượng DDPH bị khử 36

Hình 3.3 Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân protein đầu tôm trên đồ thị Half-Normal 38

Hình 3.4 Phân tích ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng protein hòa tan trên phần mềm DX8 39

Hình 3.5 Phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein hòa tan trên phần mềm DX8 40

Hình 3.6 Kết quả phân tích Half-Normal đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm trên phần mềm DX8 41 Hình 3.7 Phân tích ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch thủy phân bằng phần mềm DX8 42

Hình 3.8 Kết quả phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch thủy phân trên phần mềm DX8 43

Hình 3.9 Kết quả phân tích ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch thủy phân trên phần mềm DX8 44

Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng tối ưu quá trình thủy phân 47

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DDPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

HAT: Hydrogen Atom Transfer

ET: Electron Transfer

AAPH: 2,2'-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride

MỞ ĐẦU

Việt Nam có bờ biển dài khoảng hơn 3.200km và hơn 236.972 ha mặt nước nuôi trồng thủy sản đã tạo tiền đề cho ngành chế biến thủy sản phát triển mạnh mẽ Hiện nay, chế biến thủy sản không những đem lại lợi nhuận cao đóng góp ngân sách cho nhà nước mà còn giải quyết công ăn việc làm cho hàng nghìn lao động Theo Hiệp Hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), trong 6 tháng đầu năm 2011, cả nước đã xuất khẩu 10.872 tấn tôm, trị giá 971.109 triệu USD, tăng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kì năm 2010 và là nhóm hàng

có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Đi đôi với việc tăng sản lượng tôm xuất khẩu là lượng phế liệu tôm thải

ra cũng tăng lên Tuy nhiên, việc khai thác các sản phẩm có giá trị sinh học từ protein đầu tôm chưa được đầu tư nghiên cứu nhiều ở nước ta, protein chủ yếu mới chỉ được tận thu như một dạng sản phẩm phụ của quá trình sản xuất chitin để làm thức ăn gia súc Điều này không những gây lãng phí tài nguyên mà còn ảnh hưởng lớn đến môi trường

Min – Soo Heu và cộng sự (2003); Seymour & Li (1996) đã chỉ ra rằng dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm có chứa thành phần acid amin khá cao và có giá trị về mặt sinh học Vì vậy, việc nghiên cứu tối ưu quá trình thu hồi các sản phẩm có hoạt tính sinh học từ protein đầu tôm là rất cần thiết, vì không những vừa nâng cao hiệu quả sử dụng tài nguyên mà còn góp phần khuyến khích cải tiến công nghệ sản xuất chitin ở Việt Nam theo hướng thân thiện với môi trường

Xuất phát từ những vấn đề trên đề tài “Tối ưu quá trình thuỷ phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase và đặc trưng tính chất của dịch thuỷ phân” được thực hiện nhằm xác định chế độ thu hồi và đánh giá hoạt

tính sinh học của dịch thu được khi thủy phân đầu tôm bằng enzyme Alcalase, một enzyme vẫn thường được dùng để thủy phân đầu tôm hiện nay, từ đó mở ra hướng ứng dụng sản phẩm thủy phân này vào trong thực phẩm và thực phẩm chức năng

Nội dung của đề tài:

 Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu trước thủy phân

 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan và khả

năng chống oxi hóa của dịch thủy phân đầu tôm

 Tối ưu quá trình thuỷ phân protein bằng enzyme Alcalase để thu dịch có hoạt tính chống oxi hóa cao trên đầu tôm thẻ chân trắng

 Đánh giá giá trị dinh dưỡng và giá trị sinh học của dịch thuỷ phân

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan phế liệu tôm

1.1.1 Phế liệu tôm trong chế biến thủy sản

Phế liệu tôm chủ yếu là đầu, vỏ và đuôi tôm, ngoài ra còn có phần thịt tôm do lột vỏ sai quy cách hoặc tôm biến màu Tùy thuộc vào từng loài, sản phẩm chế biến khác nhau mà lượng phế liệu tôm thu được khác nhau Chẳng hạn, đối với tôm càng

xanh Macrobrachium rosenbergii, đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm Đầu tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng lượng tôm Đối với tôm thẻ,

lượng phế liệu đầu tôm chiếm khoảng 28% Lượng phế liệu này có thể giảm bằng cách cải tiến thiết bị và công nghệ

Việc tiêu thụ một lượng lớn tôm nguyên liệu của các nhà máy chế biến thủy sản đã thải ra một lượng lớn phế liệu, chủ yếu là đầu tôm và vỏ tôm Các loại phế liệu này nếu thải trực tiếp ra môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng

và nếu đem xử lí chất thải thì chi phí sẽ rất lớn Ngày nay, đã có nhiều hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu tôm để sản xuất các chế phẩm có giá trị quan trọng như chitin-chitosan, Asthaxanthin

1.1.2 Thành phần hóa học của phế liệu tôm

Trong phế liệu tôm có chứa những thành phần quan trọng có giá trị như protein, chitin, canxi cacbonate…Tỷ lệ giữa các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài, đặc điểm sinh thái, mùa vụ…Thành phần hoá học

cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng được nghiên cứu bởi Trang Sĩ Trung (2009) thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng STT Thành phần Hàm lượng

: Tính theo chất khô tuyệt đối

 Protein: Protein đầu tôm thường tồn tại ở 2 dạng chính là dạng tự do (có

sẵn trong nội tạng và phần cơ thịt còn sót lại gắn với đầu tôm) và dạng liên kết với chitin hoặc canxi carbonate như một phần thống nhất của vỏ đầu tôm

 Chitin: Chiếm khối lượng lớn (18,3%) Tồn tại dưới dạng liên kết với

protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác

 Hệ enzyme: Trong đầu tôm có chứa hệ enzyme hoạt động mạnh đặc biệt là

ở nội tạng, do đó rất dễ bị hư hỏng Một số enzyme ở đầu tôm gồm:

- Protease: Là enzyme chủ yếu trong đầu tôm, phân giải protein thành acid amin

- Lipase: phân giải lipid thành glyceryl và acid béo

- Tyrosinase: khi có mặt của oxi không khí sẽ biến đổi tyrosine thành melanin có màu đen ảnh hưởng tới giá trị cảm quan và chất lượng sản phẩm

 Chất ngấm ra ở đầu tôm: Trimethylamin (TMA), Trimethylamin oxyt (TMAO), ure, các acid amin tự do…

Ngoài các thành phần trên trong đầu tôm còn có một lượng nhỏ lipid, photpho

và sắc tố

Như vậy, phế liệu đầu tôm vừa là nguồn giàu chitin (11% trọng lượng khô) vừa là một nguồn protein tốt (50 – 60% trọng lượng khô), có nhiều giá trị dinh dưỡng và nguồn enzyme

Qua bảng phân tích thành phần phế liệu tôm (Bảng 1.2) cho thấy hàm lượng protein trong phế liệu tôm là khá lớn và như chúng ta đã biết protein có rất nhiều ứng dụng trong thực tế Vì vậy việc thu hồi lượng protein từ phế liệu đầu tôm là rất

có nghĩa

1.1.3 Enzyme protease của tôm [6]

Các enzyme tiêu hóa, đặc biệt các enzyme tiêu hóa ở protein ở giáp xác nói chung và ở tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá Protease của tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin, astacine, collagenase…

Protease của tôm cũng như các loài động vật thủy sinh khác là các protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa, sau đó đến nội tạng và cơ thịt Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hóa nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác Các enzyme có tác dụng thủy phân protein, tính đặc hiệu rộng rãi, không chỉ thủy phân các liên kết peptide

mà còn thủy phân cả liên kết este, liên kết amin… Phần lớn các enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của một protease:

- Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ khác, nên dựa vào những đặc tính này để tách chiết chúng

- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme

- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa hay ức chế

- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ,

pH môi trường

Trypsin: Có nhiều trong dịch vị tụy tạng, có tác dụng mạnh với các loại

protid có phân tử lượng thấp ở các mối liên kết peptide, amit, este Trypsin từ ruột tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 38oC

Peptidase, ereptase, và các loại khác: Tham gia xúc tác thủy phân liên kết

peptide trong phân tử protein và các polypeptide Khả năng tác dụng cũng như tính đặc hiệu của các loại enzyme này tùy thuộc vào bản chất của các nhóm nằm liền kề mối liên kết peptide

Cacbonhydrase: Enzyme này xúc tác thủy phân các glucid và glucozit

Hiện nay, có nhiều công trình trong và ngoài nước nghiên cứu về hệ enzyme protease của tôm

Phan Thị Trân Châu và cộng sự nghiên cứu protease trên tôm biển miền Bắc Việt Nam cho thấy phạm vi hoạt động của chúng khá rộng từ pH 6 đến 9 và pH hoạt động tối ưu là 7,5 và 8,5 [1]

Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H – 75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp là 60oC và 50oC với pH tương ứng là 7,5 và 8,5 Tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm bộp để thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [5]

Nguyễn Văn Truyền (2006) đã nghiên cứu chiết xuất protease từ đầu tôm càng

xanh Macrobrachium rosenbergii và thu được enzyme protease có nhiệt độ tối thích

là 55oC, pH tối thích là 8 [9]

Nguyễn Lệ Hà (2011) đã nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease

từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản Kết quả nghiên cứu đã phát

hiện hệ protease ở đầu và gan tụy tôm sú có ít nhất 5 loại khác nhau với phân tử lượng từ 20.200 đến 40.200 Da, riêng đầu tôm còn có thêm hai protease với phân từ lượng là 49.200 và 76.000 Da Ba protease chiếm vai trò hoạt động chủ đạo có phân

tử lượng 20.200 đến 25.000 Da Protease tôm sú bền nhiệt, có nhiệt độ tối thích là

62oC, pH hoạt động tối ưu là 7,5 với nồng độ muối ăn NaCl thích hợp cho hoạt động là 1% Hoạt động của protease gan tụy và đầu tôm giảm khi có mặt của một số ion kim loại, đặc biệt là Hg2+ Ion Mn2+ làm tăng hoạt tính của protease tôm sú [2] Trên thế giới, các nhà nghiên cứu cũng dành sự quan tâm đến khía cạnh này

Doek S.N và các cộng sự cho biết protease của thịt tôm he Ấn Ðộ (P.inducus) là

một protease kiềm, hoạt động cực đại ở pH 8,0 bền với nhiệt, hoạt động phụ thuộc vào ion kim loại [11]

Shann Tzong Jiang và cộng sự đã tách chiết được Cathepsin D từ một loài tôm nuôi ở Ðài loan, đồng thời cũng xác định được nhiệt độ, pH tối thích cho enzyme này hoạt động, cũng như các yếu tố hoạt hóa và ức chế [17], [18]

1.1.4 Các phương pháp thu nhận protein từ phế liệu tôm

Để tách protein hiện nay người ta dùng các phương pháp sau:

 Phương pháp cơ học

Sử dụng lực cơ học để tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu vỏ, đầu tôm Đầu tôm còn tươi được rửa sạch, sau đó đem ép bằng trục lăn hoặc trục vít, thu hồi dịch protein và bảo quản Phương pháp này cho hiệu quả thu hồi không cao và thường được dùng kết hợp với phương pháp khác

 Phương pháp sinh học

Phương pháp này dựa trên dựa trên hệ enzyme có sẵn trong nội tạng đầu tôm hoặc bổ sung enzyme thương mại (từ vi sinh vật, thực vật, động vật) để thủy phân protein đầu tôm thành các peptide, acid amin và thu hồi chúng Có 2 phương pháp: phương pháp ủ xi lô và phương pháp bổ sung enzyme protease

 Phương pháp ủ xi lô

Phương pháp này dựa trên hoạt tính của enzyme protease có sẵn trong phế liệu tôm hoặc bổ sung từ ngoài vào Sự hóa lỏng của mô tôm là kết quả của việc thủy phân protein nhờ hoạt động của enzyme, ngoài ra còn được hỗ trợ bằng cách bổ

sung các acid hữu cơ Chất lượng của protein thu được từ phương pháp này chủ yếu phụ thuộc vào hàm lượng các acid amin quan trọng

Trang Sĩ Trung và cộng sự (2009) ứng dụng ủ xi lô bằng acid formic đã loại được 83,1% protein và 66,1% khoáng từ phế liệu tôm trong quá trình chế biến chitin

 Phương pháp bổ sung enzyme protease

Phương pháp này giống như phương pháp ủ xi lô là đều dựa trên hoạt động thủy phân của enzyme protease để thu hồi protein Tuy nhiên để giảm thời gian thủy phân người ta bổ sung hàm lượng nhất định enzyme protease nhằm tăng tốc độ thủy phân trong hỗn hợp phế liệu tôm

 Phương pháp hóa lý

Nguyên lý dựa trên việc kết tủa protein bằng cách dùng acid để điều chỉnh pH dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein (pH = 4 – 5,5), sau đó dùng các phương pháp lắng, lọc để thu hồi protein Ưu điểm của phương pháp là đơn giản, dễ tiến hành, có thể thu hồi với hiệu suất cao, có thể ứng dụng thu hồi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm và chế biến thủy sản

1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hồi protein bằng enzyme

 Trên thế giới

Trên thế giới, vấn đề thu hồi protein từ phế liệu tôm bằng enzyme thủy phân

đã được nghiên cứu từ lâu (Simpson và Haard, 1985; Synowiecki và Al-Khateeb, 2000; Mizani và cộng sự, 2005) Các enzyme như Alcalase đã được sử dụng để thủy phân protein từ phế liệu tôm (Chabeaud, Guerard, Laroque & Dufosse, 2007; Mizani, Aminlari, 2005) và trypsin, papain, pepsin (Synowwiecki & Al-Khateeb, 2000; Chakrabarty, 2002), neutrase và protease (Rutanapornvareeskul, 2006)

Gildberg và Stenberg, 2001 thu được 68,5% protein từ phế liệu tôm Pandalus

borealis sau 2 giờ thủy phân với enzyme Alcalase

Whenhong Cao và cộng sự, 2008 đã nghiên cứu thu hồi protein từ phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân, điều chỉnh nhiệt độ bằng cách nâng nhiệt từ 40 – 70oC, cứ sau 30 phút thì tăng lên 5oC, giữ ở pH tự nhiên Kết quả cho thấy tại điều kiện nhiệt độ 40oC, 50oC, 60oC thì hàm lượng protein thu

hồi tương ứng là 43,6%, 73,6%, 87,4% Và kết quả cũng chỉ ra rằng khi nhiệt độ tăng từ 45oC – 60oC là nhiệt độ mà enzyme nội tại hoạt động mạnh nhất thì độ thủy phân (DH) tăng từ 0 – 48% sau 180 phút khi nâng nhiệt dần lên, lượng protein thu hồi cao nhất là 87,4% tại 60oC

Józef Synowiecki và cộng sự, 1999 nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử

protein của phế liệu vỏ tôm Crangon crangon nhằm thu hồi chitin và protein Ban đầu vỏ tôm Crangon crangon được khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10%,

20oC, 30 phút và khử protein bằng enzyme Alcalase, 55oC, pH 8,5 Độ thủy phân

DH cao nhất là 30%, dịch thủy phân thu được có chứa 63% protein so với hàm lượng chất khô tuyệt đối

 Ở Việt Nam

Trước đây, nguồn phế liệu tôm chủ yếu được cung cấp cho các nhà máy chế biến thức ăn gia súc nhỏ lẻ Vỏ, đầu tôm đã được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi với các phương pháp truyền thống như: Sấy khô hoặc phơi nắng sau đó đem xay mịn bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Việc sấy khô đòi hỏi năng lượng lớn, tốn kém Phơi nắng thì phụ thuộc vào thời tiết, mất vệ sinh và gây ô nhiễm môi trường

Trong những năm gần đây, ngoài việc tận dụng phế liệu tôm thẻ để sản xuất chitin – chitosan người ta còn nghiên cứu thu hồi lượng protein có giá trị trong các quy trình sản xuất chitin – chitosan

Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân phế liệu tôm

và tận thu protein, asthaxanthin trong công nghệ sản xuất chitin – chitosan Quá trình được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 54oC, 8 giờ, tỉ lệ enzyme bổ sung 0,22%,

pH 8, tỷ lệ nước/ nguyên liệu là 1/1 Kết quả thu được 52,7% protein

Trang Sĩ Trung (2009) đã sử dụng enzyme Flavourzyme trong quy trình sản xuất chitin nhằm tận thu hỗn hợp protein và asthaxanthin có tỷ lệ thu hồi hàm lượng chất khô cao, tăng hơn 20%, chất lượng chitin, chitosan cao hơn so với phương pháp hóa học truyền thống Hỗn hợp protein và asthaxanthin thu được có chất lượng cao thể hiện qua hàm lượng protein và thành phần acid amin, có thể ứng dụng trong

chế biến thức ăn gia súc Ngoài ra còn giảm ô nhiễm môi trường so với phương pháp hóa học

Vũ Ngọc Bội, Vũ Thị Hoan (2004), đã sử dụng protease đầu tôm sú để cải thiện khả năng chiết tách chất mùi từ phế liệu tôm và ghẹ

Trần Lê Minh (2010), nghiên cứu sử dụng 3 loại enzyme Alcalase, Flavourzyme và Protamex trong quá trình thu nhận phức hợp carotenoprotein từ phế liệu đầu tôm

Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy (2006), cũng đã nghiên cứu sử dụng

Lactobacillus plantarum lên men đầu tôm sú để thu hồi chitin

1.2 Tổng quan về chất chống oxi hóa

1.2.1 Khái quát chung về gốc tự do và chất chống oxi hóa

1.2.1.1 Gốc tự do, và sự oxy hoá

 Gốc tự do

Nguyên tử là thành phần cơ bản nhất cấu tạo nên vật chất Một nguyên tử bao gồm một hạt nhân và các Nơtron Thông thường, một cặp electron bay trên một quỹ đạo quanh hạt nhân, giống như các hành tinh quay quanh Mặt trời

Phân tử bao gồm các nhóm nguyên tử gắn kết với nhau bởi hoạt động của các cặp electron này Đôi khi trong quá trình phản ứng hóa học, một electron bị kéo ra

khỏi chỗ cố hữu của nó trong phân tử, và tạo thành một gốc tự do Về bản chất, gốc

tự do là một electron độc thân Các gốc tự do rất không ổn định và nhạy cảm Chúng tìm kiếm những electron khác để hình thành một cặp electron mới Các gốc

tự do gây hại khi chúng kéo những electron từ các tế bào

 Sự oxi hóa

Sự oxi hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxi hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật

Trong sản xuất, bảo quản và chế biến thực phẩm, sự oxy hóa là nguyên nhân hạn chế thời gian bảo quản thực phẩm

1.2.1.2 Chất chống oxi hóa

Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Chất chống oxi hóa ngăn chặn sự phá hủy tế bào sinh vật bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng

Do đó, người ta thường dùng các chất khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxi hóa

Cho đến cách đây 10 – 15 năm vẫn chưa có nhiều nhà nghiên cứu khảo sát về gốc tự do và chất chống oxy hóa Năm 1959, chỉ có vài chuyên gia nghiên cứu về vai trò của các dưỡng chất chống oxy hóa trên tuổi tác, ung thư, bệnh tim mạch và đối với sức khỏe nói chung Ngày nay có đến hàng nghìn nhà khoa học nghiên cứu

về vấn đề này

Cơ chế hoạt động của chất chống oxi hóa như sau:

Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của chất chống oxi hóa [22]

Chất chống oxi hóa liên quan đến công nghệ thực phẩm, ngoài ra còn liên quan đến sinh học và y học bởi vì nó bảo vệ con người trước những tác hại của phản ứng oxi hóa Trong thực phẩm, chất chống oxi hóa thường được hiểu là chất ngăn chặn các gốc tự do gây ra phản ứng oxi hóa lipid Tuy nhiên trên thực tế gốc tự do không những chỉ gây tác hại đến lipid mà còn cả protein, DNA, và các chất khác Vì

vậy, chất chống oxi hóa được định nghĩa rộng hơn là tất cả những chất mà khi ta bổ sung với một hàm lượng nhất định vào đối tượng dễ bị oxi hóa thì sẽ ngăn chặn đáng kể phản ứng oxi hóa xảy ra [10] Những đối tượng dễ bị oxi hóa ở đây bao gồm thực phẩm, các tế bào sống, protein, lipid, DNA… Định nghĩa này nhấn mạnh hơn tầm quan trọng của các chất chống oxi hóa

Một số chất chống oxi hóa tự nhiên được kể đến như: acid ascorbic, tocopherol, carotene, Flavanone và flavonol Ngoài ra còn có các chất chống oxy hóa tổng hợp thường được sử dụng là: BHT (Butylated hydroxytoluen), BHA (Butylate hydroxyanisole), tocopherol tổng hợp, TBHQ (Tertbutyl hydroquinone), dodecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palmitate…

1.2.2 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa

Để xác định hoạt tính chống oxi hóa của một chất có nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp dựa trên các phản ứng phức tạp, phương pháp dựa trên cơ chất, phương pháp dựa trên những phân tử dò, hay dựa trên các điều kiện phản ứng… Tuy nhiên, chúng có thể được chia thành 2 nhóm là HAT (Hydrogen Atom Transfer) và ET (Electron Transfer)

1.2.2.1 Các phương pháp HAT

Phương pháp này dựa trên cơ sở trao đổi nguyên tử Hydrogen Chất oxi hóa và

cơ chất cạnh tranh gốc peroxyl của các hợp chất azo (R-N=N-R) Một số phương pháp dựa theo nguyên lý này gồm:

- ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity ): Khả năng hấp thụ gốc oxy

- TRAP ( Total Radical Trapping Antioxidant Parameter) :

 Phương pháp làm mất màu Crocin

 IOU (Inhibited Oxygen Uptake) : Ức chế sự hấp thu oxy

 Phương pháp dựa trên sự kìm hãm quá trình oxi hóa acid linoic

 Phương pháp dựa trên sự ức chế quá trình oxi hóa các Lipoprotein tỷ trọng

thấp (LDL)

 Phương pháp phenol tổng số dùng thuốc thử Folin – ciocalteu (FRC assay)

Phương pháp này đầu tiên được dành cho việc phân tích các protein nhờ hoạt động của thuốc thử đối với tyrosine (có chứa một nhóm phenol) Nhiều năm sau, Singleton và đồng nghiệp mở rộng xét nghiệm này để phân tích tổng số phenol trong rượu vang, kể từ sau đó người ta đã ứng dụng rộng rãi phương pháp này Phương pháp này được tiến hành bằng cách đun sôi trong 10 giờ hỗn hợp sodium tungstate (NaWO4.2H2O, 100g), sodium molybdate (Na2Mo4.2H2O, 25g), HCl (100ml), H3PO485% (50ml), và H2O (700ml) Sau khi sôi, cho thêm vào hỗn hợp lithium sulfate (Li2SO4.4H2O, 150g) tạo thành dung dịch thuốc thử FC có màu vàng đậm Nếu có chất khử dung dịch sẽ chuyển thành màu xanh Về bản chất người ta cho rằng có sự chuyển electron từ các chất khử sang cho Mo (VI):

Mo (VI) + e Mo (V) Không chỉ đặc hiệu với các hợp chất phenolic mà thuốc thử FC còn phản ứng với các hợp chất không phải phenolic như vitamin C, Cu2+…Các hợp chất phenolic phản ứng với FCR trong điều kiện pH = 10 Sự phân ly của một proton phenolic, tạo thành anion phenolate, phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có màu xanh

 Phương pháp TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)

Phương pháp này được báo cáo đầu tiên bởi Miller và Rice – Evan (1993) Do tiến hành đơn giản nên phương pháp TEAC được sử dụng nhiều cho các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về khả năng chống oxi hóa của các mẫu thực phẩm

1.2.3 Tình hình nghiên cứu khả năng chống oxi hóa từ phế liệu thủy sản

 Trên thế giới

Ngoài hướng tận dụng phế liệu tôm để sản xuất chitin – chitosan, trên thế giới

đã có nhiều công trình nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa

Nghiên cứu của Gildberg & Stenberg, 2001 chỉ ra rằng sự thủy phân làm giảm chiều dài của các chuỗi peptide, tạo ra nguồn di, tri peptide là một nguồn protein có hoạt tính sinh học

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về việc tận dụng nguyên liệu còn lại trong quá trình chế biến tôm

Các chất chống oxi hóa trong phế liệu vỏ tôm đã được nghiên cứu bởi Seymour và Li (1996) Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất chống oxi hóa trong

vỏ tôm là các protein mà đơn phân là các acid amin chứa gốc phenol trong đó các acid amin sắp xếp theo một qui tắc nhất định [19]

Năm 2007, bằng các test thử về khả năng chống oxi hóa, một nhóm các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxi hóa có trong Mungoong, một món ăn truyền thống của người Thái được làm từ dịch chiết phế liệu tôm Qua nghiên cứu người ta nhận thấy rằng Mungoong chứa chất chống oxi hóa Dịch hòa tan từ sản phẩm này có hoạt tính chống oxi hóa cao nhờ các test thử DDPH, khả năng bắt giữ các gốc tự do ABTS và FRAP Hoạt tính chống oxi hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch hòa tan từ sản phẩm này [20]

Năm 2008, S.J.Li, T.A Seymour đã nghiên cứu ứng dụng chất chống oxi hóa được chiết từ vỏ tôm vào việc bảo quản một loại cá mú (thường sống ở các rặng san hô) nhằm chống sự mất màu và oxi hóa lipid của loài cá này Kết quả cho thấy rằng dịch chiết bằng dung môi ethanol từ phế liệu tôm khi được bổ sung vào mẫu bảo quản lạnh sẽ có khả năng ngăn chặn sự biến màu của cá và phản ứng oxi hóa lipid cũng xảy ra ít hơn so với các mẫu đối chứng Tuy nhiên, các dịch chiết này thể hiện khả năng chống oxi hóa thấp hơn so với các chất chống oxi hóa tổng hợp

Năm 2009, nhóm các nhà khoa học người Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm lên men truyền thống tôm và giáp xác (Kapi, Koong – Som and Jaloo) Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng sản phẩm lên men này có hàm lượng protein cao và hầu hết các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa tự nhiên và rất tốt cho sức khỏe [14]

 Ở Việt Nam

Từ trước đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều đề tài nghiên cứu thu hồi các sản phẩm trên phế liệu tôm Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu mới chỉ tập trung thu hồi chitin – chitosan, chưa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của phế liệu tôm như protein, asthaxanthin Đặc biệt là hoạt tính sinh học, hoạt tính chống oxi hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm chưa được quan tâm nhiều và hầu như đang trong giai đoạn nghiên cứu bước đầu Việc nghiên cứu về hoạt tính sinh học của protein của phế liệu tôm trong quá trình thủy phân sẽ mở ra hướng kết hợp thu protein có hoạt tính sinh học với sản xuất chitin – chitosan và ứng dụng vào lĩnh vực y học, thực phẩm, làm tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất

1.2.4 Ứng dụng của chất chống oxi hóa trong thực phẩm

Nhu cầu sử dụng thực phẩm của con người ngày càng tăng cao cùng với nó là các đòi hỏi về chất lượng thực phẩm cũng tăng lên Để đáp ứng được những nhu cầu đó thì trong công nghiệp chế biến và bảo quản cần hạn chế những biến đổi trong

đó có quá trình oxi hóa gây ảnh hưởng nhiều đến giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng của thực phẩm Vì vậy, sử dụng hợp lý các chất chống oxi hóa là rất cần thiết Chất chống oxi hóa là một loại phụ gia giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác bằng cách khử đi các gốc tự do và oxi hóa chính chúng Trước đây người ta thường sử dụng các chất chống oxi hóa tổng hợp, trong đó một

số chất được cho là có nguy cơ gây ung thư và các bệnh về tim mạch Ngày nay người ta hướng đến việc sử dụng các chất chống oxi hóa có nguồn gốc từ tự nhiên, các chất này an toàn hơn so với chất chống oxi hóa tổng hợp

1.3 Tổng quan về enzyme protease

1.3.1 Phân loại và đặc điểm các loại enzyme protease

Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit

(-amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.2 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Hình 1.3 Phân loại enzyme protease [8]

Theo Barret và Donald (1956), Protease được phân chia thành hai nhóm lớn là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase

Peptidase (Protease) (E.C.3.4)

Exopeptidase

(E.C 3.4.11-17)

Endopeptidase (E.C 3.4.21-99)

 Nhóm 1: Endopeptidase là các enzyme phân giải các liên kết nằm trong

mạch polypeptide Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm:

+ Serin proteinase: Là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

 Nhóm 2: Exopeptidase Các enzyme thuộc nhóm này có khả năng thủy

phân liên kết peptide ngoài cùng của chuỗi polypeptide hoặc đầu acid amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2 – 4

- Protease trung tính: pH 7 – 8

- Protease kiềm: pH 9 – 11

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân protein tùy theo mức độ thủy phân, thời gian thủy phân

mà thu được peptide hay acid amin Quá trình thủy phân phế liệu tôm bằng protease có nhiều yếu tố ảnh hưởng:

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Do bản chất của enzyme là protein nên sự thay đổi về nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40oC – 50oC, ở nhiệt độ lớn hơn 70oC đa số enzyme bị bất hoạt

Do vậy, nhiệt độ 70oC được coi là nhiệt độ tới hạn của enzyme

Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường trong khoảng nhiệt độ

mà enzyme chưa bị biến tính, khi tăng nhiệt độ lên 10oC thì vận tốc phản ứng của enzyme tăng lên 1,4 – 2 lần Khi bắt đầu có sự biến tính protein thì xảy ra 2 hiện tượng: Một mặt vận tốc phản ứng vẫn tăng theo sự tăng nhiệt độ, mặt khác vận tốc biến tính protein xảy ra nhanh hơn Kết quả vận tốc phản ứng giảm dần cho tới khi đình chỉ hoàn toàn

Nhiệt độ tối thích cho một enzyme không phải là hằng số mà nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố: cơ chất, pH môi trường, nồng độ enzyme…

 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH có ảnh hưởng rất lớn tới vận tốc phản ứng enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme

pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hoặc trung tính, chỉ một số ít hoạt động trong vùng acid mạnh hoặc kiềm mạnh Phế liệu tôm có thể

bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta phải chọn enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo

môi trường có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hưởng của các enzyme khác

 Ảnh hưởng của thời gian

Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm thủy phân Hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân phụ thuộc lớn vào đội dài của các mạch peptide trong sản phẩm thủy phân Thời gian kéo dài, enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động, sản sinh nhiều sản phẩm cấp thấp: NH3,

H2S, indol… đồng thời làm giảm hoạt tính sinh học của dịch thủy phân Khi rút

ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein chưa triệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu và khó khăn trong quá trình lọc rửa thu dịch thủy phân

 Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc

Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất cũng ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân Diện tích tiếp xúc càng lớn tốc độ thủy phân càng dễ dàng và ngược lại Do đó, để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ phế liệu tôm

 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất thì khi nồng độ enzyme tăng vận tốc tăng, khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận tốc không thay đổi

 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất là phế liệu tôm trước hết sẽ tạo thành phức trung gian của enzyme và cơ chất Khi cơ chất đầu tôm tạo phức với enzyme protease sẽ bị thay đổi cả cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm thủy phân và giải phóng enzyme Quá trình cứ tiếp tục xảy ra cho đến khi cơ chất hết Nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng

 Độ tươi của nguyên liệu

Độ tươi của phế liệu tôm có vai trò quan trọng quyết định đến chất lượng của dịch thủy phân, sản phẩm protein thu hồi từ quá trình thủy phân protein và chitin

Độ tươi của phế liệu giảm làm giảm chất lượng của protein do có sự phân hủy protein trong đầu tôm tạo thành các sản phẩm thứ cấp như: indol, NH3, H2S…gây

ra mùi khó chịu cho sản phẩm

 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước / nguyên liệu

Nước là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng thủy phân Nó có khả năng điều chỉnh phản ứng thủy phân do nước là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương, là môi trường khuếch tán enzyme và cơ chất tạo điều kiện cho phản ứng thủy phân xảy ra Do vậy, nếu bổ sung nước vào quá trình thủy phân nguyên liệu đầu tôm với tỷ lệ thấp sẽ hạn chế được hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp Vì vậy, cần phải xác định tỷ lệ nước bổ sung cho phù hợp

1.3.3 Ứng dụng của enzyme protease

Các protease nói chung được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

 Trong công nghiệp:

- Trong sản xuất nước chấm: Nước mắm, tương, chao…

- Trong công nghệ thực phẩm: Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi chế biến…

- Trong công nghệ thuộc da: Làm mềm lông, sạch lông, bóng da…

- Trong công nghệ tơ tằm: Làm bóng và tách rời các sợi tơ

- Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải

- Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ

 Trong nông nghiệp:

Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

 Trong mỹ phẩm:

Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu

bôi tóc, kem mặt… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già

1.4 Tổng quan về enzyme Alcalase

Enzyme Alcalase 2.4 L FG được phân tách và tinh sạch từ Bacillus

lichenniformis Enzyme này cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tiến hành

đơn giản do hoạt động trong mội trường pH kiềm tự nhiên của đầu tôm Chọn enzyme này cũng dựa trên đặc tính của nó cho khả năng không hút nước của các acid amin vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Adler-Nissen, 1986) đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các amino acid thiết yếu (Kristinsson & Rasco, 2000)

Hoạt tính 2,4 AU-A/g Nhiệt độ bảo quản tốt nhất 0 – 10oC Enzyme hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2,4L ở pH 8, nhiệt độ 50 – 60oC

Tất cả protease có thể bị bất hoạt bằng cách xử lý nhiệt ở 90oC trong 10 phút Enzyme Alcalase cũng có thể bất hoạt ở pH=4 hay thấp hơn trong khoảng 30 phút Phản ứng thủy phân có thể dừng tức hời bằng cách thêm vào các acid thích hợp như: acid acetic, lactic, hydrochloric Khi tăng nhiệt độ tức thời khó đạt được dưới các điều kiện công nghiệp, hơn nữa khó kiểm soát DH% do sự thủy phân có thể vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm

Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) thu mua tại Công ty Seafood F17

Nha Trang Nguyên liệu đầu tôm được thu mua tại phân xưởng chế biến Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn rác Sau khi lấy, nguyên liệu được bảo quản ngay trong thùng xốp cách nhiệt, có ướp đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm, tiến hành nhặt bỏ vỏ tôm hoặc phần thịt tôm lẫn trong phế liệu, để ráo nước Để tiện lợi cho quá trình thí nghiệm, phế liệu được cân thành những lượng nhỏ 1kg, được chứa trong các túi nilon cột chặt miệng, sau đó bảo quản đông ở nhiệt độ -70oC tại phòng thí nghiệm Khi tiến hành thí nghiệm nguyên liệu được lấy ra rã đông và xay nhỏ (100% là đầu tôm, tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay từ 0,5 – 0,8cm và tiến hành thí nghiệm ngay

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích do công ty Cầu Vồng (Tp.HCM) cung cấp

2.2 Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm trên phần mềm DX

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí trí thí nghiệm tổng quát

 Mô tả quy trình

Phế liệu đầu tôm sau khi bảo quản lấy ra rã đông và xay nhỏ với kích thước 0,5-0,8cm Sau đó tiến hành bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của xử lí nhiệt trước thủy phân nhằm xem xét việc cần thiết xử lí nhiệt trước khi thủy phân hay không? Tiếp theo, bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố thủy phân

từ đó tối ưu quá trình thủy phân để tìm chế độ thủy phân thích hợp

2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu

 Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret

Hàm lượng protein hòa tan được xác định dựa vào phương pháp Biuret đã được Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949) sử dụng để xác định protein huyết thanh và Mahmoudreza Ovissipour (2009) Sử dụng để xác định hàm lượng

protein thủy phân từ nội tạng cá Beluga sturgeon [15]

Xay nhỏ

Tối ưu quá trình thủy phân

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố thủy phân

Phế liệu đầu tôm

Nghiên cứu ảnh hưởng của xử

lý nhiệt trước thủy phân

Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+ thành một phức chất màu tím (phản ứng Biuret) Màu sắc của phức chất tỉ lệ với số lượng liên kết peptide (CO-NH-) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin

Công thức của phức Biuret như sau:

Hình 2.2 Công thức của phức Biuret

Hình 2.3 Sự bắt màu của phản ứng Biuret

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị thuốc thử Biuret: hòa tan 2,34375g CuSO4.5H2O và 8,0571g

C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml dung dịch NaOH 10% Dung dịch trên được khuấy đều và định mức lên 1000ml bằng nước cất

- Dựng đường chuẩn BSA:

Dung dịch BSA chuẩn được pha như sau: hòa tan 1g BSA vào 50ml nước cất rồi khuấy đều đến khi BSA tan hết rồi định mức lên 100 ml nước cất Cuối cùng thu được dung dịch BSA có hàm lượng 10mg/ml

Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự 0 – 5 Sau đó cho các dung dịch hóa chất vào với thể tích như sau:

Bảng 2.1 Thể tích các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm

Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 570nm (sử dụng ống 0 làm mẫu blank)

- Kiểm tra hàm lượng protein của dịch sau khi thủy phân

Cho 1ml dịch vào ống nghiệm, cho thêm 4ml thuốc thử Biuret, vortex và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi ủ, mang các mẫu so màu trên máy so màu ở bước sóng 570nm Đọc giá trị mật độ quang, dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng protein trong mẫu

 Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch thu được bằng test kiểm soát gốc tự do DDPH

Xác định khả năng chống oxi hóa thông qua khả năng kiểm soát gốc tự do DDPH Khả năng kiểm soát gốc tự do DDPH được xác định dựa vào phương pháp

đã được Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai, Toshiaki Ohshima (2010) sử dụng để kiểm tra khả năng chống oxi hóa của dịch chiết từ nấm [13]

Nguyên lý: DDPH là gốc tự do, dễ bị oxi hóa, có màu tím đậm Khi có mặt

chất chống oxi hóa, gốc tự do DDPH sẽ nhận điện tử chuyển thành phân tử DDPH

Ống nghiệm Dung dịch hóa chất

và mất màu tím Như vậy, chất có hoạt tính chống oxi hóa càng cao sẽ làm mất màu dung dịch gốc tự do DDPH càng mạnh

Bảng 2.2 Thể tích của các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm

- Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 517nm (sử dụng ống

0 làm mẫu blank)

- Kiểm tra khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân bằng cách cho vào ống nghiệm 0,2ml dịch, 1,8 ml nước cất, 1ml ethanol 96% và 1ml dung dịch DDPH

- Đối với ống đối chứng thay mẫu cần đo bằng nước cất

Với mỗi mẫu đo tiến hành làm mẫu zero gồm 0,2ml dịch cần đo, 1,8ml nước và 2ml ethanol 96%

- Các mẫu được để trong bóng tối 30 phút sau đó đo ở bước sóng 517nm trên máy UV-VIS

Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng DDPH đã bị khử

Ống nghiệm DDPH (ml) Nước cất (ml) Ethanol (ml) Hàm

2.2.2 Phương pháp xử lí số liệu

Số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2007 và DX8.0.1 phiên bản dùng

thử Tất cả các số liệu được lấy từ trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm song song, P= 0,05

Xử lý nhiệt Không xử lý nhiệt