Tối ưu hóa quá trình thủy phân Protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng Enzyme alcalase và đặc trưng tính chất của dịch thủy phân

31 Bảng 2.6 Thiết kế mức thực nghiệm cua các tham số trong tối ưu theo phương pháp Box-B chnken...34 Bảng 2.7 M ô hình thí nghiệm tối ưu theo phương pháp B ox-B eh nken...34 Bàng 3.3 Ket

LỜI CẢM ƠN

Khoá luận tốt nghiệp là bước cuối cùng đánh dấu sự trường thành cùa một sinh viên ờ giàng đường Đại học đè đóng góp những gi mình đã học được cho sự phát triển đất nước.

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sấc đến Th.s Nguyền Thị Kim Cúc và Th.s

Ngô Thị Hoài Dương đã tận tình hướng dần, chỉ dạy và truyền đạt kinh nghiệm và giúp

đờ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công Nghệ sinh học &

Môi trường Thay cô dà tận tinh giúp dở, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý báu dê

cm cỏ dược nền tàng kiến thức vừng chắc.

Con xin gửi tới bò mẹ sự biết ơn sâu sắc Bô mẹ luôn bên cạnh động viên, ùng hộ

và yêu thương con nhất Con sẽ luôn cố găng sống tốt, xứng đáng với niềm tin yêu cũa

bỏ mẹ Con xin cám ơn bố mẹ!

Cuôi cùng, tôi xin gửi lời cam ơn đến chị Nguyền Thị Minh Nhật - cán bộ quàn lý Phòng thí nghiệm Viện CNSIỈ&MT các bạn trong lớp 50CNS1I đà quan tâm và nhiệt tình giúp đờ đề bài luận văn được hoàn thành.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.

Chúc tất cả mọi người sức khóc và thành công!

Nha Trang, tháng 7 năm 2012

Sinh viên Nguyễn Thị Chính

T rang LỜI C Ả M Ơ N ỉ

M ỤC L Ụ C ii

DANH M ỤC B Ả N G V DANH M ỤC H ỈN H vi

DANH M ỤC C Á C T Ừ V IẾ T T Ả T vii

M Ỏ Đ À U 1

C H Ư Ơ N G I: TỎ NG Q U A N 3

1.1 T ổng quan phế liệu t ô m 3

1.1.1 Phế liệu tôm trong clìế biến thủy sản 3

1.1.2 Thành phần hóa hục của phế liệu tô m 3

1.1.3 Enzyme protease cùa tôm [6] 5

1.1.4 Các phương pháp thu nhận protein từ phế liệu tô m 7

1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hoi protein băng enzym e 8

1.2 T ổng quan v ề chất chống oxi h ó a 10

1.2.1 Khái quát chung về gốc tự do và chất chống oxi hóa 10

1.2.1 ỉ Gốc tự do, và sự oxy hoá 10

1.2 ỉ.2 Chat chổng oxi hóa 11

1.2.2 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi h ó a 12

1.2.2.1 Cúc phương pháp HA T 12

ỉ 2.2.2 Các phương pháp E T 13

1.2.3 Tinh hình nghiên cứu khà năng chông oxi hóa từ phế liệu thủy sâ n 14

1.2.4 ứ n g dụng cua chất chống oxi hóa trong thực phẩm 15

1.3 T ống quan về enzym e protease 15

1.3.1 Phân loại và đặc điềm các loại enzyme protease 15

MỤC LỤC

1.3.2 Các yếu tổ ảnh hướng đến quá trình thủy ph ân 18

1.3.3 ứ n g dụng cùa enzyme protease 20

1.4 T ổng quan v ề enzym e A lca la se 21

C H Ư Ơ N G II: ĐÓ I TƯ Ợ N G V À PH ƯƠ NG PH ÁP N G H IÊN c ứ u 22

2.1 Đối tượng nghiên c ứ u 22

2.1.1 Nguyên liệu đẩu tôm 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu và x ử lý số liệ u 22

2.2.1 Phương pháp nghiên cứ u 22

2.2.1 ỉ Phương pháp bố trí thi nghiệm 22

2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chi tiê u 23

2.2.2 Phương pháp xứ lí số liệu 27

2.3 Bố trí thí n g h iệm 27

2.3.1 Quy trình nghiên cứu ảnh hường cua việc xừ lí nhiệt đối với nguyên liệu trước khi thùy phân 27

2.3.2 Đánh giá ảnh hường cùa các yếu to thủy ph ân 29

2.3.3 Tối ưu hóa quá trình thùy phân protein đầu tôm bằng enzyme A lcalase 33

C H Ư Ơ N G III: K ẾT Q UẢ N G H IÊ N c ú u VÀ T H Ả O L U Ậ N 35

3.1 Ảnh hường của xứ lí nhiệt trước khi thúy phân và bố sung enzym e alcalase đến hàm lưọng protein hòa tan của dịch thủy phân 35

3.2 Ảnh hưóng của xử lí nhiệt trước khi thủy phân đến khả nãng chống oxi hóa của dịch thủy p h â n 36

3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố dến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân protein đầu tô m 37

3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa cúa dịch thủy phân protein đầu tô m 41

3.5 Ket qua tối ưu quá trình thiiy phân để thu dịch thuý phân có kha năng khử

gốc tự do D D P H 45

3.6 Dặc trưng tính chất của dịch thúy p h â n 48

K É T LU Ậ N V À KIỀN N G H Ị 50

TÀ I LIỆU TH A M K H Ả O 51 PHỤ LỤC

DANH M Ụ C BẢNG

Bảng I I Thành phần hóa học cơ ban cùa phế liệu tôm thẻ chân trắng 4

Bàng 2.1 Thể tích các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm 25

Bảng 2.2 Thế tích cùa các dung dịch hóa chất cho vào ống ngh iệm 26

Bảng 2.3 Ma trận thí nghiệm đánh giá ảnh hường của việc xir lý nhiệt ban dâu 29

Bảng 2.4 Thiết kế mức thực nghiệm cùa các tham số trong quy trình xác định ảnh hường cùa các yếu tố tới quá trinh thúy phân 31

Bang 2.5 Mô hình thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hường tới quá trình thủy phân 31

Bảng 2.6 Thiết kế mức thực nghiệm cua các tham số trong tối ưu theo phương pháp Box-B chnken 34

Bảng 2.7 M ô hình thí nghiệm tối ưu theo phương pháp B ox-B eh nken 34

Bàng 3.3 Ket quà phân tích mức độ ảnh hương cùa yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan cua dịch thủy phân protein đàu tôm trên phần m ềm D X 8 38

Bàng 3.4 Kết quà phân tích tương tác giữa các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa cua dịch thủy phân protein đầu tôm 41

Báng 3.5 Kct quả nghiên cứu tối ưu theo mô hình B ox-B chnken 45

Bảng 3.6 Kct quá phân tích sự tương thích cùa mô hình bậc hai đối với hàm lượng protein hòa tan 46

Bảng 3.7 Ket quả phân tích sự tương thích cùa mô hình bậc hai đối với hàm lượng Đ D P H bị khử 2 46

Báng 3.8 Một số chi tiêu phàn tích cùa dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm 48

Bảng 3.9 Thành phần acid amin của dịch thủy phân protein từ phố liệu đầu tôm bang enzym e A lc a la se 49

Hình ì ỉ Cơ chê hoai động của chát chông oxi hỏa [22] 11

Hình 1.3 Mỏ hình enzyme Protease thủy phân phân từ Protein lổ Hình 1.4 Phân loại enzyme protease [8] 16

Hình 2.1 S ơ đồ hố trí trí thí nghiệm tỏng quát 23

Hình 2.3 S ự hắt màu cùa phàn ứng Biuret 24

Hình 2.5 Quy trình nghiên cửu anh hường của x ử lý nhiệt trước thủy phân 27

Hình 2.6 Quy trình xem xét ánh hưởng của các yếu to thủy phân 30

Hình 2.7 Quy trình thi nghiệm toi ư u 33

Hình 3.2 Anh hưởng cua x ứ li nhiệt han đầu đên hàm lượng DDPH bị khử 36

Hình 3.3 Kêt quả phân tích ành hưởng cua các yếu tó đến hàm lượng protein hòa tan cùa dịch thúy phân protein dâu tôm trên dô thị Half-Normal 38

llình 3.4 Phàn tích ảnh hương của thời gian đèn hàm lượng protein hỏa tan trên phần mềm DX8 39

Hình 3.5 Phân tích anh hướng cùa nhiệt độ đên hàm lượng protein hòa tan trên phần mem DX8 40

Hình 3.6 Ket quả phân tích Half-Normal đánh giá ảnh hưởng của các yếu to đến khá năng chong oxi hóa cùa dịch thủy phân protein đầu tôm trên phần mem DX8 41 Hình 3.7 Phân rích ảnh hướng cùa thời gian đến hoạt tỉnh chống oxi hỏa cùa dịch thùy phân bằng phần mem D X8 42

Hình 3.8 Kêt quà phàn tích ảnh hướng của nhiệt dộ đên hoạt tinh chống oxi hóa của dịch thủy phân trên phan mem D X 8 43

Hình 3.9 Kêt quà phân tích ảnh hường nông độ enzyme đên hoạt tính chông oxi hóa cùa dịch thủy phân trên phẩn mêm D X 8 44

Hình 3.10 Bê mặt đáp ímg tói UU quá trình thủy phân 47

DANH M Ụ C HÌNH

M Ở D À U

Việt Nam có bờ biển dài khoảng hơn 3.200km và hơn 2 36.972 ha mặt nước nuôi trồng thủy sản đà tạo tiền đề cho ngành chế biến thủy sản phát triển mạnh mẽ Hiện nay, chế biên thủy sản không những đem lại lợi nhuận cao đóng góp ngân sách cho nhà nước mà còn giãi quyết công ăn việc làm cho hàng nghìn lao động Theo Hiệp Hội Chế biến và Xuất khấu Thủy sản Việt Nam (V A SE P), trong 6 tháng đầu năm 2 0 1 1 , cả nước đà xuất khẩu 10.872 tấn tôm, trị giá 971.109 triệu USD, tâng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kì năm 2010 và là nhóm hàng

cỏ mức tăng trường cao nhất trong các nhóm hàng thũy sàn xuất khâu chũ lực cùa Việt Nam Di đôi với việc tăng sản lượng tôm xuất khấu là lượng phế liệu tôm thải

ra cùng tăng lên Tuy nhiên, việc khai thác các sản phẩm có giá trị sinh học từ protein đầu tôm chưa được đầu tư nghicn cứu nhiều ớ nước ta, protein chù yếu mới chi được tận thu như một dạng sản phâm phụ cua quá trình sản xuất chitin đe làm thức ăn gia súc Đ iều này không nhùng gây làng phí tài nguyên mà còn ánh hướng lớn đến môi trường.

Min - Soo Heu và cộng sự (2003); Seymour & Li (19 9 6 ) đà chỉ ra rằng dịch thủy phân protein từ phế liệu đau tôm cỏ chửa thành phần acid amin khá cao và có giá trị về mặt sinh học Vì vậy, việc nghiên cứu tối ưu quá trình thu hồi các sản phấm có hoạt tính sinh học từ protein dầu tôm là rất cần thiết, vì không nhừng vừa nâng cao hiệu quà sử dụng tài nguycn mà còn góp phẩn khuyến khích cái tiến công nghệ sàn xuất chitin ở Việt Nam theo hướng thân thiện với môi trường.

Xuất phát từ nhừng vấn dề trên đề tài “T ối ưu quá trình thuỷ phân protein trẽn dầu tôm thé chân trắn g bằng enzym e A lca la se và dặc trư ng tính chất của dịch thuý ph ân” được thực hiện nhằm xác định chế độ thu hồi và đánh giá hoạt tính sinh học của dịch thu được khi tlìùy phàn đầu tôm bang enzym e A lcalase, một cnzvm c vẫn thường được dùng đê thúy phân đầu tôm hiện nay, từ đó mớ ra hướng ứng dụng sàn phẩm thủy phàn này vào trong thực phẩm và thực phẩm chức năng.

Nội dung của đc tài:

> Đánh giá ảnh hường của v iệc xử lý nhiệt nguyên liệu trước thủy phân.

> Đánh giá ảnh hưởng cùa các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan và khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân đâu tôm.

> Tối ưu quá trinh thuỷ phân protein băng enzym e Alcalase dê thu dịch có hoạt tính chống oxi hóa cao trên dầu tôm thè chân tráng.

> Đánh giá giá trị dinh dường và giá trị sinh học cua dịch thuý phân.

C H Ư Ơ N G I: T Ố N G Q U A N

1.1 T ồng quan phế liệu tôm

/ 1.1 Phế liệu tôm trong chế hiến thủy sán

Phế liệu tôm chù yếu là đầu, vỏ và đuôi tôm, ngoài ra còn có phần thịt tôm do lột vo sai quy cách hoặc tôm biến màu Tùv thuộc vào từng loài, sản phắm chế biến khác nhau mà lượng phế liệu tôm thu được khác nhau Chang hạn, đối với tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergiiy đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm Đau tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng lượng tôm Đ ôi với tôm thè, lượng phế liệu đầu tôm chiếm khoảng 28% Lượng phế liệu này có thể giảm bằng cách cài tiến thiết bị và công nghệ.

V iệc tiêu thụ một lượng lứn tôm nguyên liệu cùa các nhà máy chế biến thủy sản đà thải ra một lượng lớn phế liệu, chú yếu là đầu tôm và vỏ tôm Các loại phế liệu này nếu thai trực tiếp ra môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường nghicm trọng

và nếu đem xư lí chất thai thì chi phí sẽ rất lớn N gày nay, đă có nhiều hướng nghiên cứu sư dụng phế liệu tôm đố sản xuất các chế phấm có giá trị quan trọng như chitin-chitosan, Asthaxanthin.

/ 1.2 Thành phần hỏa học của p h ế liệu tôm

Trong phế liệu tôm có chứa những thành phần quan trọng có giá trị như protein, chitin, canxi cacbonate T ý lệ giìra các thành phần này không ổn định, chúng thay đôi theo giống, loài, đặc điếm sinh thái, mùa vụ T hành phần hoá học

cơ bàn của phé liệu tôm thè chân trắng được nghiên cứu bời Trang Sĩ Trung (2009) thề hiện trong báng 1.1.

Bảng 1.1 T hành phần hóa học CO' bản cùa phế liệu tôm thé chân trắng

> Protein: Protein đầu tôm thường tồn tại ờ 2 dạng chính là dạng tự do (có sằn trong nội tạng và phan cơ thịt còn sót lại gắn với đầu tôm) và dạng liên kết với chitin hoặc canxi carbonate như một phần thống nhất của vó đầu tôm.

> C hitin: Chiếm khối lượng lớn (18,3% ) Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và nhừng hợp chất hừu cơ khác.

> H ệ enzym e: Trong đầu tôm có chứa hệ enzym e hoạt động mạnh đặc biệt là

ở nội tạng, do đó rất dề bị hư hóng Một so enzym e ơ đầu tôm gồm:

- Protease: Là enzym e chu yếu trong đầu tôm, phân giải protein thành acid amin.

- Lipase: phàn giãi lipid thành glyceryl và acid béo

- T yrosin ase: khi có mặt cùa oxi không khí sồ biến dôi tyrosine thành melanin có màu den ánh hưởng tới giá trị cám quan và chất lượng sàn phâm.

> C hất ngấm ra (ý đẩu tôm : Trimethylamin (TM A), Trimethylamin oxyt (TM AO), ure, các acid amin tự d o

N goài các thành phẩn trên trong đầu tôm còn có một lượng nhỏ lipid, photpho

và sắc tố.

Như vậy, phế liệu đầu tôm vừa là nguồn giàu chitin (11% trọng lượng khô) vừa là một nguôn protein tốt (50 - 60% trọng lượng khô), có nhiều giá trị dinh dường và nguồn enzym e.

Ọua bang phân tích thành phần phế liệu tôm (Bang 1.2) cho thấy hàm lượng protein trong phế liệu tôm là khá lớn và như chúng ta đà biết protein có rất nhiều ứng dụng trong thực tể Vi vậy việc thu hồi lượng protein từ phế liệu đầu tôm là rất

có nghĩa.

1.1.3 Enzyme protease của tôm Ị 6/.

Các enzyme tiêu hóa đặc biệt các enzyme tiêu hóa ờ protein ở giáp xác nói chung và ở tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá Protease cua tôm không có dạng pepsin, chú yếu ớ dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin và có kha năng hoạt động rất cao Ngoài ra còn có enzyme Chymotrypsin, astacine, Collagenase

Protease cùa tôm cũng như các loài động vật thúy sinh khác là các protease nội bào, nỏ tập trung nhiều nhất ờ cơ quan tiêu hóa, sau đó đến nội tạng và cơ thịt Đặc biệt ơ tôm do đặc điểm hệ tiêu hóa nội tạng nằm ờ phần đầu nên hệ enzym e sè tập trung nhiều nhất ờ phần đầu sau dó đến các cư quan khác Các enzym e có tác dụng thủy phân protein, tính đặc hiệu rộng rãi, không chì thúy phân các liên két peptide

mà còn thủy phân cà liên kết este, liên két a m in Phần lớn các enzym e thuộc protease cua tôm thường có tính chất chung của một protease:

- Hòa tan dược trong nước, dung dịch nước muối sinh lý dệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ khác, nên dựa vào những đặc tính này đồ tách chiết chúng.

- Bị kết tủa thuận nghịch bơi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, a c eto n e đế thu nhận ché phẩm enzym e.

- Hoạt tính cùa enzym e có thề tăng hoặc giám dưới tác dụng cùa các chất hoạt hỏa hay ức chế.

- Đ ộ hoạt động cua enzym e chịu ảnh hường rất lớn bởi các yếu tó: Nhiệt độ,

pH môi trường.

T rypsin: Có nhiều trong dịch vị tụy tạng, có tác dụng mạnh với các loại protid có phân từ lượng thấp ờ các mối liên kết peptide, amit, este Trypsin từ ruột tôm có pH thích họp là 7,8 ờ 38°c.

P eptidase, erep tase, và các loại khác: Tham gia xúc tác thủy phân liên kết peptide trong phân từ protein và các polypeptide Khả năng tác dụng cùng như tính đặc hiệu cùa các loại enzym e này tùy thuộc vào bàn chất của các nhóm nam liền kề mối liên kết peptide.

C acbonh ydrase: Enzym e này xúc tác thúy phân các glucid và glucozit.

Hiện nay, có nhiều công trình trong và ngoài nước nghiên cứu về hệ enzyme protease cua tôm.

Phan Thị Trân Châu và cộng sự nghiên cứu protease trên tôm biển miền Băc Việt Nam cho thấy phạm vi hoạt động cùa chúng khá rộng từ pH 6 đến 9 và pH hoạt động tối ưu là 7,5 và 8,5 [1].

Nguyền Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H - 75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp là 60°c và 50°c với pH tương ứng là 7,5 và 8,5 Tác giả còn cho thấy có thề sử dụng protease đầu tôm bộp đê thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [5].

Nguyền Văn Truyền (20 0 6 ) đà nghiên cứu chiết xuất protease từ đầu tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii và thu được enzym e protease có nhiệt độ tối thích

là 55°c, pH tối thích là 8 [9].

Nguyền Lộ Hà (2011 ) đâ nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzym e protease

từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản Kết quả nghiên cứu đã phát hiện hộ protease ờ đầu và gan tụy tôm sú có ít nhất 5 loại khác nhau với phân tử lượng từ 20.200 đến 40.2 0 0 Da, riêng đầu tôm còn có them hai protease với phân từ lượng là 49.200 và 76.000 Da Ba protease chiếm vai trò hoạt động chù đạo có phân

tứ lượng 20.200 đến 25.000 Da Protease tôm sú bền nhiệt, có nhiệt độ tối thích là

62°c, pH hoạt động tối ưu là 7,5 với nồng độ muối ăn NaCl thích hợp cho hoạt dộng là 1% Hoạt động của protease gan lụy và đầu tôm giảm khi có mặt cùa một số ion kim loại, đặc biệt là Hg2' lon Mn làm tăng hoạt tính của protease tôm sú [2] Trên thế giới, các nhà nghiên cứu cùng dành sự quan tâm đen khía cạnh này Doek S.N và các cộng sự cho biết protease của thịt tôm he An Đ ộ (p.inducus) là

một protease kiềm, hoạt động cực đại ớ pH 8,0 bền với nhiệt, hoạt động phụ thuộc vào ion kim loại [11].

Shann Tzong Jiang và cộng sự đã tách chiết được Cathepsin D từ một loài tôm nuôi ờ Đài loan, đồng thời cùng xác định được nhiệt độ, pH tối thích cho enzym e này hoạt động, cùng như các yếu tố hoạt hóa và ức chế [17], [18].

1.1.4 Cúc phương pháp thu nhận protein từ p h ế liệu tôm

Đ ể tách protein hiện nay người ta dùng các phương pháp sau:

'S Phương pháp cơ học

Sừ dụng lực cơ học đe tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu vó, đầu tôm Đầu tôm còn tươi được rửa sạch, sau đó đem ép bàng trục lăn hoặc trục vít, thu hồi dịch protein và báo quan Phương pháp này cho hiệu qua thu hồi không cao và thường được dùng kết hợp với phương pháp khác.

m ong muốn do môi trường kiềm mạnh.

c Phương pháp sinh học

Phương pháp này dựa trên dựa trên hệ enzym e có sẵn trong nội tạng đầu tôm hoặc bố sung enzym e thương mại (từ vi sinh vật, thực vật, động vật) đô thúy phân protein đầu tôm thành các peptide, acid amin và thu hồi chúng Có 2 phương pháp: phương pháp ù xi lô và phương pháp bô sung enzym e protease

• Phương pháp ù xi lô

Phương pháp này dựa trên hoạt tinh cùa enzym e protease có sẵn trong phế liệu tôm hoặc bồ sung từ ngoài vào Sự hóa lòng cua mô tôm là kết qua của việc thúy phân protein nhờ hoạt động của enzym e, ngoài ra còn được hồ trợ bàng cách bố

sung các acid hữu cơ Chất lượng cua protein thu được từ phương pháp này chú yếu phụ thuộc vào hàm lượng các acid amin quan trọng.

Trang S ĩ Tm ng và cộng sự (2009) ứng dụng u xi lô bàng acid formic đã loại được 83,1% protein và 66,1% khoáng từ phế liệu tôm trong quá trinh chế biến chitin.

• Phương pháp bồ sung enzym e protease

Phương pháp này giống như phương pháp ù xi lô là đều dựa trên hoạt động thủy phân của enzym e protease đê thu hoi protein Tuv nhiên để giảm thời gian thủy phân người ta bồ sung hàm lượng nhất định enzym e protease nhàm tăng tốc dộ thúy phân trong hồn hợp phế liệu tôm.

'S Phương pháp hóa ỉỷ

Nguyên lý dựa trên việc kết tủa protein bàng cách dùng acid de điều chinh pH dung dịch chứa protein về điểm đăng điện của protein (pH = 4 - 5,5), sau đó dùng các phương pháp lắng, lọc đề thu hoi protein Ưu điểm cua phương pháp là đơn giản, dề tiến hành, có thê thu hồi với hiệu suất cao, có thể ứng dụng thu hoi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm và chế biến thúy sản.

1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hồi protein hằng enzyme

> T rên thế giói

Trên thế giới, vấn đề thu hoi protein từ phe liệu tôm băng enzym e thủy phân

dâ dược nghiên cứu từ lâu (Sim pson và Haard, 1985; Synovviecki và Al-Khateeb,

2000; Mizani và cộng sự, 2005) Các enzym e như A lcalase dâ được sử dụng để thủy phân protein từ phế liệu tôm (Chabcaud, Guerard, Laroque & D ufosse, 2007;

Mizani, Aminlari, 2 0 0 5 ) và trypsin, papain, pepsin (Synow w iecki & Al-Khatccb, 2000; Chakrabarty, 2002), ncutrasc và protease (Rutanapomvarccskuh 2006).

Gildberg và Stenberg, 2001 thu được 68,5% protein từ phế liệu tôm Pandaỉus

W henhong Cao và cộng sự, 2008 đà nghiên cứu thu hoi protein từ phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân, điều chinh nhiệt độ bằng cách nâng nhiệt từ 40 - 70°c, cứ sau 30 phút thi tăng lên 5°c, giừ ờ pH tự nhiên

Kết quá cho thấy tại diều kiện nhiệt độ 40°c, 50°c, 60°c thì hàm lượng protein thu

hồi tương ứng là 43,6% , 73,6% , 87,4% Và kết quá cùng chỉ ra rằng khi nhiệt độ tăng từ 45"C - 60°c là nhiệt độ mà enzym e nội tại hoạt động mạnh nhất thì độ thủy phân (DH ) tăng từ 0 - 48% sau 180 phút khi nâng nhiệt dần lên, lượng protein thu hồi cao nhất là 87,4% tại 60°c.

Józef Synow iecki và cộng sự, 1999 nghiên cứu ứng dụng Alcalase đề khứ protein cùa phế liệu vò tôm Crangon crangon nhẩm thu hồi chitin và protein Ban đầu vỏ tôm Crangon crangon được khừ khoáng sơ bộ bàng dung dịch HC1 10%,

20°c, 30 phút và khử protein bàng enzym e Alcalase, 55°c, pH 8,5 Độ thủy phân

DH cao nhất là 30%, dịch thủy phân thu được có chứa 63% protein so với hàm lượng chất khô tuyệt đối.

> Ớ V iệt N am

Trước đây, nguồn phế liệu tôm chú yếu được cung cấp cho các nhà máy chế biến thức ăn gia súc nhò lè V ó, đầu tôm đà được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi với các phương pháp truyền thống như: s ấ y khô hoặc phơi nắng sau đó đem xay mịn bồ sung vào thức ăn chăn nuôi V iệc sấy khô đòi hỏi năng lượng lớn tốn kém Phơi nắng thì phụ thuộc vào thời tiết, mất vệ sinh và gây ô nhiễm m ôi trường.

Trong nhừng năm gần dây, ngoài việc tận dụng phế liệu tôm thẻ dể sản xuất chitin - chitosan người ta còn nghiên cửu thu hồi lượng protein có giá trị trong các quy trinh sản xuất chitin - chitosan.

Dăng Thị Hiền (2008) đà sử dụng cnzvm c A lcalase đồ thủy phân phe liệu tôm

và tận thu protein, asthaxanthin trong công nghệ sản xuất chitin chitosan Quá trình được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 54°c, 8 giờ, ti lộ enzym e bồ sung 0,22% ,

pH 8, tỷ lộ nước/ nguyên liệu là 1/1 Kct quá thu được 52,7% protein.

Trang Sĩ Trung (2009) đà sử dụng enzym e Flavourzyme trong quy trình sản xuất chitin nhằm tận thu hồn hợp protein và asthaxanthin có tỷ lệ thu hải hàm lượng chất khô cao, tăng hơn 20%, chất lượng chitin, chitosan cao hơn so với phương pháp hóa học truyền thống Hồn hựp protein và asthaxanthin thu được có chất lượng cao thề hiện qua hàm lượng protein và thành phan acid amin, có thê ứng dụng trong

che biến thức ăn gia súc N goài ra còn giám ô nhiễm môi trường so với phương pháp hóa học.

Vìi N g ọ c Bội, Vũ Thị Hoan (2004), đã sử dụng protease đàu tôm sú đề cái thiện khả năng chiết tách chất mùi tử phe liệu tôm và ghẹ.

Trần Lê Minh (2010), nghiên cứu sử dụng 3 loại en/.yme Alcalase, Flavourzyme và Protamex trong quá trình thu nhận phức hợp carotenoprotein từ phế liệu đầu tôm.

Trần Thị Luven và Đ ỗ Thị Bích Thúy (2006), cùng đà nghiên cứu sứ dụng

1.2 T ống quan v ề ch ất chống oxi hóa

1.2 Ị Khái quát chung về gốc tụ' (io và chát chống oxi hỏa

I.2.I.Ỉ Gốc tự do, và sự oxy hoá.

> Cỉốc tự do

Nguyên tử là thành phần cư bán nhất cấu tạo nên vật chất Một nguyên tử bao gồm một hạt nhân và các Nơtron Thông thường, một cặp electron bay trên một quỹ dạo quanh hạt nhân, giống như các hành tinh quay quanh Mặt trời.

Phân tử bao gồm các nhóm nguyền tứ gắn kết với nhau bới hoạt động của các cặp electron này Đ ôi khi trong quá trình phán ứng hóa học, một electron bị kéo ra khỏi chỗ cố hừu cùa nó trong phân tứ, và tạo thành một gốc tự do v ề bàn chất, gốc

tự do là một electron độc thân Các gốc tự do rất không ôn định và nhạy cám Chúng tìm kiếm nhưng electron khác đe hình thành một cặp electron mới Các gốc

tự do gây hại khi chúng kco những electron từ các té bào.

> S ự oxi hóa

Sự oxi hóa là loại phàn ứng hóa học trong đổ electron dược chuyền sang chất oxi hỏa, có khã năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật.

Trong san xuất, bảo quán và chế biến thực phẩm, sự oxy hóa là nguyên nhân hạn chế thời gian báo quan thực phẩm.

1.2.1.2 Chat chỏng oxi hóa

Chat chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Chất chống oxi hóa ngăn chặn sự phá huy tế bào sinh vật bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hàm sự oxi hỏa bằng cách oxi hóa chính chúng

Do đó, người ta thường dùng các chất khừ (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxi hóa.

Cho đến cách đây 10 15 năm vẫn chưa có nhiều nhà nghiên cứu khảo sát về gốc tự do và chất chống oxy hóa Nănì 1959, chi có vài chuyên gia nghiên cứu về vai trò cua các dường chất chống oxy hỏa trcn tuồi tác, ung thư, bệnh tim mạch và đối với sức khỏe nói chung N gày nay có đến hàng nghìn nhà khoa học nghiên cứu

về vấn đề này.

Cơ chế hoạt động của chất chống oxi hóa như sau:

A N T I O X I D A N T

F R E E R A D I C A L

Hình 1 Ị Cư chế hoạt dộng của chất chổng oxi hóa Ị22Ị

Chất chống oxi hóa liên quan đến công nghệ thực phẩm, ngoài ra còn liên quan đến sinh học và y học bởi vì nỏ bão vệ con người trước nhừng tác hại của phán ứng oxi hóa Trong thực phẩm, chất chống oxi hóa thường được hiểu là chất ngăn chặn các gốc tự do gày ra phàn ứng oxi hỏa lipid Tuy nhiên trên thực tế gốc tự do không nhùng chi gây tác hại đến lipid mà còn cả protein, DNA, và các chất khác Vì

vậy, chất chống oxi hóa được định nghĩa rộng hơn là tất cá những chất mà khi ta bồ sung với một hàm lượng nhất định vào đối tượng dề bị oxi hóa thi sẽ ngăn chặn đáng kề phàn ứng oxi hóa xày ra [10] Nhừng đối tượng dề bị oxi hóa ở đây bao gồm thực phẩm, các tế bào song, protein, lipid, D N A Định nghĩa này nhấn mạnh hơn tầm quan trọng của các chất chống oxi hóa.

Một số chất chống oxi hóa tự nhiên được kề đến như: acid ascorbic, tocopherol, carotene, Flavanone và flavonol Ngoài ra còn có các chất chống oxy hóa tổng hợp thường dược sử dụng là: BHT (Butylated hydroxytoluen), BHA (Butylatc hydroxyanisole), tocopherol tống hợp, TBHỌ (Tcrtbutyl hydroquinonc), dodecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palm itate

1.2,2 Các phương pháp xác định hoạt tỉnh chong oxi hóa

Đ e xác định hoạt tính chống oxi hóa cùa một chất có nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp dựa trên các phan ứng phức tạp, phương pháp dựa trên cơ chất, phương pháp dựa trên những phân tử dò, hay dựa trên các điều kiện phàn

ứ n g Tuy nhiên, chúng có thê được chia thành 2 nhóm là MAT (Hydrogen Atom Transfer) và ET (Electron Transfer).

1.2.2 ỉ Các phương pháp H AT

Phương pháp này dựa trên cơ sờ trao dồi nguyên tư Hydrogen Chất oxi hóa và

cơ chất cạnh tranh gốc pcroxyl của các hợp chất azo (R -N =N -R ) Một số phương pháp dựa theo nguyên lý này gồm:

- ORAC (O xygen Radical Absorbance Capacity ): Khá năng hấp thụ gốc oxy

- TRAP ( Total Radical Trapping Antioxidant Param eter):

• Phương pháp làm mat màu Croc in

• 10U (Inhibited O xygen u p ta k e ): u ’c chế sự hấp thu oxy

• Phương pháp dựa trên sự kim hãm quá trình oxi hóa acid linoic

• Phương pháp dựa trên sự ức chế quá trình oxi hóa các Lipoprotein tỳ trọng

thấp (LDL).

> Phư ơng pháp phenol tong số dùng thuốc th ử Folin - ciocalteu (F R C assay) Phương pháp này đầu tiên được dành cho việc phân tích các protein nhờ hoạt động của thuốc thử đối với tyrosine (có chứa một nhóm phenol) Nhiều năm sau, Singleton vả đồng nghiệp mờ rộng xét nghiệm này đê phân tích tong so phenol trong rượu vang, kề từ sau đó người ta đã ứng dụng rộng rãi phương pháp này.

Phương pháp này dược tiến hành bàng cách dun sôi trong 10 giờ hỗn hợp sodium tungstate (N a W 0 4.2H20 , 100g), sodium molybdate (Na2M o4.2H 20 , 25g), HCl (100m l), H ,P 0 4 85% (5()ml), và H20 (700m l) Sau khi sôi, cho thêm vào hồn hợp lithium sulfate (Li2S 0 4.4H20 , 150g:) tạo thành dune dịch thuốc thư FC có màu vàng đậm Neu có chất khứ dung dịch sẽ chuyển thành màu xanh, về bán chất người ta cho rằng có sự chuyền electron từ các chất khử sang cho Mo (VI):

Mo (VI) + e -> M o (V ) Không chi đặc hiệu với các họp chat phenolic mà thuốc thư FC còn phán ứng với các hợp chất khône phải phenolic như vitamin c , Cu2 .C ác hợp chất phenolic phản

ứng với FCR trong điều kiện pH = 10 Sự phân ly của một proton phenolic, tạo thành anion phenolate, phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có màu xanh.

> Plnrong pháp T E A C (T rolox E quivalen t A n tioxid an t C a p a city )

Phương pháp này dược báo cáo dầu tiên bởi M iller và Rice - Evan (1993) Do tiến hành đơn giản nên plurơne pháp TEAC được sứ dụne nhiều cho các nehicn cứu trong phòng thí nghiệm về khá năng chống oxi hóa cua các mẫu thực phẩm.

1.2.3 Tinh hình nghiên cứu khá nàng chỏng oxi hỏa từ p h ế liệu thúy sản

> T rên thế giói

N goài hướng tận dụng phế liệu tôm để sản xuất chitin - chitosan, trên thế giới

đã có nhiều công trình nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học cao dặc biệt là khả năng chống oxi hỏa.

Nghiên cứu cùa Gildberg & Stenberg, 2001 chỉ ra rang sự thúy phân làm giảm chiều dài của các chuỗi peptide, tạo ra nguồn di, tri peptide là một nguồn protein có hoạt tính sinh học

Trên thế giới đã có nhiều côn e trình nghiên cứu về việc tận dụng nguyên liệu còn lại trong quá trình chế biến tôm.

Các chất chống oxi hóa trong phế liệu vỏ tôm đă được nghiên cứu bơi Seymour và Li (1996) Ket quả nghiên cứu cho thấy các chất chống oxi hóa trong

vo tôm là các protein mà đơn phân là các acid amin chửa gốc phenol trong đó các acid amin sap xếp theo một qui tắc nhất định [19].

Năm 2007, bằng các test thử về khà năng chống oxi hóa, một nhỏm các nhà nghiên cứu dă phát hiện ra chắt chống oxi hỏa có trong M ungoong, một món ăn truyền thốne cùa người Thái được làm từ dịch chiết phế liệu tôm Qua nghiên cứu người ta nhận thây răne M ungoong chứa chât chông oxi hóa Dịch hòa tan từ sản phẩm này có hoạt tính chống oxi hóa cao nhờ các test thừ DDPH, khá năng bắt giừ các số c tự do A BTS và FRAP Hoạt tính chống oxi hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch hòa tan từ san phấm này [20].

Năm 2008, S.J.Li, T.A Seym our đà nghiên cứu ứng dụng chất chổng oxi hóa được chiết từ vỏ tôm vào việc bào quản một loại cá mú (thường sống ớ các rặng san hô) nhăm chông sự mât màu và oxi hóa lipid cùa loài cá này K ết quà cho thấy răng dịch chiết bằng dung môi ethanol từ phe liệu tôm khi được bô sung vào mầu bão quản lạnh sẻ có khả năng ngăn chặn sự biến màu của cá và phán ứng oxi hóa lipid cùng xảy ra ít hơn so với các mẫu đối chứng Tuv nhiên, các dịch chiết này thể hiện kha nâng chống oxi hóa thấp hơn so với các chất chống oxi hóa tổng hợp.

Năm 2009, nhóm các nhà khoa học người Thái Lan đà nghiên cứu sản phầm lên men truyền thong tôm và giáp xác (Kapi, K oong - Som and Jaloo) Két quả nghiên cứu chi ra rằng sản phẩm lên men này có hàm lượng protein cao và hầu hết các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là kha năng chống oxi hóa tự nhiên và rất tốt cho sức khóc [14].

> Ờ V iệt N am

Từ trước đến nay, ơ V iệt Nam đà có nhiều đề tài nghiên cứu thu hồi các sản phẩm trên phế liệu tôm Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu mới chi tập trung thu hồi chitin - chitosan, chưa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của phế liệu tôm như protein, asthaxanthin Đặc biệt là hoạt tính sinh học, hoạt tính chống oxi hóa cùa dịch thủy phân protein đầu tôm chưa được quan tâm nhiều và hâu như đang trong giai đoạn nghiên cứu bước đầu V iệc nghiên cứu về hoạt tính sinh học của protein cùa phe liệu tôm trong quá trinh thùy phân sẻ m ờ ra hướng kết hợp thu protein có hoạt tính sinh học với sàn xuất chitin - chitosan và ứng dụng vào lĩnh vực y học, thực phàm, làm tăng hiệu quà kinh tế trong sản xuất.

1.2.4 ứ ng (lụng cùa chắt chống oxi hóa trong thực phẩm

Nhu cầu sử dựng thực phẩm cùa con người ngày càng tâng cao cùng với nó là các đòi hỏi về chất lượng thực phẩm cũng tăng lên Đ ể đáp ứng được những nhu cầu đó thì trong công nghiệp che biến và bao quan cần hạn ché những biến đồi trong

đó có quá trình oxi hóa gây ảnh hưởng nhiều đến giá trị cảm quan và giá trị dinh dường của thực phâm Vì vậy, sir dụng hợp lý các chất chống oxi hóa là rất cằn thiết Chat chống oxi hóa là một loại phụ gia giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác bằng cách khư đi các gốc tự do và oxi hóa chính chúng Trước đây người ta thường sử dụng các chất chống oxi hóa tồng họp, trong đó một

số chất được cho là có nguy CƯ gây ung thư và các bệnh về tim mạch N gày nay người ta hướng đến việc sử dụng các chất chống oxi hóa có nguồn gố c từ tự nhiên, các chất này an toàn hơn so với chất chống oxi hóa tống họp.

1.3 T ống quan về enzym e protease

1.3.1 Phân ỉ oại và đặc điểm các loại enzyme protease

Nhóm enzym e protease xúc tác quá trình thuỹ phân liên kết liên kết peptit (-

C O -N H -)n trong phân tư protein, polypeptit đến sản phẳm cuối cùng là các axit

aniin N goài ra, nhiều protease cũng có khà năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin.

Hình 1.2 Mô lììnlt enzyme Protease thúy phản phân tử Protein

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 cùa lớp thứ 3 (E.C.3.4).

Hình 1.3 Phăn ỉ oại enzyme protease Ị8/

Theo Barret và Donald (1956), Protease dược phân chia thành hai nhóm lớn là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase.

> N hóm 1: Endopeptidase là các enzym e phân giải các lien kết nằm trong mạch polypeptide Dựa vào động học cua cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm:

+ Serin proteinase: Là những proteinase chứa nhóm -O H cùa gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng dối với hoạt động xúc tác cùa enzym e Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrvpsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gôm các enzym e dộng vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzym e vi khuân như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ờ vùng kiềm tính và thề hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm - S H trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vặt như papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ờ vùng pH trung tính, cỏ tính dặc hiệu cơ chất rộng.

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzym e tiêu hóa như: pepsin, chym osin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt dộng mạnh ớ pH trung tính.

+ Mctallo proteinase: Mctallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ớ

vi khuẩn, nấm m ốc cùng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giam mạnh dưới tác dụng cùa EDTA.

> N hóm 2: Exopeptidase Các enzym e thuộc nhóm này có khả năng thủy phân liên kết peptide ngoài cùng cùa chuỗi polypeptide hoặc dầu acid amin, hoặc đâu eacboxyl, tuần tự tách acid amin ra khỏi chuồi polypeptide Dựa vào vị trí tác dộng trên mạch polypeptide, exopeptidase dược phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên két peptide ờ đầu N tự do cùa chuồi polypeptide để giai phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.

+ Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết pcptidc ơ đầu c cua chuồi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

N goài ra, protease được phân loại một cách đơn giàn hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2 - 4

- Protease trung tính: pH 7 - 8

- Protease kiềm: pH 9 - 11

1.3.2 Các yếu tô ảnh hướng đen quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân protein tùy theo mức độ thủy phân, thời gian thúy phân

mà thu được peptide hay acid amin Ọuá trinh thủy phân phế liệu tôm bàng protease có nhiều yếu tố ánh hướng:

> Ả nh hư ởng cua nhiệt dộ

Do bản chất cua enzym e là protein nên sự thay đôi về nhiệt độ thường ánh hường tới hoạt tính enzym e và cnzvm c chi thồ hiện hoạt tính cao nhất ờ một giới hạn nhiệt độ nhất định Thông thường đối với đa so enzym e thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40°c - 50°c, ờ nhiệt độ lớn hom 70°c đa số enzym e bị bất hoạt

Do vậy, nhiệt độ 70°C’ được coi là nhiệt độ tới hạn cùa enzym e.

Theo quy luật cua các phản ứng hóa học thông thường trong khoảng nhiệt độ

mà enzym e chưa bị biến tính, khi tăng nhiệt độ lên 10°c thì vận tốc phàn ứng của enzym e tang lên 1 , 4 - 2 lằn Khi bát đầu có sự biến tính protein thì xày ra 2 hiện tượng: Một mặt vận tốc phán ứng vần tăng theo sự tăng nhiệt độ, mặt khác vận tốc bien tính protein xáy ra nhanh hơn Kốt quả vận tốc phán ứng giám dần cho tới khi đình chi hoàn toàn.

N hiệt độ tối thích cho một enzvm e không phải là hàng số mà nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố: cơ chất, pH môi trường, nồng độ en zy m e

> Ảnh hư ở n g của pH môi trư ò ìig

pH có ảnh hường rất lớn tới vận tốc phàn ứng enzym e, mỗi enzym e chi hoạt động thích hợp nhất ờ một pH xác định gợi là pH hoạt độn g tối thích cùa enzym e,

p ll tối thích cùa đa so enzym e nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hoặc trung tính, chi một số ít hoạt động trong vùng acid mạnh hoặc kiềm mạnh Phế liệu tôm có thê

bị thủy phân bời enzym e protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta phải chọn enzym e nào dóng vai trò là enzym e chính xúc tác cho quá trình thủy phân dẻ tạo

môi trường có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hương cùa các enzym e khác.

> Á nh hư ởng của thời gian

Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ành hưởng đến hiệu quà của quá trình thủy phân và chất lượng cùa sàn phâm thủy phân Hoạt tính sinh học cùa sản phàm thủy phân phụ thuộc lớn vào đội dài cùa các mạch peptide trong sản phâm thủy phân Thời gian kéo dài, enzym e có diều kiện dê cắt mạch triệt dê dần đến sự biến đồi sâu sắc cùa cơ chất Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian thúy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động, sán sinh nhiều sản phẩm cấp thấp: NH;, ITS, in d o l đồng thời làm giảm hoạt tính sinh học của dịch thủy phân Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein chưa triệt đồ dần tới hiệu suất thủy phân kém, gâv lãng phí nguyên liệu và khó khăn trong quá trình lọc rửa thu dịch thủy phân.

> Á nh hưởng của diện tích tiếp xúc

Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzym e và cơ chất cũng ảnh hường đến tốc độ thúy phân Diện tích tiếp xúc càng lớn tốc độ thủy phân càng dề dàng và ngược lại Do dó, để tạo điều kiện cho enzym e protease hoạt dộng tốt người ta thường xay nhò phế liệu tôm.

> Ả nh hư ởng cua nồng dộ enzym e

Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất thì khi nồng độ enzym e tăng vận tốc tãng, khi nồng độ enzym e bão hòa với none dộ cơ chất thi nồng độ enzym e tăng vận tốc không thay đồi.

> Ảnh hư ởng của nồng độ co* chất

Khi enzym e protease kết hợp với cơ chất là phe liệu tôm trước hết sẽ tạo thành phức trung gian cùa enzym e và cơ chất Khi cơ chất đầu tôm tạo phức với enzyme protease sẽ bị thay đôi cả cấu trúc không gian và mức độ bền vừng cua các liên kết Ket quả là các liên kết bị phá vờ và tạo ra sàn phâm thủy phân và giải phóng enzyme Ọuá trinh cứ tiếp tục xảy ra cho đến khi cơ chat hết Neu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trinh thúy phân diền ra đều dặn, nhanh chóng.

> Đ ộ tư oi cua nguyên liệu

Độ tươi của phố liệu tôm có vai trò quan trọng quyết định đến chất lượng của dịch thúy phân, sản phẩm protein thu hồi từ quá trình thủy phân protein và chitin

Độ tươi của phế liệu giảm làm giảm chất lượng của protein do có sự phân hủy protein trong đầu tôm tạo thành các san phẩm thứ cấp như: indol, NH3, H 2S gây

ra mùi khó chịu cho sàn phâm.

> Á nh hưưng của tỳ lệ nước / nguyên liệu

Nước là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến phán ứng thủy phân N ó có khả năng điều chinh phản ứng thủy phân do nước là môi trường tăng cường quá trình phân cất các liên kết nhị dương, là môi trường khuếch tán enzym e và cơ chất tạo điều kiện cho phan ứng thủy phân xảy ra Do vậy, nếu bổ sung nước vào quá trình thủy phân nguyên liệu đầu tôm với tỷ lệ thấp sẽ hạn ché được hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời ức chế hoạt động của enzym e làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu bô sung nước với ty lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phàn huy sản phẳm thành các sàn phàm thử cấp Vì vậy, cằn phải xác định tý lệ nước bô sung cho phù hợp.

1.3.3 ứ n g dụng của enzyme protease

Các protease nói chung dược sừ dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

• T ron g công nghiệp:

- Trong sàn xuất nước chấm: N ước mắm, tương, c h a o

- Trong công nghệ thực phàm: Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi chế b iến

- Trong công nghệ thuộc da: Làm mềm lông, sạch lông, bóng d a

- Trong công nghệ tư tàm: Làm bóng và tách rời các sợi tơ.

- Xà bông, kem giặt có enzym e sẽ tẩy dề dàng các vết bân Đ ặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.

- Trong cô n g nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine dược dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.

• T ron g nông nghiệp:

Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bô sung vào thức ăn cùa lợn và gia cầm.

Enzyme A lcalase 2.4 L FG được phân tách và tinh sạch từ Bacillus

đơn giản do hoạt động trong mội trường pH kiềm tự nhiên cùa đằu tôm Chọn enzym e này cùng dựa trên đặc tính cùa nó cho khá năng không hút nước của các acid amin vào giai đoạn cuối, dần đến sàn phấm thủy phân không có vị đắng (Adlcr-

N issen, 1986) đồng thời sản phẩm có sự cân bang tốt các amino acid thiết yếu (Kristinsson & Rasco, 2000).

Hoạt tính 2,4 A U -A /g N hiệt độ bao quàn tốt nhất 0 - 10°c Enzym e hoạt động tối ưu cho enzym e A lcalase AF 2,4L ờ pH 8, nhiệt độ 50 - 6 0 1>C.

Tất cà protease có thé bị bất hoạt bàng cách xử lý nhiệt ở 90°c trong 10 phút Enzyme A lcalase cùng có thể bất hoạt ở pH=4 hay thấp hơn trong khoáng 30 phút Phan ứng thúy phân có thố dừng tức hời bằng cách thêm vào các acid thích hợp như: acid acetic, lactic, hydrochloric Khi tăng nhiệt dộ tức thời khó đạt dược dưới các điều kiện công nghiệp, hơn nừa khó kiểm soát DH% do sự thúy phân có thế vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt.

C H U Ô N G II: Đ Ó I T Ư Ợ N G VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P N G H I Ê N cứu

2.1 Đối tư ợng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu (lâu tôm

Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) thu mua tại C ông ty Seafood F l 7 Nha Trang Nguyên liệu đầu tôm được thu mua tại phân xương chế biến Yêu cầu nỵuyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lần rác Sau khi lấy, nguyên liệu được bào quân ngay trong thùng xốp cách nhiệt, có ướp đá và vận chuyên ngav về phòng thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm , tiến hành nhặt bỏ vỏ tôm hoặc phần thịt tôm lần trong phế liệu, đề ráo nước Đê tiện lợi cho quá trinh thí nghiệm , phế liệu được cân thành nhừng lượng nhỏ 1 kg được chứa trong các túi

ni lon cột chặt m iệng, sau đó bao quán đông ờ nhiệt độ -70°c tại phòng thí nghiệm.

Khi tiến hành thí nghiệm nguyên liệu được lấy ra râ đông và xay nhỏ (100% là đẩu tôm, tat cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bời cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay từ 0,5 - 0,8cm và tiến hành thí nghiệm ngay.

Hình 2 1 S ơ đồ bố trí trí th í nghiệm tong quát

> Mô tả quy trình

Phế liệu đẩu tôm sau khi bảo quán lấy ra rã đông và xay nhỏ với kích thước

0 ,5 -0 ,8cm Sau đó tiến hành bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hướng của xừ lí nhiệt trước thủy phân nhằm xem xét việc cằn thiết xư lí nhiệt trước khi thúy phân hay không? Tiếp theo, bố trí thí nghiệm nghiên cứu ánh hưởng của các yếu tố thủy phân

từ đó tối ưu quá trình thùy phân để tỉm chế độ thủy phân thích hợp.

2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chi tiêu

> X ác định hàm lư ợ ng protein hòa tan bằng p h ư ơ n g ph áp B iuret

Hàm lượng protein hòa tan được xác định dựa vào phương pháp Biuret dà dược Gom all AG, Bardawill CT, David MM (1949) sử dụng đề xác định protein huyết thanh và Mahmoudreza Ovissipour (2009) Sư dụng để xác định hàm lượng protein thuy phân từ nội lạng cá Beluga sturgeon [15].

N guyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2' thành một phức chất màu tím (phán ứng Biuret) Màu sắc của phức chất ti lệ với số lượng liên kết peptide (C O -NH -) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin.

C ông thức cùa phức Biuret như sau:

Hình 2.2 Công thức của phức Biuret

Hình 2.3 S ự bat màu cita phản ừng Biuret

C ách tiến hành:

- Chuẩn bị thuốc thư Biuret: hòa tan 2 ,34375g C u S 0t.51I;0 và 8,0571 g

C4H4NaK.O0.4H2O trong 500m l nước cất, khuấy đều và cho them 300m l dung dịch N aO H 10% Dung dịch trên được khuấy đều và định mức lên 1000ml bằng nước cất.

- Dựng đường chuấn BSA:

Dune dịch B SA chuấn được pha như sau: hòa tan Ig B SA vào 50ml nước cất rồi khuấy đều đến khi BSA tan hết rồi định mức lên 100 ml nước cất Cuối cùng thu được dung dịch B SA có hàm lượng 10mg/ml.

Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự 0 - 5 Sau đó cho các dung dịch hóa chất vào với thể tích như sau:

Bảng 2.1 Thề tích các du ng dịch hóa ch ất cho v à o ống nghiệm

D ung dich hóa chất

- Kiêm tra hàm lượng protein của dịch sau khi thủy phàn

Cho lm l dịch vào ống nghiệm , cho thêm 4ml thuốc thử Biuret, vortex và ũ 30 phút ớ nhiệt dộ phòng Sau khi ù, mang các mầu so màu trên máy so màu ở bước sóng 570nm Đ ọc giá trị mật độ quang, dựa vào dường chuần đề xác định hàm lượng protein trong mầu.

> X ác định khả năng chống oxi hóa của dịch thu đư ợc bằn g test kiếm soát gốc tự do DDPH

Xác định khả năng chống oxi hóa thông qua kha năng kiếm soát gốc tự do DDPH Khá năng kiềm soát gốc tự do DDPH được xác định dựa vào phương pháp

đã được Huỳnh Nguyền Duy Bao, Yoshihiro Ochiai, Toshiaki Ohshima (20 1 0 ) sừ dụng đế kiểm tra khả năng chống oxi hóa của dịch chiết từ nấm [13].

N guyên lý: DDPH là gố c tự do, dề bị oxi hóa, có màu tím đậm Khi có mặt chất chống oxi hóa, gốc tự do DDPH sỗ nhận điện từ chuyền thành phân tứ DDPH

và mất màu tím N hư vậy, chất có hoạt tính chống oxi hóa càng cao sẽ làm mắt màu dung dịch gốc tự do D D PH càng mạnh.

Bảng 2.2 Thế tích của các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm

Óng nghiệm DDPH (ml) Nước cất (ml) Ethanol (ml) Hàm

- Dối với ống đối chứng thay mẫu cần đo bằng nước cất.

Với mồi mẫu đo tiến hành làm mẫu zcro gồm 0,2m l dịch cần đo l,8 m l nước và 2ml ethanol 96%.

Các mầu được để trong bóng tối 30 phút sau đó đo ớ bước sóng 5 1 7nm trên máy UV-VIS.

Dựa vào dường chuẩn đê xác định hàm lượng DDPH đã bị khứ.

Không bô Bổ sung A lcalasc Không bồ

Hình 2.4 Quy trình nghiên cứu ánh hướng của x ứ lý nhiệt trước thúy phàn