Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase

i LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp, ngoài nỗ lực của bản thân còn có sự giúp đỡ tận tình của những người đi trước, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến những người đã giúp đỡ em trong suốt thời gian qua, nhất là thời gian 3 tháng thực tập trên phòng thí nghiệm. Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.Ts Ngô Đăng Nghĩa, cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương đã luôn bên em, trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em có thể từng bước hoàn thành tốt đề tài. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn các thầy cô trong trường, nhất là các thầy cô trong khoa công nghệ thực phẩm, bộ môn công nghệ chế biến đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian em theo học tại nhà trường. Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy, cô phụ trách phòng thí nghiệm Hóa sinh – vi sinh thực phẩm, cùng thầy cô bộ môn quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm, bộ môn công nghệ lạnh, các anh chị trung tâm công nghệ sinh học và Trung tâm ứng dụng công nghệ chế biến trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực tập. Em chân thành cảm ơn chị Ngọc Hoài sinh viên cao học thạc sĩ, các bạn sinh viên lớp 50CBTS, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ động viên em. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em thân yêu, những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Nha Trang, ngày 10 tháng 07 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Hồng Anh Diễm ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Khái quát về phế liệu tôm 3 1.1.1. Tình hình nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu tôm Việt Nam 3 1.1.2. Sản lượng phế liệu tôm trong chế biến thủy sản 4 1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm 5 1.1.3.1. Thành phần hóa học của phế liệu tôm 5 1.1.4. Các hướng tận dụng phế liệu tôm 6 1.1.4.1. Sản xuất thức ăn chăn nuôi 7 1.1.4.2. Sản xuất chitin – chitosan và các dẫn xuất khác của chitin 7 1.1.4.3. Sản xuất màu Astaxanthin 8 1.1.4.4. Làm các sản phẩm định hình 8 1.1.4.5. Sản phẩm súp và canh, mắm tôm và gia vị 8 1.2. Enzyme protease và quá trình thủy phân protein 8 1.2.1. Enzyme protease 8 1.2.1.1. Phân loại protease 9 1.2.1.2. Nguồn thu nhận protease 10 1.2.1.3. Cơ chế tác dụng của protease 10 1.2.1.4. Hoạt độ enzyme 11 1.2.1.5. Enzyme Alcalase 12 1.2.1.6. Hệ enzyme protease của tôm 12 iii 1.2.2. Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease 14 1.2.2.1. Protein thủy phân 14 1.2.2.2. Phương pháp sản xuất protein thủy phân 16 1.2.2.3. Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein 16 1.2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein 17 1.3. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 19 1.3.1. Nguyên tắc 20 1.3.2. Công dụng của RMS 21 1.3.3. Ưu, nhược điểm của RMS 22 1.3.4. Các mô hình thí nghiệm trong RMS 22 1.3.4.1. Thiết kế Box-Behnken (BBD) 22 1.3.4.2. Thiết kế Central composit (CCD) 23 1.4. Các nghiên cứu và ứng dụng nguyên liệu còn lại từ nguyên liệu tôm 25 1.4.1. Trên thế giới 25 1.4.2. Ở Việt Nam 27 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm 28 2.1.2. Enzyme Alcalase 28 2.1.3. Hóa chất 28 2.2. Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu 28 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1.1. Phương pháp thu nhận mẫu 28 2.2.1.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 29 2.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 30 2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 2.3.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 31 iv 2.3.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 33 2.3.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng 34 2.3.5. Bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất của dịch thủy phân protein thu được 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 39 3.1.1. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được 39 3.1.2. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được 41 3.1.3. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein còn lại trên bã 43 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 44 3.2.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân 44 3.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân 50 3.3. Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng 56 3.4. Kết quả đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein thu được 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 73 4.1. Kết luận 73 4.2. Đề xuất ý kiến 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC 1 v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaeus vannamei 6 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cho các giá trị ở biên 33 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm ở tâm phương án 34 Bảng 2.4. Mức thí nghiệm của các yếu tố cho thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm 35 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm theo RMS-CCD 36 Bảng 3.1. Bảng Effect list cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 44 Bảng 3.2. Bảng Effect list cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 50 Bảng 3.4. Kết quả ma trận quy hoạch thực nghiệm theo RMS-CCD 57 Bảng 3.5. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 58 Bảng 3.6. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 58 Bảng 3.7. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu hiệu suất khử protein còn lại trên bã 58 Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA 59 Bảng 3.9. Bảng tổng hợp các tiêu chí lựa chọn chế độ xử lý tối ưu cho quá trình thủy phân protein trên đầu tôm 67 Bảng 3.10. Nhận xét cảm quan dịch thủy phân protein từ đầu tôm 70 Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu sinh hóa học của dịch thủy phân protein từ đầu tôm 71 Bảng 3.12. Thành phần % các axit béo 71 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease 11 Hình 1.2. Phản ứng thủy phân protein 14 Hình 1.3. Sơ đồ chức năng chuyển đổi 20 Hình 1.4. Biểu diễn hình thức của chức năng đáp ứng 21 Hình 1.5. Thiết kế Box-Behnken 23 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 32 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein 37 Hình 3.1. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được 39 Hình 3.2. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được 41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein còn lại trên bã 43 Hình 3.4. Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân 45 Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan 47 Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan 48 Hình 3.7. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan 49 Hình 3.8. Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân 51 vii Hình 3.9. Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nồng độ enzymem, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân. 53 Hình 3.10. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử 54 Hình 3.11. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ và thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử của dịch thủy phân 55 Hình 3.16. Đồ thị của hàm lượng protein hòa tan , nồng độ DPPH bị khử và hiệu suất khử protein còn lại 62 Hình 3.17. Đồ thị e i vs Run của hàm lượng protein hòa tan, nồng độ DPPH bị khử và hiệu suất khử protein còn lại 63 Hình 3.18. Biểu đồ Contour và 3D-surface cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 69 Hình 3.19. Biểu đồ Contour cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 69 Hình 3.20. Biểu đồ Contour và 3D-surface cho hàm mục tiêu hiệu suất khử protein còn lại trên bã 70 Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn thành phần % của các axit amin có trong dịch thủy phân tối ưu. 72 viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT NL : Nguyên liệu XL : Xử lý đv : Đơn vị TLK : Trọng lượng khô DH : Độ thủy phân TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam E : Enzyme S : Cơ chất DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl TN : Thí nghiệm RMS : Phương pháp bề mặt đáp ứng BSA : Bovine serum albumin Da : Dalton (Đơn vị khối lượng phân tử peptid) 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay ở nước ta ngành chế biến thủy sản đã trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của đất nước, chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Trong đó, mặt hàng tôm được coi là một trong các mặt hàng xuất khẩu thủy sản chủ lực có mức tăng trưởng khá cao. Với sự phát triển ngày càng cao của khoa học công nghệ, bên cạnh các sản phẩm chính, nguyên liệu còn lại bao gồm đầu và vỏ tôm cũng đã và đang được tận dụng một cách tối đa và hiệu quả như sản xuất bột đạm, thức ăn chăn nuôi, tách chiết astaxanthin, sản xuất chitin-chitosan Điều này đã góp phần to lớn trong việc xử lý ô nhiễm môi trường, nâng cao giá trị cho ngành thủy sản và tạo thêm nhiều công ăn việc làm, thu nhập cho người dân. Trong phế liệu đầu tôm có chứa tới 50% hàm lượng protein [4] với đủ các thành phần axit amin không thay thế và có giá trị cao về mặt sinh học. Vì thế việc nghiên cứu quá trình thủy phân protein từ đầu tôm này là hết sức cần thiết. Một số nghiên cứu về quá trình thủy phân protein trên đầu tôm đã được quan tâm thực hiện ở nước ta nhưng phương pháp bố trí thí nghiệm được sử dụng chủ yếu là phương pháp cổ điển, vì thế chưa đánh giá được đầy đủ tác động của các yếu tố ảnh hưởng. Nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới đã chỉ ra rằng quá trình thủy phân protein trên đầu tôm là một quá trình chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân… (Diniz and Martin 1997a; Deng et al. 2002). Vì vậy để có thể hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng và sự tương tác qua lại của chúng cần sử dụng các công cụ toán học hiện đại để hỗ trợ. Box và Wilson đã giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS), một công cụ hết sức hiệu quả cho phép nghiên cứu tối ưu các quá trình thủy phân. Trước tình hình đó, dưới sự hướng dẫn của thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa và cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương, em đã thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase”. 2 2. Mục đích của đề tài  Xác lập chế độ thủy phân protein tối ưu trên đầu tôm thẻ chân trắng với Alcalase bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để thu hồi đồng thời protein và chitin.  Đặc trưng tính chất của dịch thuỷ phân. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Kết quả của đề tài sẽ là dữ liệu khoa học về sử dụng enzyme trong thu hồi sản phẩm hữu ích từ nguyên liệu còn lại trong quá trình chế biến tôm, đồng thời cho phép tối ưu hoá quá trình sản xuất ở qui mô pilot. 4. Nội dung đề tài  Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thuỷ phân và việc bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm.  Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm.  Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase.  Đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân. [...]... cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng các enzyme protease từ vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS) Ông đã nghiên cứu sử dụng các enzyme Alcalase, Neutrase và Flavourzyme cho quá trình thủy phân protein trong phế liệu tôm So sánh hoạt động thủy phân của các enzyme này, ông kết luận rằng Alcalase cho kết quả thủy phân tốt nhất Dùng phương pháp bề mặt đáp ứng, phương. .. 92 ÷ 95% Những nghiên cứu trên đã cho biết được các thông số tối ưu cho một quá trình thủy phân protein trên đầu tôm Tuy nhiên, hầu hết phương pháp bố trí thí nghiệm vẫn là phương pháp cổ điển do đó chưa đánh giá được tác động của các yếu tố đến quá trình thủy phân protein Chính vì thế việc nghiện cứu tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm bằng phương pháp bề mặt đáp ứng hiện đại hơn sẽ đánh... (CCD) để tối ưu quá trình thủy phân protein từ phế liệu tôm, ông đã đưa ra được chế độ thủy phân tối ưu là nhiệt độ thủy phân 59,37oC, ở pH 8,25, thời gian thủy phân 84,42 phút, nồng độ enzyme/ cơ chất 1.84%, cho độ thủy phân 33,13% Protein thủy phân thu được có giá trị dinh dưỡng cao, chứa hàm lương protein cao (72,3%), axit amin (529,93 mg/g) với các axit amin thiết yếu Hoạt tính sinh học từ protein tôm. .. thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn như axit amin Enzyme mà xúc tác cho phản ứng thủy phân protein là protease hay proteinase Quá trình thủy phân diễn ra như sau: Enzyme Protein enzyme polypeptide H2O enzyme peptid H2 O axit amin H2 O Do vậy, tùy thuộc vào mức độ thủy phân, thời gian thủy phân và mục đích thủy phân mà người ta... yếu Tuy nhiên ưu điểm của phương pháp là tận dụng được các enzyme protease có sẵn trong bản thân nguyên liệu, phương pháp đơn giản, không sử dụng máy móc, thiết bị phức tạp nên dễ thực hiện - Phương pháp bổ sung enzyme protease: cũng giống như phương pháp ủ xi lô là lợi dụng hoạt động thủy phân protein của protese để thu hồi protein Tuy nhiên, để giảm thời gian thủy phân người ta bổ sung enzyme protease... mạch protein, cho nên khi tiến hành quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cũng cần quan tâm đến enzyme nội tại này 14 1.2.2 Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease 1.2.2.1 Protein thủy phân [7], [8] Protein là một chuỗi polymer dài, mà bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên peptid Phản ứng liên quan tới việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng. .. thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp Vì vậy ta phải xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân 1.3 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) [13] Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các dữ liệu định lượng... enzyme 16 1.2.2.2 Phương pháp sản xuất protein thủy phân [9] Để sản xuất protein thủy phân người ta thường sử dụng hệ enzyme có sẵn trong nguyên liệu hoặc bổ sung enzyme để thủy phân protein thành các phần peptid, axit amin và thu hồi chúng Trong đó, có hai cách làm, là ủ xi lô và bổ sung enzyme protease - Phương pháp ủ xi lô: thủy phân nguyên liệu nhờ các enzyme có sẵn trong nguyên liệu, ngoài ra... tố trên và tác động qua lại giữa chúng nhằm mục đích tối ưu hóa, cho ra giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán mà phương pháp thực nghiệm cổ điển chưa giải quyết Từ đó quá trình tối ưu sẽ trở nên dễ dàng và chính xác hơn 28 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên cứu Đầu tôm. .. xúc giữa enzyme và phế liệu tôm cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ phế liệu tôm Khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại e Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy . ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase . 2 2. Mục đích của đề tài  Xác lập chế độ thủy phân protein tối ưu trên đầu tôm thẻ chân. trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 33 2.3.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng 34 2.3.5. Bố trí thí. hóa của dịch thủy phân 50 3.3. Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng 56 3.4. Kết quả đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein thu