Nghiên cứu thu hồi hỗn hợp caroten protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp ủ xi lô kết hợp HCl và lactic

Xác định điều kiện thủy phân thích hợp của acid lactic trong công đoạn sau của quá trình thu hỗn hợp caroten-protein có hàm lượng carotenoid cao từ đầu tôm sau khi đã xử lý bằng acid HCl

o0o

PHẠM THỊ SÂM

NGHIÊN CỨU THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN

TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

o0o

PHẠM THỊ SÂM

NGHIÊN CỨU THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN

TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để thực hiện đề tài tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan tâm tận tình của quý thầy cô hướng dẫn khoa học, Khoa Công nghệ Thực Phẩm và các bạn bè đã giúp tôi hoàn thành báo cáo này

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn ThS Phạm Thị Đan Phượng đã hết lòng chỉ bảo, tạo điều kiện và hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn PGS-TS Trang Sĩ Trung đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia đề tài: “Nghiên cứu sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu tôm để ứng dụng trong nông nghiệp” do Bộ Khoa học và Công nghệ cấp

Cảm ơn sự giúp đỡ của ThS Nguyễn Công Minh, ThS Nguyễn Thị Như Thường đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Công nghệ Thực phẩm Trường Đại Học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi thuận lợi trong quá trình học tập, nghiên cứu đề tài

Xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè đã bên cạnh giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đề tài

Cuối cùng con gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến mẹ và anh chị em thân yêu, những người luôn sát cánh bên con và ủng hộ con cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt bốn năm ngồi trên ghế giảng đường và thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp Trong quá trình nghiên cứu và tiến hành thực hiện đề tài cũng như quá trình hoàn thành báo cáo thì do kinh nghiệm thực tiễn, vốn kiến thức khoa học chưa sâu nên khả năng lập luận còn nhiều thiếu sót Mong thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến để bài báo cáo được hoàn thiện

Xin chân thành cảm ơn

Nha trang, ngày tháng năm

Sinh viên Phạm Thị Sâm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI MỞ ĐẦU vi

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước có liên quan tới đề tài 3

1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

2 Tìm hiểu về phế liệu tôm 5

2.1 Phế liệu tôm 5

2.2 Thành phần hóa học của vỏ và đầu tôm 6

3 Tìm hiểu về carotenoprotein 8

3.1 Carotenoid 9

3.1.1 Tính chất vật lý của astaxanthin 12

3.1.2 Tính chất hóa học 12

3.2 Ứng dụng của caroten-protein 14

4 Tổng quan về phương pháp ủ xi lô 15

5 Phương pháp thu hồi hỗn hợp caroten-protein 18

6 Các tác nhân acid thủy phân hỗn hợp caroten-protein 20

6.1 Tìm hiểu về một số tác nhân bằng acid 20

6.2 Kết hợp hai acid trong quá trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein giàu carotenoid 21

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

1 Đối tượng nghiên cứu 23

2 Phương pháp thực nghiệm 25

2.1 Xác định điều kiện thủy phân thích hơp của acid HCl trong công đoạn đầu của quá trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein có hàm lượng carotenoid cao từ đầu tôm

27

2.1.1 Xác định nồng độ acid HCl thích hợp khi kết hợp với acid lactic 27

2.1.2 Xác định thời gian xử lý bằng acid HCl thích hợp 28

2.2 Xác định điều kiện thủy phân thích hợp của acid lactic trong công đoạn sau của quá trình thu hỗn hợp caroten-protein có hàm lượng carotenoid cao từ đầu tôm (sau khi đã xử lý bằng acid HCl) 30

2.2.1 Xác định nồng độ acid lactic thích hợp 30

2.2.2 Xác định thời gian xử lý bằng acid lactic thích hợp 32

3 Các phương pháp phân tích sử dụng chính 34

4 Phương pháp xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu 35

3.2 Điều kiện xử lý đầu tôm thích hợp bằng phương pháp kết hợp hai acid (vô cơ và hữu cơ) 36

3.2.1 Điều kiện thủy phân thích hợp của acid HCl trong công đoạn đầu của quá trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein giàu carotenoid từ đầu tôm 36

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid HCl sử dụng đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng protein và carotenoid của chế phẩm giàu carotenoid 36

3.2.1.2 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân HCl đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein 38

3.2.2 Điều kiện thủy phân thích hợp của acid lactic trong công đoạn sau của quá trình hu nhận hỗn hợp giàu carotenoid ừ đầu tôm 40

3.2.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid lactic đến hiệu suất thu hồi, và hàm lượng astaxanthin trong hỗn hợp caroten-protein 41

3.2.2.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý đầu tôm bừng acid lactic đến hiệu suất thu

hồi và hàm lượng astaxanthin trong hỗn hợp carotein-protein 43

3.3 Đề xuất quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng phương pháp ủ xi lô kết hợp acid HCl và acid lactic từ đầu tôm thẻ chân trắng 44

3.4 Thành phần hóa học của hỗn hợp caroten-protein 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học chính của đầu và vỏ phế liệu tôm 6

Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng 8

Bảng 1.3 Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid 15

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng 35

Bảng 3.2 Đánh giá cảm quan của hỗn hợp caroten-protein thu nhận từ đầu tôm 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Các liên kết hóa học có thể có của astaxanthin với các phân tử khác trong

tôm 9

Hình 1.1 Cấu tạo của astaxanthin 11

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một vài Astaxanthin 11

Hình 1.3 Sự thay đổi cấu trúc phân tử astaxanthin khi tương tác với acid yếu 13

Hình 1.4 Astacene 13

Hình 1.5 Crustaxanthin 13

Hình 1.4 Quá trình thu hồi caroten-protein bằng phương pháp ủ xi lô 17

Hình 2.1 Đầu tôm thẻ chân trắng 23

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 25

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid HCl thích hợp 27

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid lactic thích hợp 31

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng acid lactic 33

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid HCl sử dụng đến hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein 37

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý HCl trong quá trình thủy phân đến hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein 39

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ acid lactic sử dụng đến hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein 41

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý acid lactic đến hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein 43

Hình 3.5 Quy trình sản xuất hỗn hợp carotenoprotein bằng phương pháp ủ xi lô kết hợp hai acid HCl và acid lactic 45

Hình 3.6 Mẫu sản phẩm sản xuất theo quy trình đề xuất 46

Hình 3.7 Mẫu đối chứng 46

LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

Ở nước ta, chế biến thủy sản là ngành mũi nhọn Ước tính phế thải tôm khoảng hơn 240.000 tấn/năm (theo tổng cục thủy sản Việt Nam), trong đó có khoảng 144,000 tấn đầu tôm [2] Phế thải tôm được sử dụng để làm thức ăn chăn nuôi với các phương pháp truyền thống như: Sấy khô hoặc phơi nắng sau đó đem đi xay mịn bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Việc sấy khô đòi hỏi năng lượng lớn, tốn kém Phơi nắng thì phụ thuộc vào thời tiết, mất vệ sinh và gây ô nhiễm môi trường

Cả hai phương pháp này không loại được khoáng và chitin mà hai chất này gây khó tiêu cho gia súc, gia cầm Vậy nếu lợi dụng tổng hợp phế thải này bằng cách tách riêng phần protein ở đầu tôm ra phục vụ chăn nuôi, tách hợp chất màu (Astaxanthin) để phục vụ công nghiệp nhuộm, chế biến chitosan để phục vụ nông nghiệp, công nghiệp, mỹ phẩm, y tế thì giá trị mang lại từ nguồn phế liệu tôm sẽ lớn hơn gấp nhiều lần so với chỉ đem phế liệu tôm đi sấy khô hay phơi nắng nghiền bột cho gia súc, gia cầm ăn

Trước tình hình đó các nhà nghiên cứu đã đưa ra các giải pháp vừa giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường, vừa nâng cao giá trị sử dụng cho các phế liệu đem lại hiệu quả kinh tế cao Một trong những giải pháp đó là sử dụng phế liệu tôm để sản xuất chitin-chitosan, tuy nhiên chưa ai chú ý đến công đoạn tiền xử lý bằng acid trước khi ủ để loại bỏ một phần khoáng và protein nhằm mục đích rút ngắn thời gian xử lý, nâng cao chất lượng chitin-chitosan, đồng thời tận thu được nguồn protein và sắc tố có giá trị dinh dưỡng cao từ đầu tôm Do đó việc sử dụng công đoạn tiền xử lý bằng acid trong sản xuất chitin-chtosan rất quan trọng, cho nên trong đề tài này với mục tiêu là áp dụng acid hydrochloric ở công đoạn đầu để tạo điều kiện cho acid lactic hoạt động tốt hơn, duy trì pH thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển, ức chế vi sinh vật gây thối hoạt động và hạn chế hư hỏng astaxanthin trong hỗn hợp caroten-protein

Nhận thấy được tính cấp thiết của vấn đề, đồng thời giúp sinh viên làm quen với nghiên cứu khoa học, tôi đã được ThS Phạm Thị Đan Phượng giao cho đề tài:

“Nghiên cứu thu hồi hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm bằng phương pháp ủ xi lô kết hợp acid hydrochloric và acid lactic” để làm đề tài tốt nghiệp

Tên đề tài: Nghiên cứu thu hồi hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm bằng phương

pháp ủ xi lô kết hợp acid hydrochloric và acid lactic

Nội dung:

1 Xác định thành phần hóa học của đầu tôm thẻ chân trắng

2 Xác định điều kiện xử lý bằng acid hydrochloric (Nồng độ acid, thời gian ủ) ở giai đoạn đầu trong quá trình xử lý kết hợp với acid hữu cơ để thu được hỗn hợp caroten-protein có hàm lượng carotenoid cao

3 Xác định điều kiện xử lý bằng acid lactic (Nồng độ, thời gian ủ) ở giai đoạn sau trong quá trình xử lý kết hợp với acid HCl ở công đoạn đầu để thu được hỗn hợp caroten-protein có hàm lượng carotenoid cao

4 Đề xuất quy trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp ủ xi lô kết hợp hai acid vô cơ và hữu cơ

5 Đánh giá chất lượng hỗn hợp caroten-protein thu được theo quy trình đề xuất

Mục tiêu: Nghiên cứu quy trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein có hàm

lượng carotenoid cao từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp ủ xi lô kết hợp hai acid vô cơ và hữu cơ

Ý nghĩa khoa học:Hoàn thiện phương pháp ủ xi lô bằng acid thu hồi hỗn hợp caroten-protein đạt hiệu quả cao với chi phí thấp

Ý nghĩa thực tiễn: Áp dụng công nghệ sản xuất caroten-protein vào trong công nghiệp Sản xuất thức ăn cho cá hồi, cá cảnh

Phạm vi nghiên cứu: Đầu tôm thẻ chân trắng thu nhận tại các nhà máy chế

biến thủy sản tại Khánh Hòa

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước có liên quan tới đề tài

1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, việc tận dụng các phế liệu thủy sản ở các nước có nền công nghiệp chế biến thủy sản phát triển để sản xuất ra các sản phẩm gia tăng có chất lượng được các nhà nghiên cứu hết sức chú trọng và quan tâm Hợp chất chitin, chitosan được các nhà nghiên cứu chú trọng [29] và có nhiều thành tựu trong lĩnh vực này

Bên cạnh đó, việc thu nhận bột đạm giàu carotenoid cũng được quan tâm nghiên cứu Các sản phẩm protein thu được có thể ứng dụng trong chế biến thức ăn cho người hoặc gia súc ở dạng đạm giàu carotenoid hoặc chất mùi tôm Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào phế liệu của tôm sú hay các loại tôm đặc thù ở khu vực Châu Âu hay Bắc Mỹ; các nghiên cứu trên phế liệu tôm thẻ chân trắng thì còn rất hạn chế [23]

Với những hiệu quả khi sử dụng astaxanthin làm thức ăn cho thủy sản (cá hồi,

cá cảnh) mang lại, thì astaxanthin hay còn gọi là carotenoid được sự quan tâm, chú trọng của các nhà nghiên cứu Sử dụng thức ăn có chứa carotenoid thường xuyên có khả năng bảo vệ tế bào và ngăn ngừa được nhiều loại bệnh trong đó có cả bệnh ung thư và bệnh tim mạch [28] Enzyme trypsin (có trong đầu tôm) là enzyme tốt nhất cho việc tách chiết hỗn hợp caroten-protein Phương pháp enzyme lấy đi khoảng 90% protein và carotenoid từ phế liệu tôm [34] Một số tác giả khác đã đưa ra quy trình trích ly carotenoid từ phế liệu tôm trong dầu nành Dầu được cho vào phế liệu được thủy phân sau đó trộn lẫn với nhau, hỗn hợp được giữ nhiệt, sau đó được thu hồi bằng cách ly tâm Sử dụng phương pháp tự thủy phân sử dụng enzyme nội tại kết hợp với sự tăng dần nhiệt độ (nửa giờ tăng 5oC từ 40-70oC) đã cho thấy sự hiệu quả trong việc thu hồi protein trong đầu tôm thẻ chân trắng [22] Hàm lượng protein của đầu tôm và dịch tự thủy phân bằng phương pháp tăng dần nhiệt độ đạt 60,6% và 88,8% Chen và Meyers (1982) đã sử dụng acid trong quá trình lên men để thu nhận

carotenoid [24] Armenta và cộng sự (2009) đã cho thấy một hàm lượng amino acid cao của hỗn hợp caroten-protein trong quá trình lên men, có thể được sử dụng trong chế độ ăn của con người và động vật do nồng độ acid amin thiết yếu cao [21]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ngày nay, việc sử dùng phế liệu đầu tôm được nhiều nhà khoa học chú trọng, được biết đến nhiều nhất qua việc sản xuất chitin – chitosan, chiết rút các chất màu, chất mùi, phục vụ cho các ngành công nghệ Gần đây, trong quy trình sản xuất chitin để tách protein ra khỏi thành phần chitin trong phế liệu, người ta sử dụng các phương pháp sinh học (vi sinh vật và enzyme) sử dụng protease hay lên men để thủy phân protein Song các phương pháp trên có chi phí cao hơn rất nhiều so với phương pháp hóa học Bên cạnh đó, các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp ủ xi

lô nhằm khử khoáng và protein trong công nghệ sản xuất chitin-chitosan nhưng chưa chú tâm đến việc thu hồi hỗn hợp caroten-protein Sử dụng phương pháp hóa học vào việc thu hồi hỗn hợp caroten-protein, ngoài quan tâm đến hiệu suất thu hồi

và hàm lượng astaxanthin thì còn phải quan tâm đến việc giảm chi phí, thời gian ngắn nhất cho việc thu hồi để có thể ứng dụng kết quả nghiên cứu vào trong thực tiễn, công nghiệp

Năm 2004, Hoàng Thị Huệ An nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ phế liệu

vỏ tôm bằng dung môi [1] Trang Sĩ Trung và Trần Thị Luyến (2010) cũng đã có nhiều nghiên cứu về sử dụng enzyme protese như papain, Flavourzyme, Alcalase để khử protein [18] Bên cạnh đó còn có một số nghiên cứu sử dụng các loại vi khuẩn

Bacillus subtilic để tận thu caroten-protein Đồng thời protein trong dịch thủy phân

có thể sử dụng để bổ sung vào thức ăn của động vật thủy sản

Trong khi đó năm 2009, Ngô Thanh Lĩnh cũng đã nghiên cứu sử dụng acid hữu cơ ở nồng độ thấp trong quy trình sản xuất chitin-chitosan để khử protein, khoáng đồng thời tận thu được dịch ủ, thu hồi caroten-protein Nhưng phương pháp này thì tiết kiệm được chi phí nhưng tốn nhiều thời gian, dịch thủy phân thu được hỗn hợp caroten-protein chất lượng chưa cao [6]

Năm 2011, Nguyễn Lệ Hà đã nghiên cứu tách chiết và ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ đầu tôm sú vào mục đích thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm sú

để thu nhận bột caroten-protein với hàm lượng protein (70,7%) và carotenoid cao (0,706 mg/g) [4] Bột caroten-protein giàu đạm, giàu acid amin mà còn chứa hàm lượng carotenoid, hợp chất chống oxy hóa từ thiên nhiên mang lại lợi ích về sức khỏe con người

Năm 2012, Phạm Thị Đan Phượng đã nghiên cứu phương pháp kết hợp hai enzyme protease để thuỷ phân đầu tôm thẻ chân trắng thu hồi hỗn hợp caroten-protein có chất lượng cao (Alcalase 0,2% trong 2 giờ, Flavourzyme 0,1% trong 1giờ), quy trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein bằng phương pháp kết hợp hai enzyme cho phép đạt được hiệu suất thu hồi cao là 20,5%, thời gian ngắn (chỉ mất 3 giờ), chất lượng hỗn hợp caroten-protein được nâng cao (màu đỏ cam, mùi thơm đặc trưng) có thể ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm chế biến bột mêm tôm [12] Tuy nhiên sử dụng enzyme protease thương mại thì chi phí cao hơn rất nhiều so với các phương pháp hóa học hay kết hợp phương pháp hóa học và sinh học, do vậy sẽ gặp khó khăn khi áp dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp

Do vậy chúng ta cần tiếp tục nghiên cứu các phương pháp thu nhận hỗn hợp caroten-protein nhằm tìm ra phương pháp tối ưu ứng dụng cho các mục đích trong ngành nông nghiệp hay công nghệ thực phẩm, tăng cao chất lượng sản phẩm nhưng giảm chi phí và thời gian

2 Tìm hiểu về phế liệu tôm

2.1 Phế liệu tôm

Tôm là nguồn lợi dồi dào, ngoài việc đánh bắt tự nhiên, hiện nay còn phát triển theo hướng nuôi trồng tạo điều kiện thuận lợi đảm bảo nguồn nguyên liệu cho xuất khẩu Trong đó mặt hàng tôm đông lạnh được xem là mặt hàng chiến lược và chiếm tỷ lệ lớn trong tổng các mặt hàng xuất khẩu Theo tổng cục thủy sản Việt Nam, trong năm 2014 tổng sản lượng đạt 660000 tấn bao gồm 400000 tấn tôm thẻ chân trắng và 260000 tấn tôm sú [2] Lượng phế liệu khoảng 240000 tấn/năm.Việc

giải quyết lượng phế liệu tôm cũng không kém phần quan trọng bởi vì đặc điểm của phế liệu tôm có hàm lượng protein và hàm lượng ẩm cao Vì vậy chúng rất mau bị

hư hỏng do sự hoạt động phân hủy của vi sinh vật Gây ra ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe của con người

Phế liệu tôm chủ yếu là đầu, vỏ và đuôi tôm, ngoài ra còn có các mảnh vụn tùy theo giống loài và phương pháp chế biến mà lượng phế liệu tôm thu được là khác nhau Trong thành phần phế liệu tôm, phần đầu thường chiếm khoảng 35 – 45% trọng lượng tôm nguyên liệu, phần vỏ chiếm 10 - 15%, còn lại là các phế liệu khác [23] Tuy vậy tỷ lệ này còn phụ thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng và công đoạn chế biến

2.2 Thành phần hóa học của vỏ và đầu tôm

Thành phần chiếm tỉ lệ đáng kể trong đầu, vỏ tôm là chitin, protein, canxi cacbonat, sắc tố,…và tỷ lệ giữa các thành phần này là không ổn định, chúng thay đổi theo đặc điểm sinh thái, sinh lý, loài,… Thành phần chitin và protein trong vỏ tôm tươi tương ứng là 4,5% và 8,05%; trong vỏ tôm khô là 11 – 27,5% và 23,25 – 53%

Hàm lượng chitin, protein, khoáng và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay đổi rất rộng phụ thuộc vào điều kiện bảo quản cũng như phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản Vỏ giáp xác chứa chủ yếu là protein (30 – 40%), khoáng (30 – 50%), chitin (13 – 42%)

Bảng 1.1 Thành phần hóa học chính của đầu và vỏ phế liệu tôm [24]

Phế liệu Protein* Chitin* Lipid* Tro* Canxi* Phospho*

* Tính theo hàm lượng chất khô

Trong đó:

Protein: protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hoà tan do đó khó

tách ly ra khỏi vỏ, tồn tại dưới 2 dạng:

- Dạng tự do: Dạng này tồn tại trong cơ quan nội tạng và trong các cơ gắn phần vỏ

- Dạng phức tạp: Dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin, canxi, carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo nên protein–caroten như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và nhiều hợp chất hữu cơ

khác, chúng là nguyên nhân gây khó khăn cho việc tách và tinh chế chúng

Canxi: Trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa 1 lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là

cacbonat canxi (CaCO3)

Astaxanthin: Là sắc tố chủ yếu trong đầu, vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của

caroten, thường ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh đặc trưng cho tôm Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin [4]

Lipid: Chứa một lượng đáng kể, chủ yếu gồm các acid béo chưa no bão hòa như

eicosapentaenoic (EPA), decosahexaenoic (DHA) Đây là những acid béo rất có lợi cho sức khỏe con người và có nhiều ứng dụng khác trong y học

Enzyme: Trong phế liệu tôm cũng có chứa một số loại enzyme theo tạp chí thuỷ

sản (số 5/1993) hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt động tươi Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin, được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư Một vài loại enzyme khác có mặt trong phế liệu tôm như alkaline phosphatase, -N-acetyl glucosaminse, chitinase cũng được ứng dụng nhiều trong thực tế Ngoài ra còn có một số khoáng chất như P, K, Mg, Mn và Fe (Trang Sỹ Trung và cộng sự, 2010) [18]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng [12].

Hình 1 Các liên kết hóa học có thể có của astaxanthin với các phân tử khác

trong tôm [21]

Tất cả các caroten-protein đều được tách ra thành carotenoid và apoprotein bằng aceton hoặc ethanol Crustacyanain và ovorudin là những carotenoprotein có thể được khôi phục lại dạng tự nhiên khi trộn hỗn hợp dung dịch aceton của carotenoid với dung dịch protein, pha loãng với nước tách aceton ra Các carotenoid

có liên quan đến protein thì ít bị oxi hóa hơn các carotenoid khác ở dạng tự do [18]

Phức hợp carotenoprotein hòa tan trong nước và có tính bền vững trong một vài trường hợp, màu sắc của nó bền đến vài năm trong không khí ở điều kiện nhiệt

độ phòng

Carotenoprotein là phức hợp của carotenoid và protein Tuy nhiên, đối với đối tượng lớp giáp xác thì thành phần carotenoid chủ yếu là astaxanthin Do vậy trong phạm vi nghiên cứu một khóa luận tốt nghiệp, tôi chủ yếu tập trung đề cập đến những thông tin về dạng phức hợp astaxanthin-protein

3.1 Carotenoid

Kinh tế xã hội ngày càng phát triển kéo theo nhu cầu của con người ngày càng cao hơn, một trong những nhu cầu cần thiết và cấp bách nhất là vấn đề về sức khỏe Như vậy con người tiêu dùng có nhu cầu sử dụng các sản phẩm có lợi hoặc không

ảnh hưởng đến sức khỏe Một trong những nhu cầu đó là việc sử dụng chất màu trong thực phẩm Trước kia người ta thường sử dụng chất màu hóa học để bổ sung vào thực phẩm đây một trong những mỗi nguy về sức khỏe cho người tiêu dùng Nên chất màu mang nguồn gốc từ tự nhiên như carotenoid là một biên pháp thay thế hiệu quả nhất Sắc tố sử dụng rộng rãi nhất là carotenoid màu đỏ cam được tìm thấy chủ yếu trong tôm, cua, cá hồi, cá hồng là astaxanthin [20]

Astaxanthin có vai trò quan trọng để loại trừ hoặc ngăn chặn một số bệnh: chứng xơ vữa động mạch, ung thư, thoái hóa cơ thể và các bệnh về mắt Carotenoid chiết tách từ các loài giáp xác xem như là một tiền tố vitamin A quan trọng và là nhóm chất chống oxy hóa có hoạt tính sinh học mạnh, có hiệu quả đối với người và động vật có vú [30] Có khả năng nâng cao sự miễn dịch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa, bệnh thái hóa võng mạc bệnh Alzheimer, Parkinson, các bệnh có liên quan đến

sự thừa cholesterol, một số căn bệnh ung thư Trong phế liệu của các loại giáp xác thì carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%) theo Amenta và Guerrore-

Legarreta (năm 2009) [21] Vì vậy trích ly carotenoid như trích ly astaxanthin

Astaxanthin cũng giống như các carotenoid khác tan trong lipid, có khối lượng phân tử là 596,8 Da, chủ yếu tập trung ở phần vỏ, thường tồn tại ở dạng tự

do, dạng mono- hay ester với các acid béo không no mạch dài, hoặc dưới các phức hợp carotenoprotein của đồng phân quang học Hàm lượng astaxanthin trong tôm khác nhau tùy theo loài Trong tự nhiên astaxanthin thường tồn tạo ở dạng astaxanthin liên kết với protein tạo phức chất có màu xanh đen Khi gia nhiệt hay bị oxy hóa, liên kết giữa astaxanthin và protein bị cắt đứt, giải phóng astaxanthin có màu đỏ cam

Do cấu trúc có nhiều nối đôi nên astaxanthin là một chất chống oxy hóa hiệu quả, có khả năng bảo vệ màng tế bào và các mô khỏi bị tổn thương Đặc tính chống oxy hóa thể hiện ở sự ngăn cản hình thành các gốc tự do bằng cách loại bỏ oxy tự

do, trong trường hợp gốc tự do đã hình thành thì astaxanthin có thể liên kết với các gốc tự do đó để vô hoạt chúng, nhờ đó astaxanthin bảo vệ lipid khỏi oxy hóa Các

nghiên cứu cho thấy: đặc tính chống oxy hóa của astaxanthin là cao nhất trong các

hợp chất carotenoid, gấp 10 lần so với beta-caroten (Higuera-Ciapara và cộng sự,

2006) [28] và lớn hơn gấp 100 lần so với vitamin E (Miki, 1991) [31]

Hình 1.1 Cấu tạo của astaxanthin [21]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một vài Astaxanthin [28]

Astaxanthin là một trong những thành phần quan trọng của nhiều loại dược

phẩm như: thuốc điều trị các chứng viêm ruột, viêm dạ dày do nhiễm khuẩn

Helicobacter Nó là thành phần của một số chế phẩm vitamin được tung ra thị

trường trong vài năm gần đây nhằm bổ sung cho chế độ dinh dưỡng hàng ngày cho con người

3.1.1 Tính chất vật lý của astaxanthin

Nhiệt độ nóng chảy 215-216oC, kết tinh từ piridin dạng vảy tím

Khối lượng phân tử M = 596,82

Tính tan: Astaxanthin là hợp chất ít phân cực nên kém tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp hay trung bình như pyridin, cồn, aceton, metanol, dietylete, ete dầu mỏ, dầu ăn

Đặc tính hấp thụ ánh sáng của astaxanthin có thể bị thay đổi khi astaxanthin ở trạng thái liên kết với các phân tử khác Chẳng hạn, trong tôm, cua astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành các phức caroten-protein (tức crutacyanin) có λmax = 628nm, tạo nên phân màu xanh đặc trưng của các loài thủy sản sống Dưới tác dụng nhiệt, liên kết trên bị phá hủy và giải phóng trở lại astaxanthin tự do màu đỏ cam

3.1.2 Tính chất hóa học

Do phân tử chứa chuỗi polyen với các nhóm keto, hydroxyl gắn với vòng đầu mạch, astaxanthin rất nhạy cảm vơí các tác nhân chất oxy hóa, acid và base

* Sự oxy hóa

Astaxanthin dạng tự do rất dễ bị oxy hóa bởi các tác nhân electrophyl như oxy phân

tử, oxy nguyên tử hay các gốc tự do (như gốc hydroxyl, gốc peroxid…) nhưng khi tạo phức với protein hay ở dạng ester hóa thì bền hơn Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin trong cơ thể được giải thích bởi khả năng bắt giữ các gốc tự do (ví dụ: gốc peroxid) tạo thành gốc cacbon trung tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng

* Phản ứng với acid

Astaxanthin phản ứng với các acid yếu theo một cân bằng thuận nghịch, tạo ra một phức hợp của các dạng cấu trúc (II) và (III) (Hình 1.3), gây ra sự dịch chuyển cực đại hấp thụ của nó về phía sóng dài; khi trung hòa bằng các base yếu (như dioxan) cấu trúc phân tử astaxanthin ban đầu lại được hồi phục Tuy nhiên, khi phản ứng với các acid mạnh (như HCl, H2SO4 ) có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen của astaxanthin, làm nhạt màu đỏ cam

Hình 1.3 Sự thay đổi cấu trúc phân tử astaxanthin khi tương tác với acid yếu

* Phản ứng với base: Trong môi trường kiềm, khi có mặt không khí,

astaxanthin bị oxy hóa nhanh chóng thành astacene có màu đỏ sẫm :

Hình 1.4 Astacene

* Phản ứng khử (hydrua hóa)

Khi xử lý bằng tác nhân khử NaBH4/ EtOH, các nhóm keto trong phân tử astaxanthin sẽ chuyển thành nhóm hydrroxyl, tạo thành crustaxanthin: làm chuyển dịch cực đại hấp thụ của astaxanthin khoảng 20 – 30 nm về phía sóng ngắn

Hình 1.5 Crustaxanthin

Astaxanthin là sắc tố thuộc nhóm carotenoid có màu đỏ, tím, kết tinh, điểm nóng chảy 238-240oC Astaxanthin dễ bị oxy hóa khi có mặt của oxy tạo thành astacene Astaxanthin là loại carotenoid có tính acid, có thể tác dụng với rượu tạo ra muối không ổn định Trong vỏ tôm nó tồn tại ở dạng phức hợp Protein-Astaxanthin

3.2 Ứng dụng của caroten-protein

Carotenoid và caroten-protein chịu trách nhiệm tạo nên những màu sắc khác nhau trong cơ thể động vật giáp xác Những hợp chất này thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhờ vào các tính chất quan trọng của chúng như có nguồn gốc tự nhiên, không chứa độc tố, cung cấp những sắc tố tan được cả trong nước và chất béo Một trong những ứng dụng được quan tâm lớn hiện nay của phức hợp caroten-protein là nó có thể được sử dụng làm thức ăn cho cá hồi để tạo màu sắc đẹp tươi tự nhiên cho thịt cá [30] Do cá hồi không thể tự tổng hợp astaxanthin từ nguồn bên ngoài như ở các loại vi tảo hoặc từ thức ăn có bổ sung loại sắc tố này

Mặt khác trong tình hình hiện nay, khi mà nguồn astaxanthin tổng hợp bị kiểm dịch nghiêm ngặt về tính an toàn với sức khỏe con người, nhu cầu astaxanthin tách chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên phát triển mạnh mẽ hơn bao giờ hết Bên cạnh đó, nhờ vào tính chất không gây ra các phản ứng dị ứng trong cơ thể người, dạng astaxanthin tự nhiên (ở dạng tự do và dạng phức hợp caroten-protein) hiện nay

đã được nghiên cứu trong những úng dụng mỹ phẩm và thẩm mỹ [32]

Một hướng ứng dụng khác của hỗn hợp caroten-protein, đó là dựa trên tính chất dịch chuyển bước sóng cảu bức xạ hấp thụ cực đại của phức hợp này so với phân tử sắc tố tự do, kéo theo sự thay đổi về màu sắc, mà caroten-protein có thể được sử dụng làm chất chỉ thị cảm ứng nhiệt độ, đối với các khoảng nhiệt độ gây ra

sự biến đổi màu thuận nghịch và không thuận nghịch

Cuối cùng caroten-protein còn có tiềm năng trong việc sử dụng để bổ sung vào nguồn thực phẩm cho người khi mà nhu cầu về protein thực phẩm ngày càng

tăng mạnh trên toàn cầu, đặc biệt là ở các nước chưa phát triển Caroten-protein chứa nhiều loại amino acid thiết yếu, đông thời lại kết hợp với thành phần carotenoid (chủ yếu là astaxanthin), rất có lợi cho sức khỏa con người nhờ khả năng chống oxy hóa mạnh (gấp 10 lần so với các loại carotenoid khác như zeaxanthin, lutein, canthaxanthin và mạnh hơn gấp 500 lần so với α-tocopherol) [28]

Bảng 1.3 Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid [28]

Công nghệ thực phẩm Chất mùi, chất màu, thực phẩm chức năng

Nuôi trồng thủy sản Tạo màu cho cá, tăng hệ miễn dịch, giảm

stress cho vật nuôi

Y dược Tăng hệ miễn dịch, chống lão hóa, ngăn chặn

khả năng gây ung thư, tim mạch, bệnh về mắt…

Mỹ phẩm Hạn chế và giảm nếp nhăn, chống lão hóa

Với hàm lượng cao astaxanthin trong chế phẩm người ta sử dụng để làm thức

ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản

- Trong kỹ thuật nuôi cá hồi: Màu sắc là một trong những yếu tố để đánh giá chất lượng của cá hồi Trong khi cá hồi nuôi theo phương thức truyền thống thì đáp ứng được chỉ tiêu chất lượng và yêu cầu của khách hàng vì vậy cần bổ sung astaxanthin vào thức ăn để làm tăng màu sắc cơ thịt của cá và chất lượng của cá được nâng cao [14]

- Trong nuôi cá cảnh: Thức ăn có astaxanthin sẽ góp phần tạo màu sắc cho cá Nếu cho cá ăn thích hợp thì cá sinh trưởng và phát triển tốt, màu sắc đẹp

- Trong phòng bệnh ở tôm: Theo Belinda K.Howell và Anthoy D Matthew nghiên cứu thì nguyên nhân của bệnh đốm xanh ở tôm là do thiếu carotenoid trong khẩu phần ăn Việc bổ sung carotenoid vào khẩu phần ăn là điều cần thiết [10]

4 Tổng quan về phương pháp ủ xi lô

Ủ xi lô hay còn gọi là ủ chua là phương pháp đã được người dân sử dụng lâu đời để ủ thức ăn cho gia súc và động vật Là kết quả của sự lên men trong điều kiện yếm khí nhờ hệ vi sinh vật lên men tạo ra acid lactic và một lượng acid hữu cơ

khác Quá trình ủ xi lô tạo thêm một số hợp chất thơm, vitamin, kháng sinh (Nizin, diplocaxin ), kích thích cho gia súc, động vật nuôi ăn ngon miệng, tiêu hóa tốt, mau lớn đồng thời tăng thời gian bảo quản hơn so với nguyên liệu ban đầu Ủ xi lô được

áp dụng trên nguyên liệu nông nghiệp, phế liệu cá, nội tạng bào ngư, phế liệu đầu

vỏ tôm, để làm thức ăn cho vật nuôi [6]

Việc ủ xi lô cho cá có thể thực hiện theo hai cách : Đó là ủ trực tiếp bằng việc bổ sung acid vào, hay ủ cá nhờ quá trình lên men với sự tham gia của vi khuẩn lactic trong quá trình ủ Cả hai cách này đều được sử dụng để cung cấp thêm thành phần dinh dưỡng vào trong thức ăn cho động vật nuôi [6]

Đối với phế liệu tôm phương pháp ủ xi lô cũng được ứng dụng khá phổ biến

để bảo quản và đồng thời để chế biến dịch ủ xi lô sử dụng phối trộn thức ăn gia súc Theo kết quả nghiên cứu cho thấy tôm ủ xi lô hay chính là bột tôm với hàm lượng protein xấp xỉ khoảng 40% có thể thay thế cho bột cá như là một thành phần thức ăn

bổ sung cho động vật nuôi vừa tiện lợi mà lại không làm giảm giá trị chất lượng thức ăn về mặt kinh tế

Tôm ủ xi lô là thức ăn động vật dạng lỏng, đôi khi còn gọi là protein lỏng Sự hoá lỏng của mô tôm là kết quả của việc thủy phân protein nhờ hoạt động của enzyme trong bản thân nguyên liệu, ngoài ra còn được hỗ trợ bằng cách bổ sung thêm các acid hữu cơ, vô cơ Chất lượng của dịch ủ xi lô chủ yếu phụ thuộc vào hàm lượng các acid amin quan trọng trong đó [3]

Tôm ủ xi lô là một phương pháp thu hồi protein từ phế liệu tôm phổ biến hiện nay Như vậy, khi áp dụng phương pháp này, đã tận thu phần lớn protein để làm thức ăn trong chăn nuôi từ nguồn phế liệu tôm Đồng thời bã tôm sau khi được tách riêng khỏi dịch ép, sẽ sử dụng cho việc sản xuất chitin

Có thể minh họa bằng sơ đồ quy trình đơn giản sau

Phế liệu tôm( đầu tôm)

Ủ xilô

Ép

Sản xuất chitin thức ăn chăn nuôi

Hình 1.4 Quá trình thu hồi caroten-protein bằng phương pháp ủ xi lô

* Ủ xi lô bằng acid

Việc ủ xi lô có bổ sung acid nhằm mục đích hạ thấp pH ban đầu, khống chế quá trình gây thối, do vi sinh vật gây thối, bảo quản nguyên liệu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men lactic và các enzyme nội tại hoạt động

Việc sử dụng các acid hữu cơ như acid lactic để bảo quản phế liệu từ nguyên liệu tươi đã được dùng trong thực phẩm bắt đầu từ sau chiến tranh thế giới thứ II Với những lợi ích của acid lactic như trên thì ngoài ra khi sử dụng acid hữư cơ này trong quá trình ủ xi lô không tạo ra thành phần acid thừa trong dịch ủ, và do vậy không cần phải trung hòa bằng một bazơ trước khi sử dụng Nhìn chung giá thành của acid hữu cơ này tương đối cao nên người ta đã kết hợp thêm các thành phần acid vô cơ khác để có thể giảm bớt giá thành sử dụng Vì vậy, khi ủ xi lô cho phế liệu tôm, có thể sử dụng hỗn hợp acid hữu cơ và vô cơ như acid formic, acid chlohydric, và/hoặc acid sunfuric, acid propyonic và hydrochloric và/hoặc acid sunfuric với các nồng độ khác nhau [3]

Việc kết hợp bổ sung acid ở nồng độ thấp trong quá trình ủ xi lô có những tác dụng đáng kể sau:

+ Có tác dụng thủy phân protein trong phế liệu tôm do hoạt động của enzyme protease trong bản thân nguyên liệu, hạ pH thúc đẩy lên mem lactic nhờ quá trình ủ

có bổ sung rỉ đường

+ Ức chế hoạt động, sự phát triển của vi sinh vật gây thối, nấm mốc, bảo quản cho đầu tôm không bị hư hỏng, đảm bảo chất lượng chitin sau này

+ Với acid hữu cơ có tác dụng kháng khuẩn, decalxi hóa, tách khoáng ra khỏi vỏ tôm tạo điều kiện thuận lợi khi sản xuất chitin

+ Mặt khác còn tạo thành dịch protein lỏng có giá trị về mặt dinh dưỡng khi thu hồi tận dụng làm thức ăn cho gia súc động vật nuôi, có tác dụng ngăn chặn sự oxy hóa astaxanthin, ổn định hàm lượng này để có thể tận thu dịch

Việc sử dụng acid vô cơ trong quá trình ủ được khuyến cáo hạn chế do acid

vô cơ có tác dụng không tốt đến chất lượng chitin, môi trường và chất lượng dịch ủ (nếu sử dụng phải trung hòa dịch ủ) Acid hữu cơ có tính chất ưu việt hơn nó khắc phục được những nhược điểm của acid vô cơ, tuy nhiên giá thành cao hơn rất nhiều [6] Do vậy để thu được các hợp chất có chất lượng cao đồng thời hiệu quả về kinh

tế thì ta nên kết hợp giữa acid hữu cơ với acid vô cơ với nhau để thu được kết quả tối ưu

5 Phương pháp thu hồi hỗn hợp caroten-protein

Khi hòa tan, protein tạo thành dung dịch keo.Trên bề mặt phân tử protein có các nhóm phân cực khi hòa tan vào nước, các phân tử nước lưỡng cực được hấp thụ bởi các nhóm này tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrat Độ bền của dung dịch keo protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ: sự tích điện của phân tử protein, mức độ hydrat hóa, nhiệt độ Khi thay đổi các yếu tố này như làm trung hòa về điện phân tử protein, loại bỏ lớp vỏ hydrat các phân tử protein

H2N – CH – CO – NH – CH

enzym

H2O Polypeptid

sẽ kết tụ lại với nhau tạo thành khối lớn tách khỏi dung dịch, thường gọi là kết tủa protein [19]

Phương pháp thu hồi bằng pH đẳng điện (pI)

Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein (pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện, điện tích của protein bằng không, tương tác tĩnh điện giữa các phân tử protein và các phân tử nước bị giảm Các phân tử protein tập hợp lại với nhau do lớp vỏ hydrat bên ngoài bị phá

vỡ Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein Do không có sự thay đổi cấu trúc phân tử nên sau khi loại bỏ tác nhân gây kết tủa ra khỏi dung dịch thì các phân

tử protein có thể hòa tan trở lại (Trang sĩ Trung, 2008) [15] Cơ chế kết tủa bằng pH đẳng điện có thể mang tính thuận nghịch nên áp dụng để tách hợp chất protein có hoạt tính sinh học ra khỏi hỗn hợp mà vẫn đảm bảo giữ được hoạt tính và cấu trúc phân tử Tuy nhiên thời gian tủa thường xảy ra rất lâu, hiệu suất thu hồi lại thấp và chi phí cao nên hiệu quả kinh tế không cao

Phương pháp thu hồi bằng xử lý nhiệt

Với phương pháp thu hồi protein bằng xử lý nhiệt thì với nhiệt độ cao sẽ loại

bỏ được lớp vỏ hydrat của protein, làm giảm khả năng hấp thụ của nước Các phân

tử protein kết tụ lại với nhau thành khối Do mỗi loại protein khác nhau thì có độ biến tính khác nhau vì vậy độ biến tính của protein tỷ lệ thuận vào cường độ và thời gian khác nhau Đa số protein biến tính ở nhiệt độ 45 – 500C.Protein khi được gia nhiệt ở điểm đẳng điện sẽ cho kết tủa nhanh hơn

Kết tủa protein bằng nhiệt có rất nhiều ưu điểm trong việc tách protein từ dung dịch mà khi chúng ta ít quan tâm đến hoạt tính hay cấu trúc của nó Phương pháp kết tủa này xảy ra nhanh, triệt để, ít gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, chi phí năng lượng cho quá trình gia nhiệt quá lớn khi thực hiện ở quy mô công nghiệp

Phương pháp thu hồi bằng polyme (chitosan)

Tính chất đặc trưng mang điện tích dương nên chitosan có thể tương tác với phần lớn các chất hữu cơ mang điện tích âm Chitosan thể hiện là một chất keo tụ, tạo bông tốt, có hiệu quả trong việc thu hồi các chất hữu cơ trong nước, đặc biệt là protein Phân tử chitosan cũng có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng Ngoài ra, chitosan có độ deacetyl cao thì trong dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dương sẽ trung hòa điện tích của các phân tử protein tích điện âm trong dung dịch nước rửa, giảm khả năng hydrat hóa, tập hợp lại và kết tụ (Trang Sĩ Trung và cộng

sự, 2010) [18] Nồng độ chitosan cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi, cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp lý vì khi tăng nồng độ chitosan làm tăng số điện tích cùng dấu và đẩy nhau tạo nên một mạng lưới keo cản trở quá trình keo tụ lắng xuống của các phân tử protein Chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì các nhóm tích điện dương trên mạch chitosan càng nhiều, thuận lợi trong tương tác ion để thu hồi protein hòa tan

Ưu điểm của phương pháp này là không gây biến tính protein, không độc hại

và hiệu quả thu nhận cao Do đó phương pháp này áp dụng để tận thu các chế phẩm enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác

6 Các tác nhân acid thủy phân hỗn hợp caroten-protein

6.1 Tìm hiểu về một số tác nhân bằng acid [7]

Cơ chế của phương pháp thủy phân protein là đồng hóa chất để thủy phân protein trong nguyên liệu thành acid amin Có thể dùng acid hoặc kiềm để thủy phân, thông thường người ta dùng acid HCl công nghiệp để thủy phân Dùng acid HCl để thủy phân có ưu điểm hơn dùng các hóa chất vô cơ khác vì dịch thủy phân cho màu đẹp NH3 ít và sự tổn thất acid amin cũng ít

Ở cùng điều kiện pH, nhiệt độ thì dùng H2SO4 thủy phân thì nhanh hơn HCl, giá thành cũng không đắt hơn nhiều nhưng màu sắc của dịch thủy phân xấu, có nhiều NH3 và mất đi một số acid amin như tryptophan vì H2SO4 có tính chất oxi hóa

Trang Sỹ Trung và cộng sự (2009) dùng acid formic để khử protein nâng cao hiệu quả trong quy trình sản xuất chitin cho thấy chất lượng chitin được nâng cao nhưng thời gian kéo dài [17]

Ngoài ra còn có thể dùng các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic và acid propionic để thủy phân protein trong phế liệu tôm cũng đạt hiệu quả cao nhưng chi phí sử dụng cao hơn rất nhiều so với dùng acid vô cơ

6.2 Kết hợp hai acid trong quá trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein giàu carotenoid

Quá trình thủy phân protein có thể được tiến hành bằng cách sử dụng acid vô

cơ, acid hữu cơ hoặc kết hợp hai loại acid vô cơ và hữu cơ Khi thủy phân bằng acid

vô cơ thì có thể khử được một lượng khoáng và protein đáng kể ra khỏi đầu tôm nhưng với nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng chitin-chitosan đồng thời khó thu hồi hàm lượng protein vì protein bị cắt mạch Khi sử dụng acid hữu cơ có ưu điểm hơn so với acid vô cơ, đó là ít ảnh hưởng đến tính chất, chất lượng chitosan, ít ảnh hưởng và tác động xấu đến môi trường Mặc khác, các sản phẩm trung gian của quá trình nếu thu hồi sử dụng không phải trung hòa và không ảnh hưởng đến sức khỏe con người hay vật nuôi nhưng chi phí cao hơn rất nhiều [6]

Để nâng cao chất lượng sản phẩm thủy phân, giảm chi phí cho quá trình sản xuất Nhiều công trình nghiên cứu đã kết hợp hai acid trong quá trình chiết rút, thu hồi sản phẩm thủy phân nhằm tăng hiệu quả thủy phân và nâng cao chất lượng của sản phẩm thủy phân Thông thường người ta dùng acid HCl kết hợp với acid lactic, formic hoặc acetic

Những nghiên cứu trước đây đã thu nhận hỗn hợp caroten-protein theo phương pháp ủ xilô bằng acid hữu cơ hoặc acid vô cơ hay kết hợp cả hai loại aicd

mà chưa có công đoạn tiền xử lý bằng acid trước khi ủ Trong đề tài sẽ tiến hành xử

lý bằng acid HCl rồi ủ có tác dụng khử khoáng làm mềm liên kết giữu chitin và protein, rút ngắn được thời gian ủ, đồng thời tạo điều kiện cho acid lactic hoạt động

tốt hơn, duy trì pH thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển, ức chế vi sinh vật gây thối hoạt động và hạn chế sự hư hỏng astaxanthin trong hỗn hợp caroten-protein [6]

Vì vậy việc áp dụng kết hợp hai loại acid trong việc thủy phân protein đã góp phần nâng cao chất lượng chitin, chitosan và protein Sản phẩm protein thu được có thể sử dụng làm thức ăn gia súc hoặc thực phẩm cho người Việc sử dụng kết hợp hai loại acid thủy phân protein cho phép nâng cao chất lượng protein, chitin thu được từ phế liệu tôm, tận thu được protein và carotenoid, đây là các sản phẩm rất

có giá trị, có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc hoặc sản xuất các chất mùi, chất dẫn dụ Ngoài ra, việc tận thu bột đạm giàu carotenoid còn giảm thiểu chi phí xử

lý môi trường Đây là một hướng đi theo phương pháp sản xuất sạch hơn

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được lấy tại phân xưởng chế biến

Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17) và F90 Chất lượng đầu tôm tươi, không bị biến đổi màu sắc như đen đầu hay đỏ đầu, không bẩn nhiễm rác và tạp chất, được lưu giữ lạnh bằng thùng xốp cách nhiệt (<50C) với đá khô khi đưa về phòng thí nghiệm Phế liệu tôm trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo Trong trường hợp chưa thí nghiệm ngay thì bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt

Acid hydrochloric (HCl)

Acid clohydric (hay acid muriatic) có công thức phân tử là HCl; có phân tử gam là 36,46 gam/mol; là một axít vô cơ mạnh, do sự hòa tan của khí hiđrô clorua (HCl) trong nước

Trong số sáu acid vô cơ mạnh phổ biến, người ta thường sử dụng HCl để khử khoáng và protein vì HCl cho dịch ủ có màu sắc đẹp chất lượng chitin cao hơn Đồng thời khi sử dụng acid HCl ở giai đoạn đầu sẽ làm giảm pH của mẫu tạo điều kiện cho quá trình lên men lactic

được thực hiện bởi vi khuẩn Lactobacillu Trong y học, Lactate thường được sử

dụng cho các chất lỏng hồi sức sau khi mất máu do chấn thương, phẫu thuật, hoặc một chấn thương đốt

2 Phương pháp thực nghiệm

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát:

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Thuyết minh quy trình

Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng sau khi rửa và loại bỏ tạp chất, các phần

hư hỏng và xay nhỏ đến kích thước từ 2-3mm

Hỗn hợp caroten-protein được tách chiết ra khỏi đầu tôm bằng phương pháp ủ

xi lô kết hợp với hai acid: acid HCl và acid lactic Trong nghiên cứu này đầu tôm

Đầu tôm

Ủ xi lô bằng acid lactic (nồng độ acid và thời gian ủ)

Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein

và hàm lượng carotenoid trong hỗn hợp

Sản xuất chitin-chitosan

được ủ theo trình tự với acid HCl trước và acid lactic sau để tăng hiệu quả thủy phân Vì acid HCl là acid mạnh dùng để xử khoáng và một phần protein và acid lactic là một acid yếu được kết hợp để thủy phân đầu tôm để tách hỗn hợp caroten-protein Sau khi thủy phân bằng acid HCl thì bổ sung acid lactic vào

Sau khi thủy phân tiến hành ép để tách riêng phần dịch và phần bã Phần bã được rửa bằng nước, nước rửa được thu hồi cùng với phần dịch Phần bã được đưa sang công đoạn sản xuất chitin, chitosan còn phần dịch được tiếp tục thu hồi hỗn hợp caroten-protein Các yếu tố như nồng độ acid, thời gian xử lý của từng loại acid được xác định thông qua hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein và hàm lượng carotenoid Quá trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein được thực hiện bằng phương pháp kết tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện và xử lý nhiệt, ngoài ra trong quá trình này có sử dụng chitosan đóng vai trò là chất tạo tủa và keo tụ để tăng hiệu quả quá trình kết tủa protein dựa theo nghiên cứu của Trang Sĩ Trung (2008) [15] Cụ thể: dịch thủy phân chứa caroten-protein được điều chỉnh pH về pH 4,3-4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein, bổ sung chitosan ở nồng độ 100 ppm và nâng nhiệt lên 70oC trong 10 phút Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong

15 phút với tốc độ 3500 vòng Thu hồi hỗn hợp caroten-protein và đánh giá hiệu suất thu hồi, hàm lượng carotenoid của hỗn hợp

Các bố trí thí nghiệm chi tiết được trình bày ở phần sau:

2.1 Xác định điều kiện thủy phân thích hơp của acid HCl trong công đoạn đầu của quá trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein có hàm lượng carotenoid cao

Thu hồi hỗn hợp caroten- protein

Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein,

hàm lượng carotenoid trong hỗn hợp

Tiến hành thí nghiệm:

Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, để ráo Cân mỗi mẫu thí nghiệm 100g đầu tôm cho vào cốc 250ml Cho thêm một ít nước vào và nghiền nhỏ mẫu đến kích thước khoảng 2-3mm, sau đó tiếp tục bổ sung nước vào đảm bảo

tỷ lệ nguyên liệu và nước là 1:1 và trộn thật đều

Tiến hành thủy phân đầu tôm để thu hồi hỗn hợp acid HCl và acid lactic: Để xác định nồng độ acid HCl thích hợp, đầu tiên mẫu được thủy phân bằng acid HCl với các nồng độ khác nhau từ 0%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% Các mẫu được ủ

ở nhiệt độ phòng sau 1giờ sau đó tiếp tục thủy phân mẫu bằng acid lactic 0,4% và ủ

ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ (cố định nồng độ acid lactic là 0,4%, thời gian ủ là 2 giờ) Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành ép để tách riêng phần dịch và phần bã Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; và bổ sung chitosan 100ppm và nâng nhiệt lên 70oC trong

10 phút), sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng carotenoid có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra nồng độ acid HCl thích hợp

Kết quả thăm dò: Chọn được nồng độ acid HCl thích hợp trong phương

pháp kết hợp thủy phân hai acid để thu hồi hỗn hợp caroten-protein có hiệu suất thu hồi và hàm lượng carotenoid cao nhất

2.1.2 Xác định thời gian xử lý bằng acid HCl thích hợp

Tiến hành thí nghiệm:

Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, để ráo Cân mỗi mẫu thí nghiệm 100g đầu tôm cho vào cốc 250ml Cho thêm một ít nước vào và nghiền nhỏ mẫu đến kích thước khoảng 2-3mm, sau đó tiếp tục bổ sung nước vào đảm bảo

tỷ lệ nguyên liệu và nước là 1:1 và trộn thật đều