Nghiên cứu thu hồi hỗn hợp caroten protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp kết hợp HCl và flavourzyme

Gần đây, các nhà nghiên cứu thường sử dụng các phương pháp sinh học vi sinh vật và enzyme sử dụng protease hay lên men để thủy phân protein trong quy trình sản xuất chitin để tách protei

o0o

LÊ THỊ XUÂN THI

NGHIÊN CỨU THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN

TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KẾT HỢP HCL VÀ FLAVOURZYME

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Nha Trang, tháng 07 năm 2015

o0o

LÊ THỊ XUÂN THI

NGHIÊN CỨU THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN

TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KẾT HỢP HCL VÀ FLAVOURZYME

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: ThS PHẠM THỊ ĐAN PHƯỢNG

Nha Trang, tháng 07 năm 2015

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới giáo viên hướng dẫn của mình,

cô Ths Phạm Thị Đan Phượng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành bài báo cáo này

Em xin cảm ơn PGS TS.Trang Sĩ Trung đã tạo điều kiện cho em được tham gia Đề tài: Nghiên cứu sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu tôm để ứng dụng trong nông nghiệp do Bộ Khoa học và Công nghệ cấp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy Ths Nguyễn Công Minh và

cô Ths Nguyễn Thị Như Thường đã luôn theo sát và trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn tận tình cho em trong suốt thời gian làm báo cáo

Bên cạnh đó, em cũng chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ quản lý Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Chế biến, Phòng thí nghiệm Công nghệ và thiết bị cao đã tạo điều kiện, hỗ trợ cho em thực tập tại phòng thí nghiệm

Qua đây em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên về tình thần giúp em hoàn thành bài tốt nghiệp này

Một lần nữa em xin cảm ơn!

Nha Trang, ngày ….tháng….năm……

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Xuân Thi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Các nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài 4

1.2 Các nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài 5

1.3 Tìm hiểu về caroten-protein 6

1.3.1 Phức hợp carotenoprotein trong sinh vật biển 6

1.3.2 Carotenoid từ sinh vật biển 7

1.3.3 Hoạt tính sinh học của astaxanthin 9

1.3.4 Ứng dụng của caroten-protein 10

1.4 Thu nhận hỗn hợp caroten-protein trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu đầu tôm 11

1.4.1 Phế liệu đầu tôm 11

1.4.2 Các quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm 14

1.5 Phương pháp ủ xilô thủy phân protein 15

1.5.1 Các tác nhân thủy phân protein 15

1.5.2 Các quá trình ủ xilô thủy phân protein 18

1.6 Phương pháp thu hồi hỗn hợp C-P 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Đối tượng 23

2.1.1 Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) 23

2.1.2 Acid Clohydric 24

2.1.3 Enzyme Flavourzyme 24

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 25

2.2.2 Xác định nồng độ HCl 27

2.2.3 Xác định thời gian xử lý HCl 29

2.2.4 Xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm 31

2.2.5 Xác định thời gian xử lý enzyme 33

2.3 Các phương pháp phân tích sử dụng chính 35

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng 36

3.2 Điều kiện xử lý đầu tôm thích hợp bằng phương pháp kết hợp HCl và Flavourzyme để thu nhận hỗn hợp C-P 37

3.2.1 Điều kiện thủy phân thích hợp của HCl trong công đoạn đầu của quá trình thu nhận hỗn hợp C-P 37

3.2.2 Điều kiện thủy phân thích hợp của Flavourzyme trong công đoạn sau của quá trình thu nhận hỗn hợp C-P 41

3.3 Đề xuất quy trình thu nhận hỗn hợp C-P bằng phương pháp kết hợp HCl và Flavourzyme 45

3.4 Kết quả phân tích chất lượng sản phẩm 47

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng astaxanthin từ các nguồn phế liệu sinh học các loài giáp xác 9Bảng 1.2 Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid 11Bảng 1.3 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm hùm 12

Bảng 1.4 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaaus vannamei 13

Bảng 2.1 Điều kiện hoạt động thích hợp của một số protease thương mại thông dụng 17Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng 36Bảng 3.2 Thành phần hóa học của hỗn hợp C-P 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các liên kết hóa học của astaxanthin trong đầu tôm 6

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của astaxanthin 7

Hình 1.3 Một số cấu trúc dạng đồng phân của astaxanthin 8

Hình 1.4 Quy trình chiết rút hỗn hợp C-P từ phế liệu tôm sử dụng Alcalase 14

Hình 1.5 Quy trình chiết rút bột ĐGC từ phế liệu tôm sử dụng trypsin 15

Hình 1.6 Quá trình thu hồi caroten-protein bằng phương pháp ủ xi lô 18

Hình 2.1 Nguyên liệu đầu tôm 23

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ HCl 28

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý HCl 30

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm 32

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý Flavourzyme 34

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ HCl sử dụng đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp C-P 38

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý HCl đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp C-P 40

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm sử dụng đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp C-P 42

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý Flavourzyme đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp C-P 44

Hình 3.5 Sơ đồ quy trình thu nhận hỗn hợp C-P bằng phương pháp kết hợp HCl và Flavourzyme 46

Hình 3.6 Hỗn hợp C-P nhão sản xuất theo quy trình đề xuất (bên trái) và mẫu đối chứng (bên phải) 48

LỜI MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Ngành chế biến thủy sản xuất khẩu được đánh giá là ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước, hàng năm sản lượng khai thác và chế biến là rất lớn Tuy nhiên, lượng chất thải rắn từ thủy sản thải ra môi trường cũng là một con số đáng kể, đây cũng là nguyên nhân hàng đầu gây ô nhiễm môi trường Nếu chúng ta giải quyết tốt vấn đề này sẽ làm gia tăng giá trị sử dụng của nguyên liệu, góp phần tạo ra giá trị kinh tế cho doanh nghiệp, đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường là điều cần thiết

Ước tính phế liệu tôm khoảng hơn 200.000 tấn/năm, trong đó có khoảng 120.000 tấn đầu tôm Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào cho sản xuất chitin, caroten-protein với tỷ lệ 50% protein và một lượng nhỏ carotenoid, tuy nhỏ nhưng

có hoạt tính sinh học cao cần được thu hồi ở dạng hỗn hợp caroten-protein(C-P)[9] Hỗn hợp này sẽ có ý nghĩa để bổ sung vào làm thức ăn gia súc, nuôi trồng thủy sản, làm tăng màu sắc cho cá hồi, các loài giáp xác, tăng hệ miễn dịch cho vật nuôi Gần đây, các nhà nghiên cứu thường sử dụng các phương pháp sinh học (vi sinh vật và enzyme) sử dụng protease hay lên men để thủy phân protein trong quy trình sản xuất chitin để tách protein ra khỏi thành phần chitin trong phế liệu, thay thế cho các chất hóa học Tuy nhiên, sử dụng phương pháp sinh học sẽ tốn kém chi phí và hiệu suất thu hồi hỗn hợp C-P có hàm lượng carotenoid không cao.Từ những nghiên cứu trước cho thấy nếu chỉ sử dụng một enzyme protease thì thời gian thủy phân protein kéo dài nên sản phẩm thủy phân có mùi ít thơm và màusậm; đồng thời hiệu suất thu hồi sản phẩm thủy phân có sự khác biệt rõ ràng, ví dụnhư: khả năng thủy phân của enzyme Alcalase sẽ cho hiệu suất thu hồi cao nhưng sản phẩm thủy phân có vị đắng, còn enzyme Flavourzyme cho hiệu suất thu hồi thấp nhưng sản phẩm thủy phân có vị ngọt Chính vì thế, nghiên cứu phương pháp kết hợp acid HCl

và Flavourzyme trong việc thu hồi hỗn hợp C-P giàu carotenoid là một hướng đi

mới để khắc phục những nhược điểm trên, nếu đề tài này thành công sẽ đánh dấu bước đi quan trọng trong công tác nghiên cứu về tận thu hỗn hợp C-P: tìm ra phương pháp tách chiết mới (kết hợp acid vô cơ và enzyme) thu hồi hỗn hợp C-Pgiàu carotenoid đạt hiệu quả cao, chất lượng sản phẩm tốt, tiết kiệm chi phí Có thể áp dụng công nghệ sản xuất hỗn hợp C-P vào trong công nghiệp để sản xuất thức ăn cho cá cảnh và cá hồi

Nhận thấy được tính cấp thiết của vấn đề, đồng thời giúp sinh viên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Tôi đã được Khoa Công nghệ thực phẩm giao cho đề tài: “Nghiên cứu thu hồihỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp kết hợp acid hydrochloric và Flavourzyme” để làm đề tài tốt nghiệpdưới sự hướng dẫn tận tình của ThS Phạm Thị Đan Phượng

Tên đề tài: Nghiên cứu thu hồi hỗn hợp C-P từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng

phương pháp kết hợp acid hydrochloric và Flavourzyme

Nội dung:

- Xác định thành phần hóa học của đầu tôm

- Nghiên cứu điều kiện thủy phân bằng acid HClở công đoạn đầu

- Nghiên cứu điều kiện thủy phân bằng enzyme Flavourzyme ở công đoạn sau

- Đề xuất qui trình thu nhận hỗn hợp C-P bằng phương pháp xử lý kết hợp HCl

và Flavourzyme từ đầu tôm thẻ chân trắng

- Đánh giá chất lượng sản phẩm thu hồi từ quy trình đề xuất

Mục tiêu:

Xây dựng quy trình xử lý đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp kết hợp HCl và Flavourzyme để thu nhận hỗn hợp C-Pcó hàm lượng carotenoidcao ứng dụng làm thức ăn cho cá cảnh và cá hồi, giúp tạo màu cho cơ thịt cá và ngăn ngừa bệnh tật, giảm stress, tăng hệ miễn dịch của vật nuôi

Phạm vi nghiên cứu:

Phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (Paneus vannamei) thu nhận tại các nhà máy

chế biến thủy sản tại Khánh Hòa Acid vô cơ sử dụng trong đề tài là HCl và enzyme

sử dụng là enzyme thương mại Flavourzyme

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Các nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài

Phế liệu từ tôm hiện nay rất được các nhà khoa học chú trọng, chúng được dùng để sản xuất chitin-chitosan, chiết rút các chất màu, chất mùi phục vụ cho ngành công nghệ phẩm, đặc biệt trong thời gian gần đây để tận dụng được protein trong quá trình sản xuất chitin-chitosan thì cũng đã có nhiều nghiên cứu thu hồi hỗn hợp C-P vừa giảm thiểu được ô nhiễm môi trường, vừa mang lại hiệu quả kinh tế Hỗn hợp caroten-protein có thể được bổ sung vào thức ăn thủy sản nhằm làm tăng màu sắc cho cá hồi, các loài giáp xác nhờ hàm lượng astaxanthin, đồng thời tăng hệ miễn dịch cho vật nuôi

Astaxanthin được Hoàng Thị Huệ An (2004) nghiên cứu chiết xuất từ phế liệu

vỏ tôm bằng dung môi [1].Năm 2004, Vũ Ngọc Bội và cộng sự đã nghiên cứu tiến hành sử dụng protease từ đầu tôm sú để cải thiện khả năng tách chất mùi từ phế liệu tôm, ghẹ trước khi xử lý bằng các loại dung môi khác nhau [2].Các nghiên cứu này chỉ tập trung vào thu hồi một sản phẩm chính là chitin, hoặc astaxanthin, hoặc chất mùi từ phế liệu tôm hoặc có thu hồi protein chứa astaxanthin chứ chưa có nghiên cứu nào tiến hành thu nhận sản phẩm hỗn hợp C-P như là một sản phẩm chính, chất lượng cao và hiệu quả

Nhận thấy được điều đó thì các nhà khoa học trong những năm gần đây cũng

đã chú trọng hơn về việc thu hồi hỗn hợp C-P trong quá trình sản xuất chitosan để bổ sung vào thức ăn của động vật thủy sản, nhằm tận thu được chất thải

chitin-và góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm dành cho thủy sản nhờ hàm lượng cao protein và astaxanthin Trang Sĩ Trung và Trần Thị Luyến (2010) cũng đã có nhiều nghiên cứu về sử dụng enzyme protese như papain, Flavourzyme, Alcalase để khử protein Sản phẩm tạo ra mùi ít thơm, màu sậm, thời gian thủy phân dài [13] Theo nghiên cứu của Phạm thị Đan Phượng và cộng sự (2012) sử dụng kết hợp 2 enzyme

là Flavourzyme và Alcalase để thu nhận carotein-protein và chế biến chế phẩm bột nêm[9] Phương pháp này cho sản phẩm có chất lượng tốt, thời gian rút ngắn hơn so

với phương pháp sử dụng 1 enzyme protease nhưng chi phí cao Ngô Thanh Lĩnh (2009) cũng đã nghiên cứu sử dụng acid hữu cơ ở nồng độ thấp trong quy trình sản xuất chitin-chitosan để khử protein, khoáng nhưng đồng thời tận thu được dịch ủ [5] Phương pháp này thì tiết kiệm được chi phí và giảm thiểu ô nhiễm môi trường (do hạn chế sử dụng hóa chất) nhưng tốn nhiều thời gian (ủ trong 3ngày) Vì vậy, việc nghiên cứu thu nhận hỗn hợp C-P giàu carotenoid bằngphương pháp xử lý kết hợp HCl và Flavourzyme trong công nghệsản xuất chitin-chitosan từ đầu tôm là hướng đi mới, tạo thêm sản phẩm giá trị gia tăng bên cạnh sản phẩm chitin, chitosan, nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn phế liệu tôm dồi dào của Việt Nam

1.2 Các nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài

Trên thế giới, việc tận dụng các phế liệu thủy sản ở các nước có nền công nghiệp chế biến thủy sản phát triển để sản xuất ra các sản phẩm gia tăng có chất lượng được các nhà nghiên cứu hết sức chú trọng và quan tâm Đối với phế liệu tômphần lớn các nghiên cứu tập trung thu nhận chitin và chitosan [30] Bên cạnh

đó, việc thu nhận hỗn hợp C-P cũng được quan tâm nghiên cứu, carotenoid đặc biệt

là astaxanthin từ phế liệu tôm được chú trọng nhiều Với những hiệu quả mà astaxanthin mang lại thì nó rất phổ biến trong việc bổ sung làm thức ăn cho thủy sản

để tăng màu sắc cho cá cảnh, cá hồi và giáp xác, tăng hệ miễn dịch của vật nuôi Các nghiên cứu cũng cho thấy astaxanthin đóng vai trò quan trọng trong sinh sản và phát triển của cá hồi Carotenoid còn có tính chất chống oxy hóa [26] Sử dụng thức

ăn có chứa carotenoid thường xuyên có khả năng bảo vệ tế bào và ngăn ngừa được nhiều loại bệnh trong đó có cả bệnh ung thư và bệnh tim mạch [38] Carotenoid

cũng có thể chống lại Hecolybacter pylori gây bệnh viêm loét dạ dày [26] Vì vậy

thu hồi hỗn hợp C-P sao cho có hiệu quả là đều cần quan tâm

1.3 Tìm hiểu về caroten-protein

1.3.1 Phức hợp carotenoprotein trong sinh vật biển

Cấu trúc của phức hợp carotenoprotein hầu như được hình thành từ các xoắn ngẫu nhiên (random coil) và có dạng cấu hình phiến β Một minh chứng rõ rệt là trong thành phần carotenoprotein, hàm lượng amino acid leucine (giúp làm bền kiểu cấu hình xoắn α) rất thấp nhưng hàm lượng các loại amino acid khác như proline, serine, glycine và asparagine (làm phá vỡ cấu trúc xoắn α) tương đối cao Điển hình như trong phức hợp crustacyanin, tỉ lệ cấu trúc xoắn α chỉ chiếm khoảng 6% [17] Bên cạnh đó, trong thành phần phức hợp carotenoprotein, các amino acid thường thấy trong dạng cấu hình β như isoleucine, valine, threonine và glutamine hiện diện với tỉ lệ không nhỏ, đồng thời một số lượng lớn các “cấu trúc quay ngược” β (β-bends) cũng được tìm thấy (cấu trúc này hỗ trợ sự hình thành của dạng cấu hình phiến β đối song song)

Hình 1.1 Các liên kết hóa học của astaxanthin trong đầu tôm [21]

Phức hợp carotenoprotein hòa tan trong nước và có tính bền vững, trong một vài trường hợp, màu sắc của nó bền đến vài năm trong không khí ở điều kiện nhiệt

độ phòng Ngoài ra, sự tương tác giữa protein và astaxanthin dẫn đến sự thay đổi lớn về bước sóng của bức xạ hấp thụ cực đại (spectral shift), từ đó dẫn đến sự thay

đổi về màu sắc của nó Chẳng hạn, trong cơ thể động vật giáp xác, astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α-crustacyanin, hấp thụ cực đại bức xạ ở bước sóng 628 nm, tạo nên màu xanh đen đặc trưng thường thấy ở các loài thủy sản sống Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá hủy và giải phóng astaxanthin tự do (có bước sóng hấp thụ cực đại chỉ là 480 nm) màu đỏ cam

Sự thay đổi bước sóng của bức xạ hấp thụ cực đại của astaxanthin trong phức hợp carotenoprotein so với dạng phân tử tự do phụ thuộc vào sự liên kết của nó với thành phần apoprotein, về vị trí không gian, và chính bản chất cấu trúc của astaxanthin

1.3.2 Carotenoid từ sinh vật biển

Carotenoid là nhóm sắc tố phổ biến nhất được tìm thấy trong tự nhiên Có hơn 600 loại carotenoid khác nhau được tìm thấy ở động vật và thực vật Ở thực vật, carotenoid chịu trách nhiệm bảo vệ khỏi bức xạ, thu nhận ánh sáng, tách khí oxy kích thích (singlet oxygen) trong quá trình quang hợp Sắc tố này thường được tìm thấy ở lục lạp của thực vật và các sinh vật quang hợp khác chẳng hạn như tảo và vài loại vi khuẩn Trái lại, động vật không thể tự tạo carotenoid cho chính mình Do đó, chúng phụ thuộc vào thực vật để có các sắc tố này

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của astaxanthin [22]

Carotenoid có nguồn gốc từ sinh vật biển được sử dụng rộng rãi như là một chất màu tự nhiên an toàn cho các ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Carotenoid có vai trò quan trọng để loại trừ hoặc ngăn chặn một số bệnh thoái hóa cơ thể như chứng xơ vữa động mạch, ung thư, thoái hóa cơ thể và các bệnh về mắt [27]

Carotenoid chiết tách từ các loài giáp xác có chức năng hình thành sắc tố được xem như là một nguồn tiền tố vitamine A quan trọng và là nhóm chất chống oxy hóa [29] Carotenoid được xem là chất kích thích hệ thống miễn dịch, kích thích tăng khả năng sinh trưởng và phát triển [32,39]

Trong phế liệu tôm, carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%) [21] Astaxanthin là một carotenoid, thuộc nhóm chất phytochemical tecpen, là chất sắc tố màu vàng đỏ Giống như nhiều carotenoid, nó là một chất màu hòa tan trong

mỡ hoặc dầu Astaxanthin có thể được tìm thấy trong vi tảo, men bia, cá hồi, cá, loài nhuyễn thể, tôm, tôm càng, động vật giáp xác, và những chiếc lông của một số loài chim

Hình 1.3 Một số cấu trúc dạng đồng phân của astaxanthin [26]

Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu tập trung ở phần vỏ ngoài (chiếm 58 – 87% tổng hàm lượng carotenoid) Astaxanthin thường tồn tại ở dạng tự do, dạng mono- hay di-ester với các acid béo không no mạch dài, hoặc dưới dạng phức hợp carotenoprotein của đồng phân quang học (3S, 3’S) Hàm lượng astaxanthin trong vỏ tôm, cua thay đổi đáng kể theo tùy loài (từ 10-140 mg/kg trọng

lượng ướt hay là khoảng 50-700 mg/kg trọng lượng khô), chứng tỏ ở vỏ các loài giáp xác chứa một nguồn astaxanthin tự nhiên đáng kể [6]

Bảng 1.1 Hàm lượng astaxanthin từ các nguồn phế liệu sinh học các loài

Astaxanthin là chất chống oxy hóa rất hiệu quả, có khả năng bảo vệ phospholipid của màng tế bào khỏi sự peroxid hóa, hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin lớn hơn gấp 10 lần các carotenoid khác như zeaxanhin, lutein, canthaxanthin và β-caroten Astaxanthin cũng có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch [26]

1.3.3 Hoạt tính sinh học của astaxanthin

Chất màu mang nguồn gốc tự nhiên như carotenoid ngày càng được ứng dụng nhiều trong ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm để thay thế các chất màu hóa học có mối nguy về sức khỏe cho người tiêu dùng Sắc tố sử dụng rộng rãi nhất là carotenoid màu đỏ cam được tìm thấy chủ yếu trong tôm, cua, cá hồi, cá hồng là astaxanthin [20]

Astaxanthin có vai trò quan trọng để loại trừ hoặc ngăn chặn một số bệnh: chứng xơ vữa động mạch, ung thư, thoái hóa cơ thể và các bệnh về mắt Carotenoid chiếttách từ các loài giáp xác xem như là một tiền tố vitamin A quan trọng và là nhóm chất chống oxy hóa có hoạt tính sinh học mạnh, có hiệu quả đối với người và động vật có vú [29] Có khả năng nâng cao khả năng miễn dịch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa, bệnh thái hóa võng mạc bệnh Alzheimer, Parkinson, các bệnh có liên quan đến sự thừa cholesterol, một số căn bệnh ung thư Trong phế liệu của các loại giáp xác thì carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%) theo Armenta và

Do cấu trúc có nhiều nối đôi nên astaxanthin là một chất chống oxy hóa hiệu quả, có khả năng bảo vệ màng tế bào và các mô khỏi bị tổn thương Đặc tính chống oxy hóa thể hiện ở sự ngăn cản hình thành các gốc tự do bằng cách loại bỏ oxy tự

do, trong trường hợp gốc tự do đã hình thành thì astaxanthin có thể liên kết với các gốc tự do đó để vô hoạt chúng, nhờ đó astaxanthin bảo vệ lipid khỏi oxy hóa Các nghiên cứu cho thấy: đặc tính chống oxy hóa của astaxanthin là cao nhất trong các hợp chất carotenoid, gấp 10 lần so với beta-caroten [26]

1.3.4 Ứng dụng của caroten-protein

Các chếphẩm C-P (hay còn gọi là hỗn hợp protein và carotein, hoặc carotenoprotein) ngày càng được sử dụng phổ biến trong thực phẩm, đặc biệt sử dụng trong chế biến thực phẩm chức năng; vì ngoài tính dinh dưỡng do protein mang lại thì nó còn có tính chức năng của carotenoid và protein mạch ngắn (peptide) mang lại như tính chống oxy hóa Bên cạnh đó, các acid amin cũng góp phần tạo màu và mùi trong công nghệ chế biến thực phẩm [24] Ngoài ra,

carotenoprotein còn được ứng dụng trong ngành y dược và mỹ phẩm Một số ứng

dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid được trình bày ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid [26]

Công nghệ thực phẩm Chất mùi, chất màu, thực phẩm chức

năng

Nuôi trồng thủy sản Tạo màu cho cá, tăng hệ miễn dịch,

giảm stress cho vật nuôi

Y dược Tăng hệ miễn dịch, chống lão hóa, ngăn chặn khả năng gây ung thư, tim mạch,

bệnh về mắt

Mỹ phẩm Hạn chế và giảm nếp nhăn, chống lão

hóa Với hàm lượng cao astaxanthin trong chế phẩm người ta sử dụng để làm thức

ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản

- Trong kỹ thuật nuôi cá hồi: Chất lượng của cá hồi không chỉ được đánh giá qua hàm lượng protein, lipid, acid amin mà còn được đánh giá qua chất lượng màu sắc của cơ thịt của chúng Trong khi đó, cá hồi nuôi thì màu sắc của chúng không đáp ứng được các chỉ tiêu chất lượng và yêu cầu của khách hàng, vì vậy việc bổ sung astaxanthin trong thức ăn của cá là đều cần thiết để tăng màu sắc hồng của cơ thịt cá [10] Trong bột đầu tôm có hàm lượng đạm cao 60% và có khả năng làm tăng hàm lượng astaxanthin trong da và cơ cá hồi[8]

- Trong nuôi cá cảnh: Thức ăn có astaxanthin sẽ góp phần tạo màu sắc cho cá Nếu cho cá ăn thích hợp thì cá sinh trưởng và phát triển tốt, màu sắc đẹp

1.4 Thu nhận hỗn hợp caroten-protein trong quá trình sản xuất chitin từ

phế liệu đầu tôm

1.4.1 Phế liệu đầu tôm

Tôm là mặt hàng chủ lực của ngành thủy sản ở nước ta, các sản phẩm sản xuất từ tôm rất phong phú và đa dạng Ta thấy được phần lớn công nghệ chế biến

tôm đều loại bỏ đầu, vỏ Tùy vào công nghệ chế biến và loại tôm khác nhau mà lượng phế liệu khác nhau từ 35-45% so với khối lượng nguyên liệu ban đầu [23] Trong khi đó sản lượng tôm của nước ta năm 2014 là 569.000 tấn, trong đó sản lượng tôm sú đạt 241.000 tấn và sản lượng tôm thẻ chân trắng là 328.000 tấn [16] Như vậy, ứng với sản lượng thì có khoảng 200.000 tấn phế liệu (trong đó, gần 120.000 tấn đầu tôm)

Sản lượng tôm thẻ chân trắng trong những năm gần đây tăng một cách đáng

kể, hiện là mặt hàng được sản xuất có sản lượng lớn nhất tại các cơ sở chế biến thủy sản ở Nha Trang.Vì vậy sản lượng phế liệu cũng tăng rất nhiều, việc tận dụng phế phẩm để tạo ra sản phẩm chất lượng có giá trị sử dụng là vấn đề được khuyến khích

và đẩy mạnh để tăng nguồn lợi đồng thời góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Bảng 1.3 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm hùm [25]

*Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối

Trong quá trình chế biến tôm hùm, khoảng 70% trọng lượng cơ thể tôm là phếliệu Phế liệu tôm hùm gồm vỏ, nội tạng, một ít thịt Đây là một nguồn nguyên liệu giàu protein (26,6%), chất béo thô (2,7%) và sắc tố (98 μg/g) được biết đến dưới dạng ổn định là carotenoprotein (Bảng 1.3)

Trong thời gian gần đây, nghề nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaaus vannamei)

thương phẩm phát triển mạnh, sản lượng chế biến ngày càng lớn nên nguồn phế liệu tôm thẻ trở thành nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin Ngoài ra, trong phế liệu tôm thẻ chân trắng còn chứa một lượng đáng kể astaxanthin Đây là nguồn nguyên liệu phong phú để tận thu astaxanthin và protein (Bảng 1.4)

Bảng 1.4 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaaus vannamei

*Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối

Các quy trình sản xuất chitin hiện nay chỉ mới thu hồi sản phẩm chitin mà chưa quan tâm đến thu hồi thành phần protein và carotenoid rất có giá trị trong phế liệu tôm [27] Ngoài ra, thành phần khoáng của phế liệu tôm chủ yếu là Ca và một

số khoáng chất khác như P, K, Mg, Mn và Fe [13], đây là những khoáng chất cần thiết cho cơ thể Việc thu hồi các thành phần có giá trị như protein và carotenoid, khoáng chất từ phế liệu tôm không những nâng cao hiệu quả quy trình chế biến chitin, tận dụng bổ sung vào thực phẩm cho người hay động vật nuôi mà còn hạn chế khả năng gây ô nhiễm của phế liệu tôm

1.4.2 Các quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein trong quá trình sản

xuất chitin từ phế liệu tôm

Hình 1.4 Quy trình chiết rút hỗn hợp C-P từ phế liệu tôm sử dụng Alcalase

[36]

Để nâng cao chất lượng sản phẩm thủy phân và hạn chế ô nhiễm môi trường, phương pháp sử dụng enzyme được nghiên cứu ứng dụng phổ biến trên thế giới Enzyme protease đã được ứng dụng rộng rãi để xử lý phế liệu thủy sản nhằm thu nhận chitin, protein và chất màu Nhiều loại enzyme đã được ứng dụng trong việc

xử lý phế liệu tôm như papain, protease chiết rút từ vi sinh vật như Bacillus subtilis,

Pseudomonas… và các loại protease thương mại như Alcalase, Protamex,

Flavourzyme, Neutrase

Thu hồi chitin

Hỗn hợp C-P

Ly tâm Kết tủa Lọc/tách bã

Alcalase 55◦C,

pH 8,5 trong 4h Nghiền nhỏ Phế liệu tôm

Hình 1.5 Quy trình chiết rút bột ĐGC từ phế liệu tôm sử dụng trypsin [24] 1.5 Phương pháp ủ xilô thủy phân protein

1.5.1 Các tác nhân thủy phân protein

Thu hồi chitin

Hỗn hợp ĐGC

Ly tâm Kết tủa Lọc/tách bã

Trypsin 28◦C,

pH 7,6 trong 4h Nghiền nhỏ Phế liệu tôm

xung quanh liên kết nhị dương, làm cho liên kết căng ra hơn trước và dễ bị cắt đứt khi có nước tham gia [23]

Nhận thấy rằng, phương pháp hóa học cho hiệu suất sản phẩm cao nhưng lại

có nhược điểm là ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sau này Do đó, với hóa chất nồng độ cao, hay nồng độ thấp nhưng thời gian dài, hay nhiệt độ cao… đều sẽ ảnh hưởng chất lượng sản phẩm sau này Vì vậy cần có hướng nghiên cứu kết hợp thêm với phương pháp sinh học trong việc tận thu sản phẩm trong dịch thải có chất lượng tốt hơn, giảm được lượng hóa chất sử dụng, nâng cao chất lượng cho sản phẩm carotene-protein, mà còn giải quyết được ô nhiễm môi trường trong quá trình sản xuất về sau

Đặc điểm của chất xúc tác enzyme: Tính đặc hiệu cao, điều kiện nhẹ nhàng,

dễ bị ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, pH, to, kim loại nặng, nồng độ enzyme [E], nồng độ cơ chất [S], chất hoạt hóa và chất ức chế, hoạt lực của enzyme được xác định giá trị hoạt động của nó và mỗi enzyme yêu cầu có những điều kiện hoạt động riêng [10]

Cơ chế tác dụng của enzyme lên cơ chất trải qua 3 giai đoạn theo sơ đồ sau:

Trong đó:

E: Enzyme S: Cơ chất

ES: phức hợp của enzyme-cơ chất P: Sản phẩm

Giai đoạn 1: Phức E – S tồn tại tạm thời bằng các liên kết hydro (H…O, H…N) và liên kết Vander wall (tương tác giữa các nhóm nguyên tử, nhóm phân tử), ngoài ra còn có tương tác yếu giữa các nhóm phân cực và các nhóm không phân

cực Phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

Giai đoạn thứ hai: Xảy ra sự biến đổi trong phức E-S dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết, sự chuyển biến, phản ứng giữa E và S trong phức hết sức quyết liệt, rất đặc hiệu và rất nhanh

Giai đoạn thứ ba: Các liên kết giứa E và S bị phá vỡ hoàn toàn giải phóng E

peptide, do đó tăng số lượng đầu –C và đầu –N tận cùng để các exopeptidase hoạt động Vì Flavourzyme có tính exopeptidase nên khi được bổ sung vào ở công đoạn thủy phân sau sẽ cắt 2 đầu tận cùng của chuỗi polypeptide, 1 đầu có nhóm cacboxyl

và 1 đầu có nhóm amin, cho ra các amino acid tạo hương vị đặc trưng Vì thế việc kết hợp HCl và Flavourzyme để thủy phân đầu tôm sẽ giúp cho quá trình thủy phân được triệt để hơn, chất lượng của sản phẩm tốt hơn

1.5.2 Các quá trình ủ xilô thủy phân protein

Tôm ủ xi lô là một phương pháp thu hồi protein từ phế liệu tôm phổ biến hiện nay Như vậy, khi áp dụng phương pháp này, đã tận thu phần lớn protein để làm thức ăn trong chăn nuôi từ nguồn phế liệu tôm Bã tôm sau khi ủ được tách riêng khỏi dịch ép, sẽ sử dụng cho việc sản xuất chitin Có thể minh họa bằng sơ đồ quy trình Hình 1.6

Hình 1.6.Quá trình thu hồi caroten-protein bằng phương pháp ủ xi lô

Dịch ép

Bã ép

Ép

Ủ xilô Đầu tôm

Sản xuất chitin Tận thu làm thức ăn trong

chăn nuôi

Việc ủ xi lô có bổ sung acid nhằm mục đích hạ thấp pH ban đầu, khống chế quá trình gây thối do vi sinh vật gây thối, bảo quản nguyên liệu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men lactic và các enzyme nội tại hoạt động

Vai trò của acid:

Việc sử dụng các acid hữu cơ như acid lactic để bảo quản phế liệu từ nguyên liệu tươi đã được dùng trong thực phẩm bắt đầu từ rất lâu và rất phổ biến Sử dụng nguyên liệu hoặc phế liệu thủy sản để ủ xi lô là một dạng thức ăn cho động vật nuôi vừa rẻ lại vừa đơn giản Người ta có thể sử dụng cá sau khi đánh bắt hoặc phế liệu

từ cá sau các quá trình gia công chế biến, cùng với việc bổ sung thêm lượng acid hữu cơ Trong suốt thời gian ủ, enzyme nội tại phân giải protein sẽ phá vỡ cấu trúc

tế bào phân tử protein hình thành nên các peptid, amino acid với khả năng hòa tan

và ổn định trong dịch ủ Sự hiện diện của acid lactic sẽ làm giảm pH của môi trường, ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rữa, do đó kéo dài thời gian bảo quản cho nguyên liệu

Việc bổ sung acid ở nồng độ thấp có những tác dụng đáng kể sau [5]

+ Có tác dụng thủy phân protein trong phế liệu tôm do hoạt động của enzyme protease nội tại

+ Ức chế hoạt động, sự phát triển của vi sinh vật gây thối, nấm mốc, bảo quản cho vỏ tôm không bị hỏng, đảm bảo chất lượng chitin sau này

+ Mặt khác còn tạo thành dịch protein lỏng có giá trị về mặt dinh dưỡng khi thu hồi tận dụng làm thức ăn cho gia súc động vật nuôi, có tác dụng ngăn chặn sự oxy hóa astaxanthin, ổn định hàm lượng này để có thể tận thu dịch Các chủng lactic

có mặt trong sản phẩm sẽ làm thay đổi các tính chất cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm

Việc sử dụng acid vô cơ trong quá trình ủ được khuyến cáo hạn chế sử dụng

do tác động xấu đến chất lượng chitin, môi trường và chất lượng dịch ủ (nếu sử

dụng phải trung hòa dịch ủ), các acid hữu cơ mang tính ưu việc hơn nó khắc phục được những nhược điểm của acid vô cơ, tuy nhiên giá thành cao hơn

Enzyme:

Cơ chế phân giải protein cũng giống như sử dụng xút để khử protein Trong quá trình ủ xi lô các enzym trong phế liệu đầu tôm đóng vai trò chính của quá trình phân giải protein Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme đem đến nhiều mặt tích cực hơn

so với sử dụng phương pháp hóa học như nâng cao chất lượng chitin, chitosan, hàm lượng caroten-protein Trong phế liệu tôm có chứa một số loại enzyme, theo tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 05/1993) thì hoạt độ enzyme của protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin và một vài loại enzyme khác có mặt trong phế liệu tôm như alkaline phosphatase, -N-acetyl glucosaminse, chitinase cũng đượcứng dụng nhiều trong thực tế có tác dụng thủy phân hiệu quả

1.6 Phương pháp thu hồi hỗn hợp C-P

Khi hòa tan protein tạo thành dung dịch keo.Trên bề mặt phân tử protein có các nhóm phân cực khi hòa tan vào nước, các phân tử nước lưỡng cực được hấp thụ bởi các nhóm này tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrat Độ bền của dung dịch keo protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ: sự tích điện của phân tử protein, mức độ hydrat hóa, nhiệt độ Khi thay đổi các yếu tố này như làm trung hòa về điện phân tử protein, loại bỏ lớp vỏ hydrat các phân tử protein

sẽ kết tụ lại với nhau tạo thành khối lớn tách khỏi dung dịch, thường gọi là kết tủa protein [14]

Phương pháp thu hồi bằng pH đẳng điện (pI)

Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein (pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện, điện tích của protein bằng không, tương tác tĩnh điện giữa các phân tử protein và các phân tử nước bị giảm Các phân tử protein tập hợp lại với nhau do lớp vỏ hydrat bên ngoài bị phá

vỡ Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein Do không có sự thay đổi cấu trúc phân tử nên sau khi loại bỏ tác nhân gây kết tủa ra khỏi dung dịch thì các phân

tử protein có thể hòa tan trở lại (Trang sĩ Trung, 2008) [12] Cơ chế kết tủa bằng pH đẳng điện có thể mang tính thuận nghịch nên áp dụng để tách hợp chất protein có hoạt tính sinh học ra khỏi hỗn hợp mà vẫn đảm bảo giữ được hoạt tính và cấu trúc phân tử Tuy nhiên thời gian tủa thường xảy ra rất lâu, hiệu suất thu hồi lại thấp và chi phí cao nên hiệu quả kinh tế không cao

Phương pháp thu hồi bằng xử lý nhiệt

Với phương pháp thu hồi protein bằng xử lý nhiệt thì với nhiệt độ cao sẽ loại

bỏ được lớp vỏ hydrat của protein, làm giảm khả năng hấp thụ của nước Các phân

tử protein kết tụ lại với nhau thành khối Do mỗi loại protein khác nhau thì có độ biến tính khác nhau vì vậy độ biến tính của protein tỷ lệ thuận vào cường độ và thời gian khác nhau Đa số protein biến tính ở nhiệt độ 45 – 500C Protein khi được gia nhiệt ở điểm đẳng điện sẽ cho kết tủa nhanh hơn

Kết tủa protein bằng nhiệt có rất nhiều ưu điểm trong việc tách protein từ dung dịch mà khi chúng ta ít quan tâm đến hoạt tính hay cấu trúc của nó Phương pháp kết tủa này xảy ra nhanh, triệt để, ít gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, chi phí năng lượng cho quá trình gia nhiệt quá lớn khi thực hiện ở quy mô công nghiệp

Phương pháp thu hồi bằng polyme (chitosan)

Tính chất đặc trưng mang điện tích dương nên chitosan có thể tương tác với phần lớn các chất hữu cơ mang điện tích âm Chitosan thể hiện là một chất keo tụ, tạo bông tốt, có hiệu quả trong việc thu hồi các chất hữu cơ trong nước, đặc biệt là protein Phân tử chitosan cũng có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng Ngoài ra, chitosan có độ deacetyl cao thì trong dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dương sẽ trung hòa điện tích của các phân tử protein tích điện âm trong dung dịch nước rửa, giảm khả năng hydrat hóa, tập hợp lại và kết tụ [13] Nồng độ chitosan cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi, cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp

lý vì khi tăng nồng độ chitosan làm tăng số điện tích cùng dấu và đẩy nhau tạo nên một mạng lưới keo cản trở quá trình keo tụ lắng xuống của các phân tử protein Chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì các nhóm tích điện dương trên mạch chitosan càng nhiều, thuận lợi trong tương tác ion để thu hồi protein hòa tan

Ưu điểm của phương pháp này là không gây biến tính protein, không độc hại

và hiệu quả thu nhận cao Do đó phương pháp này áp dụng để tận thu các chế phẩm enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng

2.1.1 Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Hình 2.1 Nguyên liệu đầu tôm

Chất lượng đầu tôm tươi, không bị biến đổi màu sắc như đen đầu hay đỏ đầu, không bẩn nhiễm rác và tạp chất, được lưu giữ lạnh bằng thùng xốp cách nhiệt (<50C) với đá khô khi đưa về phòng thí nghiệm Phế liệu tôm trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo Trong trường hợp chưa thí nghiệm ngay thì bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt độ - 200C

Lưu ý, chỉ sử dụng đầu tôm và không sử dụng vỏ tôm vì hàm lượng protein trong vỏ rất ít

caroten-2.1.2 Acid clohydric

Thông thường người ta dùng acid clohydric công nghiệp để thủy phân Dùng HCl để thủy phân có ưu điểm hơn các hóa chất khác vì dịch thủy phân cho màu sắc đẹp, NH3 ít và sự tổn thất acid amin cũng ít [15]

Ở cùng điều kiện pH, nhiệt độ khi dùng H2SO4 thủy phân thì nhanh hơn HCl, giá thành cũng không đắt hơn nhiều nhưng màu sắc của dịch thủy phân xấu, có nhiều NH3 và mất đi một số acid amin như tryptophan vì H2SO4 có tính chất oxy hóa [15]

Dùng NaOH thủy phân cũng nhanh hơn HCl nhưng nó khử đi một số acid amin Còn dùng Na2CO3 thủy phân thì chậm nhất và dung dịch thủy phân xong trung hòa tới pH=7 thì lượng acid phải tiêu tốn nhiều hơn lượng Na2CO3 đem thủy phân [15]

Vì vậy dùng HCl thủy phân là tốt hơn cả

Acid clohydric (hay acid muriatic) có công thức phân tử là HCl; có phân tử gam là 36,46 gam/mol; là một acid vô cơ mạnh, do sự hòa tan của khí hydro clorua (HCl) trong nước Ít có khả năng tạo phản ứng giảm số oxy hóa Nó là một trong những acid mạnh ít độc hại nhất khi tiếp xúc bằng tay; ngoài tính acid, nó còn bao gồm các ion clo không phản ứng và không độc hại

2.1.3 Enzyme Flavourzyme

Hiện nay các enzyme protease thương mại như Alcalase, Flavourrzyme, Protamex, Neutrase được dung để thủy phân protein để chiết rút các chế phẩm sinh học sử dụng trong thực phẩm hoặc công nghệ sinh học [12, 13, 34, 23, 26] Khi thủy phân bằng Alcalase ta thu được hỗn hợp C-P có màu đỏ cam đẹp nhưng có ít

có mùi thơm đặc trưng của tôm rất nhẹ, vị lại hơi đắng Việc sử dụng Alcalase gây

ra vị đắng của sản phẩm thủy phân cũng được ghi nhận bởi nghiên cứu của Seo và cộng sự (2008) [35] So với kết quả cảm quan của hỗn hợp C-P được thủy phân bằng Flavourzyme thì chất lượng cảm quan về màu sắc thì không đẹp bằng nhưng lại có mùi thơm đặc trưng của tôm và vị không đắng Ngoài ra, Flavourzyme còn có

cả tính endopeptidase và exopeptidase tuy nhiên tính exopeptidase mạnh hơn, chính

vì thế khả năng thủy phân của Flavourzyme là tốt hơn cả

Enzyme Flavourzyme là một protease được chiết suất từ nấm Aspergillus

oryzae theo phương pháp lên men chìm Chế phẩm này được hãng Novozyme sản

xuất và được tổ chức FAO cho phép sử dụng trong thực phẩm Nó bao gồm tính chất của một endoprotease và exoprotease

Flavourzyme hoạt động tốt nhất ở môi trường trung tính hoặc acid nhẹ khi thủy phân protein Chọn Flavourzyme để thủy phân thì sản phẩm thủy phân cũng không có vị đắng với liều lượng 5-10 LAPU/g protein Và để kéo dài sự thủy phân thì liều liều lượng nên dùng là 10-50 LAPU/g protein

Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0-10◦C, điều kiện hoạt động tối ưu cho Flavourzyme là pH nằm trong khoảng 5-7; nhiệt độ 50-55◦C [40]

Chế phẩm Flavourzyme ứng dụng được mua từ công ty Novozymes với tên thương mại là Flavourzyme (Merck)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thu mẫu và xử lý mẫu: Phế liệu tôm thẻ chân trắng phải đảm bảo độ

tươi, không hư hỏng được thu nhận đem về phòng thí nghiệm và được duy trì ở nhiệt độ lạnh, sau đó loại bỏ rác bẩn, rửa sạch tạp chất và để ráo nước Để đảm bảo

sự đồng nhất của nguyên liệu trong quá trình nghiên cứu, phế liệu tôm tươi được thu mỗi đợt 10 kg, sau khi xử lý loại bỏ tạp chất và để ráo, cân thành những lượng nhỏ đảm bảo một lần lấy mẫu làm thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm ngay hoặc trữ đông ở -200C cho đến khi sử dụng, thời gian bảo quản tối đa là 1 tháng

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Thuyết minh sơ đồ: Đầu tôm thẻ chân trắng sau khi rửa và loại bỏ tạp chất, để

ráo nước, nghiền mẫu với kích thước 2-3mm để mẫu tăng diện tích tiếp xúc với enzyme nội tại của đầu tôm trong quá trình thủy phân

Tiến hành cho mẫu thủy phân bằng HCl ở nhiệt độ phòng (chọn nồng độ HCl và thời gian xử lý HCl tối ưu), tiếp theo thủy phân bằng Flavourzyme ở 55◦C trong bể

ổn nhiệt (xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm và thời gian xử lý Flavourzyme tối ưu) Sau đó, ép tách bã, lấy dịch thủy phân Quá trình kết tủa protein được thực hiện bằng phương pháp kết hợpxử lý nhiệt và điểm đẳng điện, trong quá trình này có sử dụng chitosan đóng vai trò là chất tạo tủa và keo tụ để tăng hiệu quả quá trình kết tủa protein [12] Cụ thể: dịch thủy phân chứa hỗn hợp C-P được điều chỉnh pH về

pH 4,3-4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein sau đó kết hợp gia nhiệt ở nhiệt độ 70◦C trong thời gian 10 phút và bổ sung chitosan ở nồng độ 100 ppm[12]

Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Đầu tôm

Xử lý sơ bộ

Xác định nồng độ HCl bổ sung và

thời gian ủ xilô

Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp C-P, hàm lượng carotenoid

Đề xuất quy trình thu nhận hỗn hợp C-P bằng phương pháp xử lý kết hợp HCl và Flavourzyme

Xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm và thời gian thủy phân

Tiến hành ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng Thu hồi hỗn hợp caroten-protein và đánh giá hiệu suất thu hồi, hàm lượng carotenoid của hỗn hợp

2.2.2 Xác định nồng độ HCl

Mục đích: Xác định được nồng độ HCl sử dụng ủ xi lô phù hợp để tách chiết

hỗn hợp C-P có hàm lượng carotenoid cao nhất

Tiến hành thí nghiệm: Đầu tôm được rửa sạch loại bỏ rác, đầu tôm ươn

hỏng Cân mỗi mẫu thí nghiệm 100g, xay nhỏ đến kích thước khoảng 2-3mm để tạo điều kiện cho HCl và enzyme tiếp xúc nguyên liệu, bổ sung 100ml nước

Bổ sung acid HCl vào mẫu với các nồng độ khác nhau: 0%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5%, 0,6%; 0,7% xử lý trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, bổ sung Flavourzyme 0,2% (enzyme/đầu tôm, w/w) và nâng nhiệt trong bể ổn nhiệt đến khi đạt 55◦C thì bắt đầu thủy phân trong 2 giờ

Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70◦C /10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), để lắng mẫu qua đêm trong ngăn mát của tủ lạnh Ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [12] Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng carotenoid có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra nồng độ acid HCl thích hợp

Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi hỗn hợp C-P, hàm lượng axtaxanthin Kết quả thăm dò: Chọn nồng độ HCl thích hợp để đạt hiệu suất thu hồi hỗn

hợp C-P có hàm lượng carotenoid cao

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ HCl

Đầu tôm

Xử lý sơ bộ

Ủ xi lô bằng HCl ở các nồng độ khác nhau tại nhiệt độ

phòng trong thời gian 2 giờ

Thủy phân bằng Flavourzyme với tỷ lệ enzyme/đầu tôm

là 0,2% (w/w), ở 55◦C trong thời gian 2 giờ

2.2.3 Xác định thời gian xử lý HCl

Mục đích: Nhằm xác định được thời gian xử lý HCl phù hợp để tách chiết

hỗn hợp C-P có hàm lượng carotenoid cao nhất

Tiến hành thí nghiệm: Đầu tôm được rửa sạch loại bỏ rác, đầu tôm ươn

hỏng.Cân mỗi mẫu thí nghiệm 100g, xay nhỏ đến kích thước khoảng 2-3mm để tạo điều kiện cho HCl và enzyme tiếp xúc nguyên liệu, bổ sung 100ml nước

Ủ xilô bằngHClvới nồng độ từ kết quả của thí nghiệm 2.2.2, xử lý ở các thời gian khác nhau: 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h tại nhiệt độ phòng Tiếp theo, bổ sung Flavourzyme 0,2% (enzyme/đầu tôm, w/w) và nâng nhiệt trong bể ổn nhiệt đến khi đạt 55◦C thì bắt đầu thủy phân trong 2 giờ

Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70◦C/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), để lắng mẫu qua đêm trong ngăn mát của tủ lạnh Ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [12] Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng carotenoid có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra thời gian xử lý HCl thích hợp

Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi hỗn hợp C-P, hàm lượng axtaxanthin Kết quả thăm dò: Chọn thời gian xử lý HCl thích hợp để đạt hiệu suất thu

hồi hỗn hợp C-P có hàm lượng carotenoid cao