Nghiên cứu kết hợp quá trình ép và khử Protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng Enzymy Neutrase trong sản xuất Chitin - Chitosan

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu kết hợp quá trình ép và khử protein bằng enzyme Neutrase trong công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan từ nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng” đ

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan phế liệu tôm 3

1.1.1 Thành phần, tính chất phế liệu tôm 3

1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm 5

1.2 Hiện trạng công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan từ phế liệu tôm 5

1.2.1 Tình hình nghiên cứu 5

1.2.2 Tình hình sản xuất thực tế ở Việt Nam 14

1.3 Tính chất của Chitin, Chitosan và ứng dụng 15

1.3.1 Khái quát chung về Chitin – Chitosan 15

1.3.2 Cấu tạo và tính chất của Chitin – Chitosan 16

1.4 Enzyme và ứng dụng trong công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan 18

1.4.1 Khái niệm enzyme 18

1.4.2 Các enzyme được dùng để sản xuất Chitin – Chitosan 18

1.4.3 Các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất Chitin – Chitosan 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 22

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất, enzyme protease 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 23

2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân tốt nhất cho enzyme Neutrase .25

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân tốt nhất cho NaOH 29

2.2.4 Bố trí thí nghiệm khử khoáng bằng HCl 31

2.2.5 Bố trí thí nghiệm deacetyl Chitin 32

2.2.6 Bố trí thí nghiệm đối chứng theo phương pháp hóa học 32

2.3 Phương pháp phân tích 33

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Thành phần hóa học phế liệu tôm thẻ chân trắng 34

3.2 Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng enzyme Neutrase 35

3.2.1 Kết quả nghiên cứu xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp 35

3.2.2 Kết quả nghiên cứu xác định nhiệt độ thủy phân tối ưu cho enzyme Neutrase .36

3.2.3 Kết quả nghiên cứu xác định thời gian thủy phân tối ưu cho enzyme Neutrase .38

3.2.4 Kết quả nghiên cứu xác định pH thủy phân tối ưu cho enzyme Neutrase 39

3.3 Kết quả nghiên cứu chế độ khử protein lần II bằng NaOH……… 40

3.3.1 Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ NaOH thích hợp 40

3.3.2 Kết quả nghiên cứu xác định thời gian khử protein lần II bằng NaOH 42

3.4 Kết quả khử khoáng bằng HCl 43

3.5 Đánh giá chất lượng Chitin 43

3.6 Đánh giá chất lượng Chitosan 44

3.7 Đề xuất quy trình sản xuất 45

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình, trong thời gian qua cùng với sự nỗ lực và phấn đấu không ngừng của bản thân em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, động viên và khích lệ của quý thầy cô, gia đình và bạn bè Qua đây em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới:

Toàn thể thầy cô, cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập

Thầy TS Trang Sĩ Trung, trưởng Bộ môn Hóa - vi sinh, Khoa chế biến - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Thầy ThS Nguyễn Công Minh, Bộ môn Hóa - vi sinh, Khoa chế biến - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đề tài

Ban quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, phòng thực hành Hóa Sinh – Vi Sinh, khoa Chế biến, trường Đại Học Nha Trang

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả người thân trong gia đình, bạn bè cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và đóng góp ý kiếm giúp em trong suốt thời gian qua

Nha Trang, ngày 06 tháng 07 năm 2010

Sinh viên thực tập

Phùng Văn Phú

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Thành phần hóa học phế liệu đầu tôm Thẻ chân trắng 36 3.2 Chỉ tiêu chất lượng cơ bản của Chitin 43 3.3 Chỉ tiêu chất lượng cơ bản của Chitosan 44

1.3 Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan của Trung tâm

Chế biến – Đại học Nha Trang

10

1.4 Quy trình sản xuất Chitin của TS Trang Sĩ Trung,

trường Đại học Nha Trang

13

1.5 Cấu tạo hóa học của cellulose, Chitin và Chitosan

(Kumar, 2000)

16

1.6 Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan kết hợp xử lý

enzyme Flavourzyme (Trang Sĩ Trung 1/2009)

19

1.7 Quy trình sử dụng enzyme Papain trong sản xuất

Chitin – Chitoan

20

1.8 Quy trình sản xuất Chitin của Holanda và Netto (2006) 21

2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm

thích hợp

25

2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ thích hợp 26 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ thích hợp 27 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH ủ thích hợp 28 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ NaOH thích

2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khử khoáng bằng HCl 4% 31 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm deacetyl Chitin 32 2.10 Quy trình đối chứng theo phương pháp hóa học 32 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Neutrase tới hiệu suất

thủy phân protein đầu tôm

35

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ enzyme Neutrase tới hiệu

suất thủy phân protein ở đầu tôm

37

3.3 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất thủy phân

protein đầu tôm bằng enzyme Neutrase

38

3.4 Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất thủy phân protein đầu

tôm bằng enzyme Neutrase

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngành chế biến thủy sản xuất khẩu được đánh giá là ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước, hàng năm đóng góp kim ngạch xuất khẩu đáng kể Trong năm 2009, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,4 tỷ USD, trong đó chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu chiếm 15,9% về khối lượng (khoảng 210.000 tấn) và 36,9% về giá trị [1] Cùng với đó quá trình chế biến tôm cũng tạo ra lượng lớn phế liệu khoảng 100.000 tấn/năm Trong phế liệu tôm có rất nhiều thành phần có giá trị như Chitin, protein, astaxanthin, khoáng hữu cơ Tuy nhiên hiện nay lượng phế liệu này chủ yếu được

sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất Chitin Các quy trình sản xuất Chitin đang sử dụng là các quy trình hóa học và chỉ tập chung thu hồi Chitin mà không thu hồi các thành phần có giá trị là protein và astaxanthin Chất lượng của protein và astaxanthin trong quy trình hóa học thường có chất lượng thấp do ảnh hưởng các hóa chất xử lý và vì vậy không được thu hồi mà thải ra môi trường, dẫn đến gây ô nhiễm môi trường xung quanh các cơ sở chế biến phế liệu tôm Mặt khác, Chitin thu được từ quy trình hóa học có chất lượng kém do ảnh hưởng bởi nồng độ hóa chất cao gây cắt mạch Chitin

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu kết hợp quá trình ép và khử protein bằng enzyme Neutrase trong công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan từ nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng” được tiến hành nhằm nâng cao hiệu quả quy

trình sản xuất, khắc phục một số nhược điểm của phương pháp hóa học hiện nay

2 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng trước

và sau khi ép

- Xác định điều kiện thích hợp để thủy phân protein trong nguyên liệu đầu tôm (ép) bằng enzyme Neutrase

- Xác định chế độ khử protein còn lại bằng NaOH

- Đánh giá chất lượng Chitin và Chitosan thu được

3 Tính khoa học và thực tiễn của đề tài

Thành công của đề tài sẽ được áp dụng tại các cơ sở sản xuất Chitin với mục đích tận dụng nguồn protein, astaxanthin từ đầu tôm, hạn chế sử dụng hóa chất nhằm giảm ô nhiễm môi trường và sản xuất ra Chitin – Chitosan có chất lượng cao ứng dụng trong các lĩnh vực quan trọng như y học, mỹ phẩm, thực phẩm,… Đề tài cũng là nguồn tài liệu hữu ích cho các nghiên cứu chuyên sâu về công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan phế liệu tôm

1.1.1 Thành phần, tính chất phế liệu tôm [4]

Phế liệu tôm chủ yếu là đầu, vỏ và đuôi tôm, ngoài ra còn phần thịt vụn do bóc nõn không đúng quy trình kỹ thuật Tùy thuộc vào từng loài, sản phẩm chế biến khác nhau mà lượng phế liệu tôm thu được khác nhau

Trong phế liệu tôm, phần đầu thường chiếm khoảng 3545%, phần vỏ chiếm 1015% trọng lượng của tôm nguyên liệu Tuy vậy tỷ lệ này còn phụ thuộc vào giống, loài và giai đoạn sinh trưởng

Thành phần chiếm tỉ lệ đáng kể trong đầu, vỏ tôm là Chitin, protein, canxi cacbonat, sắc tố,… tỷ lệ giữa các thành phần này là không ổn định, chúng thay đổi theo đặc điểm sinh thái, sinh lý, loài,… Thành phần Chitin và protein trong vỏ tôm khô chiếm khoảng 1127,5% và 23,353%

Hàm lượng Chitin, protein, khoáng và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay đổi rất rộng, phụ thuộc vào điều kiện bảo quản cũng như phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản Vỏ giáp xác chứa chủ yếu là protein (30÷40%), khoáng (30÷50%), Chitin (13÷42%) Theo Mayer (1986), thành phần hóa học của phế liệu tôm được thể hiện trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần đầu và vỏ phế liệu tôm (%)

Phế liệu Protein Chitin Lipid Tro Calci Phospho

- Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác, chủ yếu là với CaCO3 – thành phần chính cấu tạo nên vỏ tôm, chính sự liên kết này đã gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế

- Canxi: Trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ,

chủ yếu là cacbonat canxi (CaCO3)

- Astaxanthin: Là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của

caroten, thường ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh đặc trưng cho tôm Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin

Ngoài các thành phần kể trên, trong vỏ tôm còn có các thành phần khác như: Nước, lipid, phospho, enzyme, …

- Lipid: Chứa một lượng đáng kể, chủ yếu gồm các acid béo chưa no bão hòa

như eicosapentaenoic acid (EPA), decosahexaenoic acid (DHA) Đây là những acid béo rất có lợi cho sức khỏe con người và có nhiều ứng dụng trong y học

- Enzyme: Trong phế liệu tôm cũng có chứa một số loại enzyme, theo tạp chí

Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 05/1993) thì hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/gam tươi Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin, được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư Một vài loại enzyme khác

có mặt trong phế liệu tôm như alkaline phosphatase, -N-acetyl glucosaminase, Chitinase cũng được ứng dụng nhiều trong thực tế

Từ thành phần, tính chất nguồn phế liệu đầu, vỏ tôm nhận thấy đây là nguồn nguyên liệu phong phú không chỉ sản xuất Chitin – Chitosan mà còn chứa một lượng protein, astaxanthin và các acid béo không no có lợi cho cơ thể cần được thu hồi

Từ đó, cần có chế độ xử lý thích hợp đối với nguồn phế liệu đầu, vỏ tôm để thu được thành phẩm có chất lượng cao, như việc tách phần lớn protein trước khi sản xuất Chitin – Chitosan bằng enzyme protease Bên cạnh đó, còn có thể tận dụng làm thức ăn cho chăn nuôi Từ đó, vừa góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế, vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đưa ngành thủy sản phát triển một cách bền vững

1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm [13]

Năm 2009, sản lượng tôm nuôi của châu Á đạt 2,83 triệu tấn, trong đó có

2,307 triệu tấn tôm chân trắng (Penaeus vannamei) và 522.000 tấn tôm sú (P.monodon) Sản lượng tôm nuôi năm 2009 và triển vọng của năm 2010 tại một số

quốc gia nuôi tôm chủ yếu ở châu Á:

Trung Quốc, năm 2009 ước tính đạt sản lượng 1,2 triệu tấn tôm chân trắng, trong đó có 560.000 tấn nuôi trong các ao ven bờ Sản lượng nuôi tôm sú và các loài

khác trong họ tôm He (Penaeidae) như P.chinensis và P japonicus là 150.000 tấn

Năm 2010, ước tính tổng sản lượng tôm nuôi sẽ đạt 1,45 triệu tấn

Thái Lan, năm 2009 sản lượng tôm nuôi ước tính của Thái Lan nằm trong khoảng từ 520.000 đến 537.000 tấn Từ năm 2010 đến 2012, ước tính sản lượng đạt 525.000 tấn năm 2010, tăng lên 551.000 tấn năm 2011 và 578.000 tấn năm 2012

Việt Nam, từ cuối năm 2008 tới năm 2009 sản lượng tôm sú ước tính giảm khoảng 40%

Inđônêxia sản lượng tôm nuôi giảm, ước tính chỉ đạt 345.000 tấn Năm 2010, với việc khôi phục lại sản xuất từ các vùng nuôi tôm bị dịch bệnh ở Lampung, Medan và Đông Java, dự tính sản lượng sẽ tăng lên 265.000 tấn tôm chân trắng và 120.000 tấn tôm sú

Căn cứ vào tình hình trên cho thấy, năm 2009 sản lượng tôm trên thế giới và châu Á có giảm do các nguyên nhân về thời tiết, dịch bệnh và đặc biệt do ảnh hưởng của cuộc khủng hoảng kinh tế - tài chính thế giới năm 2008 Tuy nhiên, sang năm 2010 ước tính sản lượng tôm sẽ tăng mạnh trở lại, kéo theo lượng phế liệu đầu,

Chitin – Chitosan chính đó là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học, bên cạnh đó cũng có thể kết hợp cả hai phương pháp này để sản xuất Chitin – Chitosan cho chất lượng cao

1.2.1.1 Sản xuất Chitin - Chitosan theo phương pháp hóa học

Quá trình sản xuất Chitin – Chitosan theo phương pháp hóa học diễn ra theo các bước cơ bản sau:

Nguyên liệu → Xử lý acid (khử khoáng) → Xử lý kiềm (khử protein và deacetyl) → Sản phẩm (có độ deacetyl khác nhau)

Mô tả quy trình:

Nguyên liệu sau khi được rửa sạch, xử lý với acid HCl, tùy theo thời gian và nhiệt độ mà nồng độ HCl có thể thay đổi từ 8÷12% Tỷ lệ hóa chất/nguyên liệu thay đổi từ 5÷10 lần (v/w) Sau khi xử lý yêu cầu hàm lượng tro <1,5% Đối với Chitosan sử dụng trong y tế hàm lượng tro yêu cầu là < 0,03%

Sau khi khử khoáng nguyên liệu được rửa sạch và tùy theo công nghệ xử lý một hoặc hai lần NaOH mà ta thực hiện như sau:

+ Đối với quy trình xử lý NaOH một công đoạn: Nồng độ NaOH cũng tùy theo nhiệt độ và thời gian mà có thể thay đổi từ 35÷70% Tỷ lệ hóa chất/nguyên liệu thay đổi từ 5÷10 lần (v/w)

+ Đối với quy trình xử lý NaOH hai công đoạn thì vỏ tôm sau khi khử khoáng, rửa sạch đem xử lý NaOH ở nồng độ 2÷5% sau khi rửa sạch, phơi tẩy màu thu được Chitin Chitin thu được có thể đem bảo quản hay sử dụng để sản xuất Chitosan bằng cách xử lý với NaOH đặc ở nồng độ 35÷70% tùy thuộc vào nhiệt độ

và thời gian xử lý Sản phẩm thu được có các chỉ tiêu cơ bản sau:

* Ưu điểm:

Thời gian xử lý vỏ tôm để thu Chitin nhanh: Theo tính toán để thu được Chitin thường mất khoảng 36÷40 giờ, so với phương pháp sinh học thì phương pháp hóa học nhanh hơn nhiều (thường xử lý bằng phương pháp sinh học mất khoảng 192÷360 giờ)

* Nhược điểm:

Sử dụng HCl và NaOH ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của Chitosan sau này, cụ thể hơn là gây cắt mạch Chitosan

Lượng dịch thải ra trong quá trình sản xuất có tính acid hoặc kiềm, khả năng

ăn mòn cao, trực tiếp phá hủy môi trường xung quanh khu vực thải

Ngoài ra, vẫn chưa có hướng để thu hồi các chất có giá trị trong dịch thải Một số quy trình sản xuất Chitin – Chitosan theo phương pháp hóa học

* Quy trình sản xuất Chitosan một công đoạn xử lý kiềm, Trần Thị Luyến (2003) [10]

Hình 1.1 Sơ đồ quy trình sản xuất Chitosan một công đoạn xử lý kiềm

Nhận xét:

Phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm Chitosan có chất lượng không kém so với quy trình thông thường với hai giai đoạn xử lý kiềm Tổng thời gian xử lý giảm nhiều, như vậy nếu so về mặt kinh tế thì đây là phương pháp tốt hơn hẳn Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn nhược điểm là dung dịch NaOH đặc sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử dụng

HCl 10%

to phòng t= 5hw/v = 1/5

NaOH 40%

to = 80±2oC

t = 5h w/v = 1/10

Rửa trung tính

Chitosan

* Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan của Trường Đại học Nha Trang [7]

(GVC Đỗ Minh Phụng)

Vỏ tôm khô

 Ngâm HCl 6N (tỷ lệ 1W : 2,5V, 48h, tphòng)

 Rửa trung tính

 Ngâm NaOH 8% (tỷ lệ 1W : 1,5V; 2h, 100C)

Rửa trung tính

 Tẩy màu (KMnO4 1%; Na2S2O3 1,5% trong môi trường H2SO4 10%)

Chitin

 Ngâm NaOH 40% (tỷ lệ 1W : 1V; 24h; 80C)

 Chitosan

Hình 1.2 Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan, Trường Đại Học Nha

* Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan của Trung tâm Chế biến, Đại học Nha Trang [11]

Hình 1.3 Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan của Trung tâm Chế biến –

Đại học Nha Trang

và việc tận thu sản phẩm trong dịch thải ban đầu theo phương pháp sinh học sẽ có chất lượng tốt hơn

1.2.1.2 Sản xuất Chitin – Chitosan theo phương pháp sinh học

Quy trình sản xuất diễn ra theo các bước sau:

Tách khoáng Phế liệu tôm

Nguyên liệu  khử khoáng, khử protein và deacetyl  sản phẩm Chitosan Trong phương pháp sinh học, các công đoạn khử khoáng, khử protein và deacetyl không sử dụng hóa chất mà sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzyme để loại bỏ protein, khoáng Quá trình deacetyl được thực hiện bởi enzyme deacetylase Sản phẩm Chitosan thu được có chất lượng cao do không ảnh hưởng nhiều bởi hóa chất

* Ưu điểm:

Chất lượng sản phẩm thu được tốt do quá trình xử lý chỉ dùng acid và kiềm

nhẹ nên ít ảnh hưởng xấu tới chất lượng và môi trường Ngoài ra, protein sau quá trình ủ có thể thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, các chất khác như lipid, các sắc tố khác cũng được thu hồi

Giá thành sản phẩm rẻ (rẻ hơn khoảng 10 lần so với phương pháp hóa học)

do quá trình xử lý lợi dụng sự lên men của vi khuẩn để tách loại canxi, protein trong phế liệu tôm, không sử dụng nhiều hóa chất Chính vì thế chi phí ban đầu đưa vào

xử lý hầu như rất ít, giá thành tính trên sản phẩm thấp

* Nhược điểm:

Thời gian xử lý lâu, thường kéo dài từ 12 đến 21 ngày mới xử lý xong một

mẻ, tùy vào các loại protein khác nhau

Phương pháp sinh học không thể loại bỏ hoàn toàn protein và khoáng như phương pháp hóa học nên cần có các bước xử lý tiếp theo

Trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học trong sản xuất Chitin – Chitosan như:

+ Rao và Stevens (2005) [22] đã sản xuất Chitin bằng cách ủ xi lô đầu và vỏ

tôm với Lactobacillus plantarum 541 Hiệu suất thu hồi Chitin từ đầu và vỏ tôm là

4,5% và 13% với đầu tôm đã khử được 83% protein và 88% khoáng, khử được 66% protein và 63% khoáng từ vỏ tôm

+ Kết quả nghiên cứu của Rao và Stevens (2005) [22] đã chỉ ra rằng có thể

khử được khoáng và protein từ đầu, vỏ tôm phế liệu bằng cách ủ xi lô với L

plantarum 541 và A6 ở nồng độ muối 2% Khi ủ xi lô đầu, vỏ tôm phế liệu sử dụng

chủng L plantarum 541 khử được 81,4% khoáng, 59,8% protein; trong khi đó L

plantarum A6 khử được, 5% khoáng và 52,2% protein

+ Gần đây trường Đại học Nha Trang đã có những nghiên cứu về việc sử dụng hai enzyme phân giải protein chymotripsin và papain để khử protein trong vỏ tôm [9] Tuy nhiên những kết quả nghiên cứu này chưa được công bố cụ thể

+ Theo Simpson và cộng sự (1994) [25] thì Chitosan cũng có thể được tạo ra

từ Chitin bằng cách sử dụng những enzyme vi sinh vật Có thể khử gốc acetyl trong

Chitin bằng cách ủ xi lô Phycomyces blakesleeanus và Mucor rouxii, Absidia

coerulea Những vi sinh vật có khả năng sinh ra enzyme deacetylase như: Aspergillus niger, Mucor meehei, Phycomycetes nitens, Rhizopus acetoinus, Rhizopus microsporus,…

1.2.1.3 Sản xuất Chitin – Chitosan bằng cách kết hợp phương pháp sinh học với phương pháp hóa học

Quy trình sản xuất diễn ra theo các bước sau:

Nguyên liệu → xử lý lần I (phương pháp sinh học) → xử lý lần II (phương pháp hóa học) → Chitin → deactyl → Chitosan

Trong quy trình, nguyên liệu sau khi được loại bỏ các tạp chất sẽ được xử lý lần I (khử khoáng và protein hoặc chỉ khử khoáng hay protein) bằng phương pháp sinh học (như sử dụng enzyme hay vi sinh vật), tiếp đó là quá trình xử lý lần II, khử phần protein và khoáng còn lại trong nguyên liệu bằng hóa chất (NaOH và HCl) Sau quá trình trên thu được Chitin, tiếp tục deacetyl thu được Chitosan

* Ưu điểm:

Chất lượng sản phẩm thu được tốt do quá trình xử lý chỉ dùng acid và kiềm nhẹ trong thời gian ngắn nên ít ảnh hưởng xấu tới chất lượng của sản phẩm, đồng thời giảm ô nhiễm môi trường do giảm lượng hóa chất sử dụng

Giá thành rẻ do tận thu được chất có giá trị kinh tế như thu hồi protein làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi trong quá trình sản xuất, giảm lượng hóa chất sử dụng và đặc biệt giảm lượng chi phí lớn cho công tác xử lý ô nhiễm môi trường

Thời gian xử lý ngắn hơn phương pháp sinh học, khoảng 48 giờ

* Nhược điểm: Kỹ thuật sản xuất phức tạp, thời gian kéo dài hơn so với phương pháp hóa học

Hiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng quy trình sản xuất kết hợp phương pháp hóa học và sinh học đã được nghiên cứu rộng rãi ở Việt Nam và trên thế giới, như nghiên cứu của TS Trang Sĩ Trung, trường Đại học Nha Trang (Hình 1.4) [15]

Hình 1.4 Quy trình sản xuất Chitin của TS Trang Sĩ Trung, trường Đại

Khử protein còn lại bằng NaOH

- Thời gian 12 giờ

Nhận xét:

Từ quy trình sản xuất cho thấy, thời gian để cho ra sản phẩm ngắn (khoảng

30 giờ), nồng độ hóa chất sử dụng thấp (NaOH 2%, HCl 4%), nhiệt độ thấp (50oC trong quá trình thủy phân bằng enzyme và ở nhiệt độ thường với việc sử dụng hóa chất) Bên cạnh đó lại có thể tận thu protein và astaxanthin góp phần làm tăng hiệu quả kinh tế và giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trường cùng với giảm một lượng đáng kể nồng độ của những hóa chất độc hại gây tác động xấu cho Chitin và môi trường Do đó, chất lượng Chitin thu được rất cao và hiệu quả kinh tế thu được cũng cao Từ đây, mở ra một hướng nghiên cứu cho các nhà khoa học để có thể sản xuất

ra Chitin chất lượng cao và thân thiện với môi trường có thể ứng dụng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp

1.2.2 Tình hình sản xuất thực tế ở Việt Nam

Mặc dù có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp sản xuất Chitin như hóa học, sinh học hoặc kết hợp hóa học và sinh học Tuy nhiên cho đến nay việc áp dụng các công nghệ sản xuất cải tiến gặp rất nhiều khó khăn, qua khảo sát thực tế và các hội thảo về môi trường do các Bộ, Ngành tổ chức (sản xuất Chitin được đánh giá là gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng nhất) việc áp dụng công nghệ cải tiến vào sản xuất Chitin, nhằm hạn chế những tác động xấu đến môi trường cho đến nay vẫn chưa có nơi nào trong cả nước áp dụng sản xuất thực tế trên quy

mô công nghiệp

Hiện nay, vấn đề môi trường đang được toàn xã hội quan tâm bởi nó ảnh hưởng trực tiếp tới cuộc sống của cả cộng đồng Việc áp dụng quy trình sản xuất thực tế hiện nay, qua thanh, kiểm tra hầu như toàn bộ các doanh nghiệp, cơ sở sản xuất Chitin đều vi phạm luật bảo vệ môi trường, kể cả những cơ sở có hệ thống xử

lý nước thải Từ việc khảo sát các quy trình sản xuất thực tế nhận thấy, tồn tại một

- Luật bảo vệ môi trường chưa hoàn chỉnh và chế tài xử lý chưa nghiêm nên các doanh nghiệp hám lợi, lách luật, xem nhẹ việc bảo vệ môi trường

- Quy trình sản xuất mất nhiều thời gian, sản lượng chế biến thấp, thao tác kỹ thuật phức tạp, chi phí sản xuất cao,

Nhìn chung các quy trình sản xuất Chitin – Chitosan hiện nay chủ yếu theo phương pháp hóa học, các hóa chất sử dụng như HCl, NaOH, rất độc hại và được

sử dụng ở nồng độ cao, không những ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm mà còn ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe cộng đồng

Vì vậy, nếu có thể kết hợp với phương pháp sinh học để tách bớt protein, khoáng trước khi sản xuất Chitin thì có thể giảm đi một lượng lớn hóa chất sử dụng cần thiết, đồng thời tận thu các chất có giá trị trong dịch thải như protein, astaxanthin,….Từ

đó cho ra sản phẩm Chitin – Chitosan có chất lượng cao, ngoài ra còn tận thu được nguồn dịch thải có giá trị kinh tế và góp phần làm giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trường

Tình hình trên cho thấy còn tồn tại nhiều bất cập trong việc sản xuất Chitin hiện nay Cần phải có các giải pháp cải thiện công nghệ, áp dụng sản xuất sạch hơn, để giảm thiểu những tác động xấu, đồng thời cũng đem đến lợi ích cho doanh nghiệp và cộng đồng

1.3 Tính chất của Chitin, Chitosan và ứng dụng

1.3.1 Khái quát chung về Chitin – Chitosan

Chitin – Chitosan là polyme hữu cơ phổ biến trong tự nhiên, sau cellulose Trong tự nhiên Chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật Trong giới động vật, Chitin

là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống

như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Đặc biệt đối với động vật thủy sản, nhất là trong vỏ tôm, cua, ghẹ hàm lượng Chitin chiếm tỷ lệ khá cao từ 1435% so với trọng lượng khô Trong thực vật, Chitin có ở thành tế bào của nấm

Zygemycethers và một số tảo Chlorophiceae Chitosan là sản phẩm biến tính của

Chitin, sau khi xử lý Chitin trong kiềm đặc nóng

1.3.2 Cấu tạo và tính chất của Chitin – Chitosan

1.3.2.1 Công thức cấu tạo của Chitin và Chitosan

Hình 1.5 Cấu tạo hóa học của Cellulose, Chitin và Chitosan (Kumar,

2000) 1.3.2.2 Tính chất của Chitin, Chitosan

* Một số tính chất của Chitin

Màu trắng, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, trong acid loãng và các dung dịch hữu cơ như este, rượu Hòa tan được trong muối đậm đặc của thyoxyanat liti và thyoxyanat canxi tạo thành dung dịch keo

Ổn định với chất oxy hóa mạnh như KMnO4, nước javen, NaClO…vì vậy, người ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho Chitin

Kết tinh ở dạng tinh thể vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac, không hòa tan trong thuốc thử Schweizei – sapranora

Là polysaccharid nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao, có tính hòa

hợp sinh học và tự phân hủy trên da

Bị enzyme lyozyme – một loại enzyme chỉ có trên cơ thể người, phân giải thành monome N – acetyl – D – Glucosamine

Khi đun nóng Chitin trong HCl đậm đặc tạo thành glucosamine chlohydrat Khi đun nóng Chitin trong NaOH đậm đặc tạo thành Chitosan (C6H11O4)n

- Trong mỹ phẩm: Dùng làm phụ gia để tăng độ bám dính, tăng độ hòa hợp

sinh học với da, chống tia cực tím, làm mềm da, làm kem lột mặt,…

- Trong công nghiệp: Các kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in,

phim ảnh, Chitosan dùng làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm

- Trong xử lý nước thải: Chitosan dùng để xử lý nước thải trong công nghiệp

(tạo phức với các kim loại nặng độc hại) để lọc trong nước phục vụ tiêu dùng

- Trong nông nghiệp: Chitosan chống lại các vi nấm và vi khuẩn gây bệnh

của môi trường xung quanh để bảo vệ thực vật, Chitosan còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa

- Trong công nghiệp thực phẩm: Để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo quản

thực phẩm, hoa quả, rau tươi,.…Vì nó tạo màng sinh học không độc Người ta đã tạo màng Chitosan trên quả tươi để bảo quản quả đào, quả lê, quả kiwi, dưa chuột,

ớt chuông, dâu tây, cà chua,….Dùng để lọc trong các loại nước quả ép, bia, rượu vang, nước giải khát,…

Là một polyme dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính sinh học đa dạng, Chitosan được đưa vào thực phẩm, thức ăn, bánh kẹo, nước giải khát

- Trong công nghệ sinh học: Dùng để cố định enzyme và các tế bào vi sinh

Dùng làm chất màng sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polyme

Dùng làm vật liệu: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép,…

1.4 Enzyme và ứng dụng trong công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan

1.4.1 Khái niệm enzyme [2]

Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác Người ta đã khám phá ra rằng các enzyme đã xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành nhịp nhàng, cân đối, theo những chiều hướng xác định

1.4.2 Các enzyme được dùng để sản xuất Chitin – Chitosan

Enzyme Alcalase, Neutrase, Flavourzyme, Papain, Protamex, Bromelain,…

1.4.3 Các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất Chitin – Chitosan

1.4.3.1 Nghiên cứu trong nước

* Nghiên cứu sử dụng enzyme Flavourzyme, Trang Sĩ Trung [15]

Phế liệu tôm được xay nhỏ đến kích cỡ 5 tới 6mm sau đó được đưa đi khử protein bằng enzyme Flavourzyme ở điều kiện nhiệt độ 50oC, pH 6,5, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 0,1% và thời gian thủy phân là 6 giờ Sau khi thủy phân đem lọc tách phần bã chứa Chitin, phần dịch chứa protein và astaxanthin Phần dịch được tận thu để thu hồi astaxanthin và protein Phần bã được đưa đi xử lý và tách

phần protein còn lại bằng NaOH loãng (nồng độ 2%, thời gian 12 giờ, nhiệt độ phòng) và tiếp tục khử khoáng bằng HCl (nồng độ 4%, thời gian 6 giờ, nhiệt độ phòng), rửa trung tính, sấy thu được Chitin Tiếp tục deacetyl Chitin bằng NaOH (nồng độ 70%, thời gian 8 giờ, nhiệt độ 80oC) thu được Chitosan Sơ đồ quy trình sản xuất được mô tả trong Hình 1.6

Hình 1.6 Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan kết hợp xử lý enzyme

Flavourzyme (Trang Sĩ Trung 1/2009)

* Nghiên cứu sử dụng enzyme Papain, Trần Thị Luyến [9]

Quy trình sử dụng enzyme papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất của quy trình có ưu thế hơn hẳn Nhưng để nâng cao chất lượng của Chitosan có thể sử dụng enzyme papain thay thế cho NaOH để khử protein trong vỏ tôm Đặc biệt dịch thủy phân thu được

sử dụng cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng, điều đó chắc chắn mang lại hiệu quả cao Quy trình sản xuất được thể hiện ở Hình 1.7

Hình 1.7 Quy trình sử dụng enzyme Papain trong sản xuất Chitin – Chitoan 1.4.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

* Nghiên cứu của Holanda và Netto [19]

Ưu điểm: Quy trình này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều Sản phẩm Chitin thu được có chất lượng khá tốt, màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố trong công

HCl 10%

To phòng

T = 5h w/v = 1/5

Khử protein

Chitin

Deacetyl Phơi khô

Chitosan

đoạn chiết astaxanthin Ngoài ra còn tận thu được protein và astaxanthin mang lại hiệu quả kinh tế cao, đồng thời giảm thiểu đáng kể lượng hóa chất sử dụng

Nhược điểm: Enzyme đắt tiền dẫn đến chi phí giá thành sản phẩm cao

- Sơ đồ quy trình sản xuất (Hình 1.8)

Hình 1.8 Quy trình sản xuất Chitin của Holanda và Netto (2006)

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm

Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được lấy tại Công ty Cổ phần

Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa Nguyên liệu sau khi lấy được vận chuyển ngay bằng thùng xốp cách nhiệt có nhiệt độ < 5oC về phòng thí nghiệm Nguyên liệu trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo trong thời gian 5 phút Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch, bao gói và bảo quản đông ở nhiệt độ -20oC tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất, enzyme protease

2.1.2.1 Dụng cụ

Thau, khay nhựa để phơi mẫu khi thí nghiệm và lấy mẫu đem đi phân tích Dụng cụ thủy tinh như: Ống nghiệm, bình tam giác, cốc nung, bình định mức, ống đong, pipet, phễu thủy tinh,…

Máy móc và thiết bị: Cân phân tích, bếp điện, tủ sấy, lò nung, máy đo độ hấp phụ quang học, bể ổn nhiệt, nhớt kế,

2.1.2.2 Hóa chất

NaOH, HCl

Hóa chất được sử dụng ở dạng tinh khiết dùng để phân tích

2.1.2.3 Enzyme protease

Enzyme Neutrase có hoạt độ 0,8 AU/g mua tại công ty Novozyme, Tp Hồ

Chí Minh, thu được từ nguồn nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens

Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0 ÷ 10oC

Thời gian bảo quản trước 24 tháng kể từ ngày sử dụng

Điều kiện hoạt động tốt nhất của enzyme Neutrase là:

- Nhiệt độ từ 45oC tới 55oC,

- pH từ 5,5 đến 7,5

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Nguyên liệu đầu tôm

Ép

Khử protein bằng enzyme Neutrase Neutrase

Khử khoáng bằng HCl Rửa

Deacetyl

Thời gian: 8 → 14 giờ Nồng độ NaOH: 1 → 3%

Tỷ lệ (w/v): 1/5 Nhiệt độ : 50oC

Bã

NaOH 70%, 8 giờ, 80oC

Bã ép

Dịch ép

* Mô tả quy trình

Đầu tiên, nguyên liệu đầu tôm được rửa sạch, để ráo và ép sơ bộ bằng máy

ép trục vít Sau đó, nguyên liệu được khử protein lần I bằng enzyme protease Neutrase trong các điều kiện nhiệt độ, thời gian, pH, tỷ lệ enzyme/đầu tôm khác nhau nhằm xác định điều kiện thủy phân tốt nhất cho enzyme Neutrase Sau khi xác định được điều kiện thủy phân tốt nhất cho enzyme, tiến hành đánh giá hiệu suất thủy phân protein lần I và tiếp tục xác định chế độ khử protein lần II bằng NaOH loãng ở nhiệt độ 50oC trong các điều kiện (nồng độ NaOH và thời gian) khác nhau nhằm xác định chế độ khử tốt nhất bằng NaOH Bước tiếp là quá trình khử khoáng bằng HCl 4% trong 6 giờ ở nhiệt độ thường với tỷ lệ HCl/nguyên liệu = 5/1 [16] thu được Chitin, đánh giá chất lượng và deacetyl bằng NaOH 70% trong 8 giờ ở 800C [16] thu được Chitosan

2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân tốt nhất cho enzyme Neutrase

2.2.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích

hợp

Nguyên liệu đầu tôm

Ép

Khử protein bằng enzyme Neutrase

Dịch ép

Bã ép

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp cho enzyme Neutrase

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp

Nguyên liệu đầu tôm

Ép

Khử protein bằng enzyme Neutrase

- Điều kiện:

Tỷ lệ enzyme/đầu tôm đã xác định

Thời gian: 6 giờ

Dịch ép

Bã ép

2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp cho enzyme Neutrase

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ thích hợp

Nguyên liệu đầu tôm

Khử protein bằng enzyme Neutrase

Điều kiện:

- Tỷ lệ enzyme/đầu tôm đã xác định

- Nhiệt độ thủy phân đã xác định

- Nước/đầu tôm =2/1

- pH = 8 Thời gian thủy phân (giờ):

2.2.2.4 Bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp cho enzyme Neutrase

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp

Nguyên liệu đầu tôm

Khử protein bằng enzyme Neutrase

Bã ép