Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học để khử protein và khoáng chất trong quy trình sản xuất chitin và chitosan từ phế liệu đầu vỏ tôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG --- NGÔ THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ KHOÁNG CHẤT TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN VÀ CHITOSA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

NGÔ THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ

PROTEIN VÀ KHOÁNG CHẤT TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN VÀ CHITOSAN

TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU VỎ TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Nha Trang - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

NGÔ THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ

PROTEIN VÀ KHOÁNG CHẤT TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN VÀ CHITOSAN

TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU VỎ TÔM

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG KHOA SAU ĐẠI HỌC

Nha Trang - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được hoàn thành dưới sự tài trợ của đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thủy sản đánh bắt xa bờ” KC07.02/11-15 Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong các công trình khác

Ngô Thị Phương Thảo

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cám ơn: ThS Lê Phương Chung - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi Trường, Quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và Các cán bộ quản lý phòng thí nghiệm - Trung tâm Thực hành Thí nghiệm đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua

Xin cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Cao đẳng nghề Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được học tập nâng cao trình độ

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

MỤC LỤC

MỤC LỤC v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

DANH MỤC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TRONG CHẾ BIẾN TÔM 3

1.1.1 Giới thiệu chung về nguyên liệu còn lại của tôm 3

1.1.2 Thành phần tính chất của nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm .4

1.1.3 Các hướng tận dụng nguyên liệu còn lại của tôm 6

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN 6

1.2.1 Khái quát về chitin 6

1.2.1.1 Cấu trúc của chitin 7

1.2.1.2 Tính chất của chitin 8

1.2.1.3 Ứng dụng của chitin 9

1.2.2 Khái quát về chitosan 10

1.2.2.1 Cấu trúc của chitosan 10

1.2.2.2 Tính chất của chitosan 10

1.2.2.3 Ứng dụng của chitosan 11

1.2.3 Quy trình sản xuất chitin – chitosan 14

1.2.3.1 Quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng phương pháp hóa học 15

1.2.3.2 Quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng phương pháp sinh học 16

1.2.3.3 Quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng phương pháp kết hợp hóa học và sinh học 17

1.3 TỔNG QUAN VỀ LÊN MEN LACTIC 18

1.4 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS 19

1.5 TỔNG QUAN VỀ ENZYM 21

1.5.1 Giới thiệu về enzym 21

1.5.2 Nguồn thu nhận enzym 22

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym 23

1.5.4 Ứng dụng của enzym 25

1.5.5 Enzym protease 27

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 29

2.1.1 Đầu vỏ tôm 29

2.1.2 Enzym protease và vi khuẩn giống 29

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.2.1 Phương pháp phân tích hóa học 29

2.2.2 Phương pháp phân tích vi khuẩn 30

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 32

2.2.3.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 32

2.2.3.2 Xác định điều kiện thích hợp cho việc sử dụng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 xử lý protein và khoáng chất đầu vỏ tôm 33

2.2.3.3 Xác định điều kiện thích hợp cho việc xử lý đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 44

2.2.3.4 Bố trí thí nghiệm so sánh chế độ sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học giữa 2 chủng vi khuẩn L plantarum và B subtilis 53

2.2.3.5 Nghiên cứu chế độ lên men tối ưu đầu vỏ tôm sử dụng vi khuẩn 56

2.3 HÓA CHẤT- THIẾT BỊ 58

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU: 58

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 59

3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA ĐẦU VỎ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (P VANNAMEI) 59

3.2 NGHIÊN CỨU KHỬ PROTEIN VÀ KHOÁNG CHẤT Ở ĐẦU VỎ TÔM BẰNG VI KHUẨN L PLANTARUM VTCC-B 431 KẾT HỢP VỚI ENZYM ALCALASE 59

3.2.1 Xác định thời gian nhân giống vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 59

3.2.2 Xác định điều kiện thích hợp cho việc xử lý đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 60

3.2.2.1 Xác định tỷ lệ vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 bổ sung 60

3.2.2.2 Xác định thời gian xử lý 62

3.2.2.3 Xác định pH thích hợp 63

3.2.2.4 Xác định tỷ lệ rỉ đường bổ sung thích hợp 64

3.2.3 Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng enzym alcalase 65

3.2.3.1 Xác định tỷ lệ enzym alcalase 66

3.2.3.2 Xác định thời gian khử protein còn lại bằng enzym alcalase 67

3.2.3.3 Xác định pH thích hợp cho hoạt động của enzym alcalase 68

3.2.3.4 Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzym alcalase 69

3.2.4 Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở đầu vỏ tôm bằng HCl 70

3.2.4.1 Xác định nồng độ acid HCl 70

3.2.4.2 Xác định thời gian khử khoáng còn lại trong đầu vỏ tôm bằng acid HCl 71

3.3 NGHIÊN CỨU KHỬ PROTEIN VÀ KHOÁNG CHẤT Ở ĐẦU VỎ TÔM BẰNG VI KHUẨN B SUBTILIS ATCC 6633 KẾT HỢP VỚI ENZYM ALCALASE 72

3.3.1 Xác định thời gian nhân giống vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 72

3.3.2 Xác định điều kiện thích hợp cho việc xử lý đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 74

3.3.2.1 Xác định tỷ lệ vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 bổ sung 74

3.3.2.2 Xác định thời gian xử lý đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 75

3.3.2.3 Xác định pH thích hợp 76

3.3.3 Nghiên cứu khử protein còn lại trong đầu vỏ tôm bằng enzym alcalase 76

3.3.3.1 Xác định tỷ lệ enzym alcalase 77

3.3.3.2 Xác định thời gian khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm 78

3.3.3.3 Xác định pH thích hợp 79

3.3.3.4 Xác định nhiệt độ thích hợp 80

3.3.4 Nghiên cứu khử khoáng còn lại trong đầu vỏ tôm bằng acid HCl 81

3.3.4.1 Xác định nồng độ HCl 81

3.3.4.2 Xác định thời gian thích hợp để khử khoáng chất còn lại trong đầu vỏ tôm bằng acid HCl 82

3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHỬ PROTEIN VÀ KHOÁNG CHẤT CỦA VỎ ĐẦU TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG L PLANTARUM – ALCALASE VÀ PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG B SUBTILIS - ALCALASE 83

3.5 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 85

3.5.1 Xác định mô hình hồi quy 85

3.5.2 Tìm thông số tối ưu của quá trình thủy phân 87 3.6 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH KHỬ PROTEIN VÀ KHOÁNG CHẤT TỪ ĐẦU VỎ

TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG L PLANTARUM

PHỐI HỢP VỚI ALCALASE 88

Từ kết quả nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình khử protein khoáng chất từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng như sau: 88 3.7 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHITIN ĐẦU VỎ TÔM TỪ QUY TRÌNH ĐỀ XUẤT 89

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

NN-PTNT Bộ Nông nghiệp- Phát triển nông thôn

AOAC Association of Official Analytical Chemists

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần trọng lượng của tôm (%) 3

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của vỏ tôm 4

Bảng 1.3 Thành phần hóa học cơ bản của đầu vỏ tôm thẻ chân trắng 5

Bảng 2.1 Quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố theo mô hình Box – Behnken 56

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của quá trình lên men khử protein của vi khuẩn L plantarum 57

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến thật của quá trình lên men khử protein của vi khuẩn L plantarum 58

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (P vannamei) 59 Bảng 3.2 Tiên đoán một số thí nghiệm tối ưu cho quá trình thủy phân 87

Bảng 3.3 Kết quả tối ưu theo tiên đoán và thực nghiệm 87

Bảng 3.4 Kết quả so sánh chitin theo quy trình (*) và quy trình tham khảo 89

Bảng 3.5 Kết quả so sánh chitosan sản xuất theo quy trình (*) và quy trình tham khảo 90

Bảng 3.6 Kết quả cân bằng vật chất quy trình tối ưu sản xuất chitin - chitosan bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn L plantarum kết hợp enzym alcalase cho 100kg nguyên liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng ……… 91

Bảng 3.7 Chi phí thực nghiệm sản xuất chitosan (tính trên 1kg chitosan) sản xuất theo quy trình tham khảo của Trang Sĩ Trung (2010) kết hợp hóa học sinh học ………… 91

Bảng 3.8 Chi phí thực nghiệm sản xuất chitosan (tính trên 1kg chitosan) sản xuất theo quy trình đề xuất………92

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các hướng ứng dụng nguyên liệu còn lại của tôm 6

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của chitin 7

Hình 1.3 Sự sắp xếp của chuỗi polyme của α-chitin, β-chitin, γ-chitin 8

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của chitosan 10

Hình 2.1 Sơ đồ hoạt hóa chủng vi khuẩn L Plantarum (VTCC-B 431) 30

Hình 2.2 Sơ đồ hoạt hóa chủng vi khuẩn B subtilis (ATCC 6633) 31

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 32

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn L plantarum bổ sung đến HQKK – HQKP đầu vỏ tôm 34

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý đến HQKK – HQKP đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 35

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH môi trường tới HQKK – HQKP đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 36

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường bổ sung đến HQKK – HQKP đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 37

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ enyzme alcalasebổ sung đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm 38

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân bằng enzym alcalase đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm 39

Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm 40

Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm 41

Hình 2.12 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ acid HCl đến HQKK còn lại trên đầu vỏ tôm 42

Hình 2.13 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến HQKK còn lại trên đầu vỏ tôm bằng acid HCl 43

Hình 2.14 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 bổ sung đến HQKP đầu vỏ tôm 44

Hình 2.15 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý đến HQKP

của vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 45

Hình 2.16 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến HQKP của vi

khuẩn B subtilis ATCC 6633 46

Hình 2.17 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ enzym alcalase bổ sung đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm 47 Hình 2.18 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân bằng enzym alcalase đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm 48 Hình 2.19 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm bằng enzym alcalase 49 Hình 2.20 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm bằng enzym alcalase 50 Hình 2.21 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ acid HCl đến HQKK còn lại trên đầu vỏ tôm 51 Hình 2.22 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến HQKK còn lại trên đầu vỏ tôm bằng acid HCl 52 Hình 2.23 Sơ đồ bố trí thí nghiệm so sánh khả năng khử protein và khoáng chất giữa 2

chủng vi khuẩn L plantarum và B subtilis 53

Hình 2.24 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý acid HCl trong khử khoáng 54 Hình 2.25 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý acid HCl trong khử khoáng 55

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến sự sinh trưởng vi khuẩn L plantarum

VTCC-B 431 60

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 bổ sung đến

HQKK – HQKP đầu vỏ tôm 61 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến HQKK – HQKP đầu vỏ tôm bằng vi

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym alcalase bổ sung đến HQKP còn lại trên đầu vỏ

tôm đã xử lý bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 66

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân bằng enzym alcalase đến HQKP còn lại trên đầu

vỏ tôm đã xử lý bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 67

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH môi trường đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm đã xử lý

vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 và enzym alcalase) bằng acid HCl 72

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến sự sinh trưởng của 73

vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 73 Hình 3.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 bổ sung đến HQKP

enzym alcalase 79 Hình 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến HQKP còn lại trên đầu vỏ tôm bằng enzym alcalase) 80 Hình 3.20 Ảnh hưởng của tỷ lệ acid HCl đến HQKK còn lại trên đầu vỏ tôm 81 Hình 3.21 Ảnh hưởng của thời gian đến HQKK còn lại trên đầu vỏ tôm bằng acid HCl 82 Hình 3.22 So sánh hiệu quả khử protein, khoáng ở đầu vỏ tôm giữa công đoạn sử

dụng vi khuẩn L plantarum và sử dụng B subtilis 83

Hình 3.23 So sánh hiệu quả khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm ở công đoạn sử

dụng enzym alcalase - HCl giữa quy trình sử dụng vi khuẩn L plantarum và quy trình

sử dụng B subtilis ATCC 6633 84

Hình 3.24 Đồ thị đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và nồng độ

vi khuẩn đến HQKP của vi khuẩn L plantarum 86

Hình 3.25 Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và nồng độ vi khuẩn đến

HQKP của vi khuẩn L plantarum 86

Hình 3.26 Đồ thị đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian

lên men đến HQKP của vi khuẩn L plantarum 86

Hình 3.27 Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên men đến

HQKP của vi khuẩn L plantarum 86

Hình 3.28 Sơ đồ quy trình khử protein và khoáng chất từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng

(P vannamei) bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 phối hợp với enzym alcalase

và HCl………88

MỞ ĐẦU

Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đã tăng trưởng mạnh trong những năm gần đây

và trở thành lĩnh vực xuất khẩu đứng hàng thứ 3 sau dầu khí và dệt may Trong xuất khẩu thuỷ sản, tôm là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, chiếm tỷ trọng lớn Theo Tổng cục Thủy sản (Bộ NN – PTNT), năm 2013 là một năm thắng lợi của xuất khẩu thủy sản khi xuất khẩu thuỷ sản vẫn tiếp tục duy trì tốc độ tăng trưởng Đặc biệt, Việt Nam đứng thứ ba thế giới về xuất khẩu tôm và lần đầu tiên xuất khẩu tôm thẻ chân trắng đã vượt tôm sú cả sản lượng và giá trị xuất khẩu Giá trị xuất khẩu tôm đạt 2,5 tỷ USD, tăng gần 33% so với cùng kỳ 2012 và chiến 44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản Cùng với sự gia tăng khối lượng thịt tôm xuất khẩu thì cũng có một lượng lớn phế liệu đầu

vỏ tôm được tạo thành.Trong đầu vỏ tôm thường chứa protein, astaxanthin, … và đặc biệt là chitin - một polymer sinh học chiếm tỷ trọng lớn trong thành phần của đầu vỏ tôm Từ chitin, thực hiện quá trình deacetyl, người ta có thể sản xuất ra chitosan Do vậy đầu vỏ tôm thường được tận dụng để sản xuất chitosan - một loại polymer có nhiều ứng dụng trong thực tế như: công nghiệp dệt nhuộm, giấy, sản xuất thực phẩm chức năng giúp tăng thải mỡ ngăn chặn béo phì, sản xuất glucosamine - chất hỗ trợ điều trị đau khớp, chất điều hòa sinh trưởng cho cây,

Công nghệ sản xuất chitin và chitosan từ đầu vỏ tôm theo phương pháp hóa học dùng HCl và NaOH để khử tạp chất ra khỏi đầu vỏ tôm có nhược điểm là ô nhiễm môi trường và các sản phẩm phụ của quá trình sản xuất như protein, astaxanthin tách ra từ đầu vỏ tôm thường lẫn với hoá chất nên việc tận dụng gặp nhiều khó khăn Do vậy những năm gần đây các nhà nghiên cứu tập trung vào việc nghiên cứu sử dụng các tác nhân sinh học như enzym, vi sinh vật để khử protein từ đầu vỏ tôm trong sản xuất chitin – chitosan với mong muốn protein, astaxanthin tách ra từ đầu vỏ tôm có thể sử cho các lĩnh vực khác như ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi động vật thuỷ sản hay

sử dụng trong chăn nuôi Vì vậy tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sử dụng phương

pháp sinh học để khử protein và khoáng chất trong quy trình sản xuất chitin và chitosan từ phế liệu đầu vỏ tôm” là cần thiết

Mục đích của đề tài: đánh giá khả năng khử protein và khoáng chất bằng

phương pháp sinh học sử dụng phối hợp vi khuẩn và enzym alcalase

Nội dung của đề tài

1) Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình khử protein và khoáng chất từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp lên men sử dụng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 hoặc B subtilis ATCC 6633 phối hợp với enzym alcalase

2) Đánh giá khả năng khử protein và khoáng chất từ đầu vỏ tôm thẻ bằng phương pháp sinh học sử dụng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 phối hợp với enzym alcalase và phương pháp sử dụng B subtilis ATCC 6633 phối hợp với enzym alcalase

3) Đề xuất quy trình khử protein và khoáng chất từ đầu vỏ tôm thẻ trong sản xuất chitin và chitosan

 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

+ Ý nghĩa khoa học của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về việc ứng dụng công nghệ sinh học (enzym protease phối hợp với vi khuẩn) trong quá trình khử protein, khoáng chất từ đầu vỏ tôm Do vậy nội dung nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa cao về khoa học

+ Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học để triển khai sản xuất chitin - chitosan

theo quy trình sử dụng phối hợp vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 và enzym

alcalase Đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao do protein và khoáng chất tách từ đầu vỏ tôm không chứa các hóa chất nên có thể tận dụng trong sản xuất thức ăn nuôi động vật

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TRONG CHẾ BIẾN TÔM 1.1.1 Giới thiệu chung về nguyên liệu còn lại của tôm [18]

Nguyên liệu còn lại của tôm sau chế biến chủ yếu là đầu, vỏ và đuôi tôm, ngoài

ra còn có phần thịt vụn do bóc nõn không đúng quy trình kỹ thuật, tuy nhiên phần này cũng không đáng kể Tùy thuộc vào từng loài, sản phẩm chế biến khác nhau mà NLCL của tôm thu được là khác nhau Trong thành phần NLCL, phần đầu thường chiếm khoảng 35 ÷ 45% trọng lượng tôm nguyên liệu, phần vỏ chiếm 10 ÷ 15% Tuy vậy tỷ

lệ này còn phụ thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng và công đoạn chế biến, tham khảo ở bảng sau:

Bảng 1.1 Thành phần trọng lượng của tôm (%) [18]

Loại tôm Tôm vỏ bỏ đầu Tôm thịt Đầu tôm Vỏ tôm

52,05 53,62 52,84 48,60 41,45 47,43 49,02 46,49 48,04 39,15 31,61 22,20 30,74

29,80 28,00 31,40 33,90 33,14 31,85 31,55 33,20 31,75 42,38 51,95 63,40 52,02

10,00 9,00 8,90 10,40 11,27 11,07 12,15 12,20 13,07 11,62 8,56 5,50 12,57

Theo thống kê của tổ chức lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) thì sản lượng tôm trên thế giới khoảng trên dưới 4 triệu tấn/năm Hầu hết sản lượng tôm trên thế giới từ các nước đang phát triển như: Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam,

Ecuado, Malaysia, Ấn Độ, Indonexia Theo đó tạo ra một lượng NLCL tôm rất lớn, ước tính khoảng 1,6 ÷ 2 triệu tấn/năm

Năm 2008, Việt Nam đứng đầu thế giới về nuôi tôm sú, tôm sú là đối tượng nuôi rất quan trọng trong lĩnh vực nuôi trồng và chế biến xuất khẩu ở nước ta (chủ yếu tập trung ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long chiếm trên 90% sản lượng) Trong thời gian gần đây, nghề nuôi tôm thẻ chân trắng thương phẩm phát triển mạnh, sản lượng chế biến ngày càng lớn nên nguồn NLCL của tôm thẻ chân trắng trở thành nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin và chitosan, nhất là các tỉnh miền Trung

1.1.2 Thành phần tính chất của nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm [18]

Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu vỏ tôm là protein, chitin, khoáng, enzym, sắc tố, lipid… tỷ lệ giữa các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo đặc điểm sinh thái, sinh lý, loài…

Thành phần hóa học (%) của vỏ tôm được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của vỏ tôm [18]

STT Thành phần Hàm lượng % trong

vỏ tôm tươi

Hàm lượng % trong vỏ tôm khô

12,25 8,05 4,50 Chưa xác định

45,16 23,25 27,50 Chưa xác định

- Protein trong đầu tôm tồn tại ở 2 dạng:

+ Dạng tự do: Dạng này tồn tại trong nội tạng tôm và trong cơ thịt

+ Dạng liên kết: Đây là protein không hòa tan, thường liên kết với chitin, canxicarbonate, với lipid tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo thành proteincarotenoid… tạo nên tính bền vững của đầu vỏ tôm

Thành phần protein tôm chủ yếu là các acid aspartic, acid glutamic, phenylalanine, lysine, arginine [41]

Enzym: Trong đầu tôm chứa một lượng đáng kể enzym protease, theo tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 5/1993) thì hoạt độ enzym protease trong đầu

tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi Ngoài ra còn có enzym alkaline phosphatese, chitinase, -N-acetyl glucosamidase Enzym nội tại tôm hoạt động ổn định trong môi trường trung tính, môi trường kiềm, không ổn định trong môi trường acid

Ngoài ra trong nội tạng tôm trưởng thành ở bờ biển Kenya chứa enzym Chymotripsin, Trypsin và Elastase Trong đó pH hoạt động tối ưu của Trypsin là 7,5 ÷ 8,0; Chymotrypsin 7,2 ÷ 7,8; Elastase 6,8 ÷ 8,0 [49][50]

Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác, chủ yếu CaCO3, đây là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tôm Chính sự liên kết này gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế

- Khoáng: Trong thành phần đầu vỏ tôm có chứa một lượng muối vô cơ chủ yếu

là CaCO3 Ngoài ra còn chứa Ca, Fe, Cu, Mn [43]

- Astaxanthin: Là sắc tố chủ yếu trong đầu vỏ tôm, đây là dẫn xuất của caroten, thường liên kết khá bền với acid béo hoặc protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh đặc trưng cho tôm, nhờ liên kết này mà astaxanthin được bảo vệ Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị tách ra khỏi đầu vỏ tôm và bị oxy hóa thành astaxin

- Lipid: Chứa một hàm lượng nhỏ, chủ yếu gồm các acid béo chưa no bão hòa như eicosapentaenoic (EPA), decosahexaenoic (DHA) Đây là những acid béo có lợi cho sức khỏe con người và có nhiều ứng dụng khác trong y học

Theo nghiên cứu của Trang Sĩ Trung và các cộng sự (2007) đối với tôm thẻ chân

trắng (Penaaus vannamei) thì hàm lượng chitin chiếm 18%, protein chiếm tỷ lệ khá

cao gần 50%, thành phần hóa học của đầu vỏ tôm thẻ chân trắng được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 1.3 Thành phần hóa học cơ bản của đầu vỏ tôm thẻ chân trắng

130 ± 13,9

1.1.3 Các hướng tận dụng nguyên liệu còn lại của tôm [7]

Nguyên liệu còn lại của tôm có thể được tận dụng để thu hồi chitin, enzym protease, astaxanthin, protein, khoáng được thể hiện qua sơ đồ sau:

Hình 1.1 Các hướng ứng dụng nguyên liệu còn lại của tôm

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN

1.2.1 Khái quát về chitin [18][27]

Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên chỉ đứng sau cellulose Quá trình sinh tổng hợp chitin trong sinh quyển rất lớn từ nhiều loài động

NLCL của tôm Chiết rút enzym Thức ăn gia súc

Khử protein

Công nghiệp dược

Thu hồi protein, khoáng

ăn gia súc

Công nghiệp thực phẩm

Ứng dụng trong xử lý môi trường

Ứng dụng trong y học

Ứng dụng trong công nghệ sinh học

thực vật khác nhau Chỉ tính riêng loài giáp xác trong thủy quyển, ước tính khối lượng chitin sinh tổng hợp mỗi năm khoảng 2,3x109 tấn (Jeuniaux và cộng sự, 1993)

Đối với cơ thể động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một

số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn Trong thế giới thực vật chitin có ở thành tế bào của một số nấm và tảo như: nấm Zygemycether, một số tảo Chlorophiceae, nấm bất toàn (Fugiimperfecti), tảo khuẩn (Phycomycetes)…

Trong động vật thủy sản đặc biệt trong vỏ tôm, cua ghẹ và xương mực thì hàm lượng chitin chiếm tỷ lệ cao từ 14 ÷ 35% so với trọng lượng khô Vì vậy, vỏ tôm, cua ghẹ, xương mực là nguồn nguyên liệu tiềm năng sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng

1.2.1.1 Cấu trúc của chitin

Chitin là một polysaccharide được cấu tạo bởi các monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu nối 1,4 – glucosid, có công thức phân tử là (C8H13O5N)n Trong đó n thay đổi tùy thuộc vào từng loại nguyên liệu

Ở tôm thẻ: n = 400 ÷ 500

Ở tôm hùm: n = 700 ÷ 800

Ở cua: n = 500 ÷ 600

Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n

Chitin có công thức hóa học giống cellulose và có thể coi là một dẫn xuất của cellulose với nhóm acetamido ở cacbon số 2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của chitin

Chitin được được tách chiết đầu tiên vào năm 1811 bởi nhà dược hóa học người Pháp Henri Braconnot từ nấm (Braconnot, 1811) [27]

Người ta chia cấu trúc chitin thành ba dạng α – chitin, β – chitin, γ – chitin Các

dạng này của chitin do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N – acetyl –

D – glucosamin) trong mạch chitin Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì cấu trúc α, β, γ – chitin được mô tả như sau:

Hình 1.3 Sự sắp xếp của chuỗi polyme của α-chitin, β-chitin, γ-chitin

Cấu trúc của chitin ở các dạng trên xuất phát từ nguồn chiết rút chitin, chitin từ tôm và cua có dạng α – chitin, còn chitin từ mực có dạng β – chitin Ba dạng chitin nêu trên có sự khác nhau về tính hydrat hóa, kích thước của mỗi đơn vị cấu trúc và số mạch chitin trong mỗi đơn vị cấu trúc

α – chitin có độ rắn phân tử cao nhất và ở dạng rắn chắc, các mạch chitin sắp xếp song song nhưng ngược chiều nhau, ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững

β – chitin bao gồm các mạch chitin song song cùng chiều nhau, có độ rắn chắc thấp, tính hydrat hóa cao

γ – chitin sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều thì có một mạch ngược chiều Dạng β – chitin có thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn Trong tự nhiên, α – chitin có mặt nhiều nhất và thường rất cứng trong khi β – chitin, γ – chitin thì tạo nên độ dai, dẻo

1.2.1.2 Tính chất của chitin

Chitin có màu trắng, chitin có tính kỵ nước cao (đặc biệt đối với α – chitin), không hòa tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng và các dung dịch hữu cơ như este, rượu Tính không tan của chitin là do chitin có cấu trúc chặt chẽ, có liên kết trong và liên kết phân tử mạnh thông qua các nhóm hydroxyl và acetamide Tuy nhiên,

β – chitin lại có tính trương nở với nước cao

Hoà tan được trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat Liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo

Ổn định với chất chống oxy hóa KMnO4, nước Javen, NaClO… người ta lợi dụng tính chất này để sử dụng các chất trên để khử màu cho chitin

Kết tinh ở dạng tinh thể vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac và trong thuốc thử Schweizei sapanora Điều này có thể do nhóm amino acid ( -NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết

Có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884 ÷ 890µm

Bị enzym lyzozyme – một enzym chỉ có trên cơ thể người phân giải thành N – acetyl – D – Glucosamine

Khi đun nóng chitin trong dung dịch HCl đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo thành các phân tử glucosamin có hoạt tính sinh học cao

Khi đun nóng chitin trong NaOH đậm đặc tạo thành chitosan (C6H11O4)n

1.2.1.3 Ứng dụng của chitin

Chitin được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, một số ứng dụng quan trọng:

- Dùng làm phân bón trong nông nghiệp và bổ sung vào thức ăn cho gia súc

- Dùng trong ngành dệt: Làm cho vải hoa, tơ sợi bền màu, bền sợi, chịu được cọ xát

- Làm chất chống nước: Vải sợi sau khi xử lý bằng chitin ngoài tính năng chống nước, còn có tính năng khác như: chống lửa, cách nhiệt, chịu nắng, chống thối, những tính chất đó làm cho chitin có khả năng dùng làm nguyên liệu để sản xuất vải bao dây điện, những dụng cụ bảo hộ trong sản xuất, nghiên cứu

- Dùng trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất giấy trong suốt và màng mỏng

Vi thể chitin là chất tạo gel hay chất làm đặc để tạo liên kết, ổn định và tăng cường kết cấu thực phẩm, dùng làm màng mỏng có thể thay thế polyetylen để sản xuất giấy bọc thực phẩm cao cấp

- Sản xuất sợi chitin không tan trong acid, có độ dai tăng rõ rệt, không độc, ứng dụng làm chỉ khâu tự tiêu trong y học

- Dùng làm màng mỏng polymer sinh học chữa lành vết thương, vết bỏng và dùng trong phẫu thuật vá da

- Chitin kết hợp với muối kim loại tạo thành hợp chất liên hợp, nếu kết hợp với muối của Pb, Cd, Zn tạo thành cellulose, loại cellulose này có tính năng chống tia phóng xạ (chủ yếu là α, β – chitin), mở ra con đường mới cho việc sử dụng chitin

- Xử lý bùn thải công nghiệp: Chitin có khả năng thu giữ các kim loại nặng, các cao phân tử linh động và các nhóm amin hoạt tính cao được sử dụng như mạng cố định Sau khi xử lý bùn thải bằng chitin, kim loại nặng có thể được giải hấp bằng các acid để thu hồi Việc sử dụng chitin có nguồn gốc từ vỏ tôm để khử kim loại nặng trong công nghiệp không những giúp làm giảm lượng chất thải độc hại ra môi trường

mà còn giúp giải quyết lượng lớn phế liệu thủy sản

- Ngoài ra từ chitin còn có thể sản xuất các dẫn xuất quan trọng: chitosan, glucosamine, Các dẫn xuất sinh học này được ứng dụng rộng rãi và phổ biến trong nhiều lĩnh vực

1.2.2 Khái quát về chitosan

1.2.2.1 Cấu trúc của chitosan

Khi đun nóng chitin trong NaOH đậm đặc thì chitin bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan (C6H11O4N)n, Phân tử lượng Mchitosan = (161,07)n

Chitosan là dạng N-deacetyl của chitin, khi deacetyl chitin bằng kiềm đặc ta thu được chitosan, chitosan là một polymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β –

D glucosamine liên kết với nhau nhờ cầu nối β – 1,4 glucosid

Công thức cấu tạo của chitosan:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của chitosan 1.2.2.2 Tính chất của chitosan

Chitosan là chất rắn xốp, nhẹ, ở dạng bột có màu trắng ngà, ở dạng vảy có màu trắng trong hơi vàng

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hòa tan trong nước, kiềm, cồn nhưng tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic pKa của chitosan có giá trị 6,2 ÷ 6,8 Khi hòa tan chitosan trong môi trường acid loãng tạo thành keo dương Đây là một đặc điểm đặc biệt vì đa số các keo

polysaccharid tự nhiên tích điện âm Chitosan tích điện dương sẽ có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với các polymer tích điện âm

Chitosan có khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang DNA, khả năng này phụ thuộc rất lớn vào DD (độ deacetyl hóa) Chitosan có DD cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức kim loại tốt hơn Tương tự khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl trên 90%

Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể

1.2.2.3 Ứng dụng của chitosan [27]

 Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm chitosan là hợp chất polymer tự nhiên an toàn với những tính chất đặc trưng như khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, tạo màng, tạo gel, hấp phụ màu, làm trong dịch quả… vì vậy chitosan được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực công nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm

- Ứng dụng chitosan trong bảo quản trái cây, rau

Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt, màng chitosan là màng bán thẫm nên có khả năng làm thay đổi thành phần các chất khí trong môi trường bảo quản, ức chế quá trình hô hấp, hạn chế quá trình biến nâu của rau quả Hơn nữa màng chitosan còn có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn làm giảm sự hư hỏng rau quả do vi sinh vật

Chitosan được ứng dụng trong bảo quản nhiều loại rau quả như vải, dâu, xoài, chuối, táo, cà rốt, na… Theo Jiang và cộng sự (2005) vải và nhãn có giá trị kinh tế nhưng thời gian bảo quản ngắn do dễ bị biến nâu vỏ nên sử dụng màng chitosan sẽ hạn chế quá trình oxy hóa các hợp chất phenol, kéo dài thời gian bảo quản

Đối với những loại quả mềm như dâu, hồng, cà chua để tăng độ cứng của vỏ trong quá trình bảo quản, chitosan được bổ sung với canxi trong quá trình tạo màng, chitosan gây trở ngại cho sự dịch chuyển ẩm từ trong quả ra môi trường ngoài hạn chế

sự mất nước, hao hụt khối lượng và làm giảm cường độ hô hấp của quả trong quá trình bảo quản [19][20][39]

Chitosan không những có hiệu quả khi bảo quản nguyên quả tươi mà còn có hiệu quả khi bảo quản quả cắt lát như thanh long, chuối, xoài, cà rốt cắt lát Chitosan giúp hạn chế sự mất nước, làm chậm sự biến đổi màu sắc, mùi vị tăng hàm lượng chất rắn hoà tan và hàm lượng Vitamin C, ức chế được vi khuẩn lactic, coliforms tổng số [32][33]

- Ứng dụng chitosan trong bảo quản và chế biến thịt, cá, đậu phụ, bánh mì

Thịt và các sản phẩm từ thịt rất dễ bị hư hỏng do vi sinh vật và quá trình oxy hóa lipid do đó các chất bảo quản thịt cần phải có cả hai đặc tính kháng khuẩn và chống oxy hóa lipid Chitosan có tính kháng khuẩn và hạn chế quá trình oxy hóa lipid nên được dùng để bảo quản thịt nhằn hạn chế sự hư hỏng của thịt.Ngoài ra đối với sản phẩm thịt bò tươi, chitosan tạo màng bao làm giảm đáng kể lượng vi sinh vật trên bề mặt thịt bò khi bảo quản ở nhiệt độ 0 ÷ 50C [16][42][48]

Quá trình cấp đông chậm sẽ làm tăng hao hụt trọng lượng của sản phẩm thủy sản

Để khắc phục hiện tượng này chitosan được sử dụng làm màng bao[11]

Đối với thủy sản khô, khi được nhúng vào dung dịch chitosan 2% trong acid acetic 1,5% làm khô ở 300C thì có thể bảo quản tốt ở nhiệt độ thường Cụ thể đối với mực một nắng, chitosan được sử dụng để tạo màng bao hạn chế sự mất nước và ức chế sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt sản phẩm trong quá trình bảo quản, ngoài ra khi bảo quản bằng chitosan thì sản phẩm có cảm quan tốt hơn so với mẫu không xử lý [21]

Chitosan còn được ứng dụng trong quá trình sản xuất bánh mì, trứng nhờ khả năng kháng khuẩn và tạo màng bao chống mất nước, các sản phẩm này được bao bởi chitosan 1% thì có chất lượng tốt hơn so với mẫu đối chứng [30][31]

- Ứng dụng chitosan làm trong nước quả

Trong công nghệ sản xuất nước quả, làm trong nước quả là một bước quan trọng để thu được sản phẩm có độ trong, sáng, màu sắc đẹp Chitosan là một chất keo tụ, tạo bông nên làm giảm độ đục của nước ép hoa quả do chitosan có ái lực tốt đối với hợp chất polyphenol như catechin, proanthocyanidin, cinnamic acid và các dẫn xuất của chúng

 Ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp [34][47]

Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để tăng cường sự hoạt động của vi sinh vật có lợi trong đất, bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất và tăng cường khả năng nẩy mầm của hạt, kích thích sinh trưởng và

tăng năng suất thu hoạch Đặc biệt, chitosan còn đóng vai trò là chất kích thích hệ miễn dịch của cây và sự hoạt động của enzym chitinase

 Ứng dụng của chitosan trong thủy sản [24]

Trong lĩnh vực thủy sản đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng chitosan đặc biệt ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Chitosan được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, kích thích sinh trưởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trường Ngoài ra, chitosan còn ứng dụng làm màng bao, chất kết dính để tăng độ ổn định của thức ăn tôm Thông thường lượng chitosan sử dụng khoảng 0,1% so với lượng thức ăn, không nên sử dụng hàm lượng chitosan cao vì thức ăn sẽ cứng, động vật thủy sản gặp khó khăn khi ăn Ngoài ra cần chọn chitosan có DD cao thì màng bao ổn định và giúp cải thiện môi trường nước, giảm thiểu ô nhiễm do thức ăn tan gây ra, cá phát triển tốt hơn

 Ứng dụng của chitosan trong xử lý môi trường

Chitosan được ứng dụng khá phổ biến trong xử lý môi trường nhờ khả năng hấp phụ, tạo phức với kim loại (Pb, Hg, Cd, Fe, Cu…), các chất màu, khả năng keo tụ, tạo bông với các chất hữu cơ

Chitosan có khả năng hấp phụ nhiều ion kim loại nặng nhờ các nhóm amin của chitosan có ái lực mạnh và có thể hình thành phức với các kim loại này Khi sử dụng chitosan để hấp phụ kim loại cần chú ý đến loại chitosan (nên chọn chitosan có DD cao), pH môi trường (với dung dịch nước thải có pH = 5,0 ÷ 5,5 thì khả năng hấp phụ

Pb2+, Cu2+ của chitosan là tốt nhất) Khi xử lý kim loại nặng bằng chitosan thì thông thường chitosan được sử dụng ở dạng hạt, vi hạt hoặc màng

Chitosan được xem như là tác nhân thu hồi protein từ nước thải của ngành công nghiệp thực phẩm Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm sử dụng chitosan để thu hồi protein từ nước rửa surimi, dịch thải máu cá, nước thải trong quá trình chế biến cá, chế biến sữa… Cơ chế thu hồi protein bằng chitosan dựa trên tương tác tĩnh điện của các nhóm amino trên chitosan với các nhóm anion trên các phân tử protein và khả năng hấp phụ của chitosan Trong dung dịch các nhóm amino của chitosan tích điện dương nên có thể hấp phụ nhiều polymer tích điện âm như alginate, carragennan, pectin

Trong công nghiệp dệt nhuộm tạo ra một lượng lớn các chất màu trong nước thải gây ô nhiễm nghiêm trọng Một trong những phương pháp để nâng cao hiệu quả xử lý

chất màu là dùng phương pháp hấp phụ lên các polymer, mà các polymer sinh học có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng thì chitosan có khả năng xử lý cao, hấp phụ được nhiều chất màu khác nhau Khả năng hấp phụ chất màu của chitosan phụ thuộc vào tính chất của chất màu, nồng độ chất màu trong nước thải, đặc điểm nước thải (nhiệt

độ, pH…), thời gian xử lý, phương pháp xử lý và tính chất của bản thân chitosan (kích thước hạt, DD, phân tử lượng, độ rắn phân tử, độ trương) [46]

 Ứng dụng của chitosan trong y học và công nghệ sinh học

 Ứng dụng chitosan trong y học

Do tính chất tương thích sinh học và tự hủy sinh học cao nên chitosan được nghiên cứu và thử nghiệm trong rất nhiều lĩnh vực kiểm soát và vận chuyển thuốc Các dạng ứng dụng chính của chitosan thường ở dạng vi hạt, hạt nano và nhũ dịch Các loại thuốc đã được thử nghiệm với chitosan như insulin, 5 – flourouracil, thuốc chống ung thư, kháng viêm…Để tăng độ ổn định, khả năng trương nở, giảm độ rắn của hạt chitosan, một số phụ gia được sử dụng như polyethylene glycol, polyphosphate, glycine… Ngoài ra chitosan còn được ứng dụng làm chất chống đông máu và chất làm lành vết thương do khả năng tương thích sinh học với máu và chịu được sự thủy phân của enzym lysozyme Trong lĩnh vực kiểm soát cân nặng cơ thể thì chitosan được xem

là chất giảm béo rất tốt, chitosan có khả năng ngăn cản sự hấp thụ mỡ trong cơ thể, làm giảm lượng cholesterol trong máu

 Ứng dụng chitosan trong công nghệ sinh học

Chitosan có tính chất tương thích sinh học cao, tự hủy sinh học, kháng nấm, kháng khuẩn, tạo màng, tạo gel, có nguồn gốc sinh học nên được ứng dụng trong công nghệ sinh học như trong nuôi cấy mô, cố định tế bào, làm chất mang DNA trong kỹ thuật liệu pháp gene, chất kháng khuẩn, kháng nấm sinh học, cảm biến sinh học

Chitosan được ứng dụng trong rất nhiều ngành và lĩnh vực, theo đó công nghệ sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn là rất phức tạp đòi hỏi qua nhiều công đoạn tinh sạch Do đó cần nhiều công trình nghiên cứu kỹ và sâu quá trình sản xuất chitin – chitosan đạt tiêu chuẩn chất lượng phù hợp cho các lĩnh vực yêu cầu độ tinh sạch cao

1.2.3 Quy trình sản xuất chitin – chitosan

Chitin có thể được chiết rút từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như vỏ tôm,

vỏ cua ghẹ, nấm mốc, vi khuẩn, sâu bọ… Tuy nhiên, hiện nay chitin – chitosan chủ

yếu được thu nhận từ nguồn NLCL thủy sản đặc biệt là đầu vỏ tôm do chứa hàm lượng chitin cao Chitin trong nguyên liệu thường liên kết với protein, khoáng nên trong quá trình sản xuất chitin cần phải loại bỏ các chất phi chitin này ra khỏi chitin Hiện nay có

3 phương pháp để sản xuất chitin: phương pháp hóa học, phương pháp sinh học, phương pháp kết hợp hóa học và sinh học

1.2.3.1 Quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng phương pháp hóa học

Hiện nay các quá trình sản xuất chitin – chitosan trên quy mô công nghiệp tại Việt Nam chủ yếu bằng phương pháp hóa học, phương pháp này chủ yếu sử dụng NaOH để khử protein, HCl để khử khoáng Ưu điểm của phương pháp hóa học là thời gian xử lý để thu chitin nhanh (thường chỉ mất 36 ÷ 40h) Tuy nhiên giá thành cao do chi phí hóa chất để xử lý, đặc biệt lượng dịch thải ra trong quá trình sản xuất có tính acid hoặc kiềm nên có tính ăn mòn cao, trực tiếp phá hủy môi trường và ảnh hưởng đến hệ sinh thái, ngoài ra chưa có biện pháp thu hồi các chất có giá trị trong dịch thải Theo quy trình sản xuất của Pháp đầu vỏ tôm được xử ly bằng NaOH 3,5% trong 2h ở 650C để khử protein, sau đó khử khoáng bằng HCl 1N ở nhiệt độ phòng trong 2h; tiếp tục khử màu bằng aceton và NaOCl 0,135% ở nhiệt độ phòng Quy trình trên cho thấy thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố Tuy nhiên, do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polymer, do đó độ nhớt của sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao [18]

Nghiên cứu của Stevens, Viện Công Nghệ Châu Á (AIT) (2002) đầu vỏ tôm được khử protein bằng NaOH 2,5% ở nhiệt độ 300C trong 24h, sau đó khử khoáng bằng HCl 2,5% ở cùng nhiệt độ trong 12h, sản phẩm chitin có hàm lượng khoáng và protein < 1% Quy trình này tiết kiệm được lượng xút và acid đáng kể, tránh việc cắt mạch chitosan nên sản phẩm có màu sáng, hàm lượng khoáng và protein thấp, DD tương đối cao (84 ÷ 88%) [27]

Theo nghiên cứu của Trần Thị Luyến (2004), đầu vỏ tôm được khử khoáng bằng HCl 10%, 12h, nhiệt độ phòng; khử protein bằng NaOH 8%, trong 12h, nhiệt độ phòng; deacetyl bằng NaOH đặc 35 ÷ 40%, nhiệt độ 80 ÷ 1000C trong thời gian 5 ÷ 6,5h Đây là quá trình nghiên cứu đầy đủ về ảnh hưởng của chế độ xử lý deacetyl đến

chất lượng chitosan, có ý nghĩa đáp ứng được yêu cầu thực tế sử dụng chitosan rất đa dạng tùy vào mục đích sử dụng mà cần có độ nhớt và DD khác nhau [15]

Phương pháp hóa học có một số hạn chế nhất định Việc sử dụng kiềm và acid

có thể thủy phân cắt mạch polymer, sản phẩm chitin thu được có chất lượng thấp không ứng dụng được trong các ngành sản xuất yêu cầu độ tinh sạch cao như sinh học,

y dược, thực phẩm Hơn nữa việc sử dụng hóa chất nhiều gây độc hại, ăn mòn thiết bị, không tận thu được các chất có giá trị kinh tế như astaxanthin, protein, canxi…, gây ô nhiễm môi trường

1.2.3.2 Quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng phương pháp sinh học Đây là phương pháp đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Phương pháp này sử dụng enzym protease khử protein, sử dụng vi khuẩn lên men khử khoáng Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như: giảm đáng kể lượng hóa chất sử dụng, mạch chitin có độ dài tối đa và trọng lượng phân tử cao, hạn chế sự ảnh hưởng môi trường đặc biệt phương pháp này cho phép thu hồi các thành phần có giá trị khác như protein, astaxanthin Ngoài ra còn có thể kết hợp khử khoáng và khử protein trong cùng một bước do nhiều vi sinh vật sinh enzym có khả năng sinh acid

Nghiên cứu sản xuất chitin bằng phương pháp lên men vi sinh Kết quả cho thấy,

đầu vỏ tôm được lên men với 10% L plantarum cấy vào, bổ sung 5% glucose, pH điều

chỉnh bằng acid acetic thì hiệu suất khử protein là 75%, khử khoáng là 86% Nếu thay thế acid acetic bằng acid citric thì hiệu suất khử protein là 88% và khử khoáng là 90% [54] W.J Jung và cộng sự (2007) đã sản xuất chitin từ phế liệu vỏ cua đỏ bằng quá

trình lên men bởi vi khuẩn L paracasei subsp tolerans KCTC-3074 và Serratia

marcescens FS-3 Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 7 ngày pH khi sử dụng L 3074,

FS-3, L 3074 + FS-3 (1:1) giảm từ 6,9 xuống 3,3; 5,88; 3,48 Chất tro còn lại sau khi lên men sử dụng L 3074, L 3074 + FS-3 (1:1) giảm mạnh tương ứng từ 41,2% xuống 3,19%; 1,15% Khi sử dụng L 3074 + FS-3 (1:1) thì mức độ khử khoáng đạt giá trị cao nhất lên đến 97,2% nhưng khử protein chỉ đạt được 52,6% còn nếu sử dụng FS-3 thì lượng protein từ 22,4% giảm xuống còn 3,62% [38]

Oh và cộng sự (2007) đã nghiên cứu ứng dụng chủng vi sinh vật Pseudomonas

aeruginosa F722 trong quá trình khử khoáng và protein từ vỏ cua để sản xuất chitin

Hiệu quả của quá trình khử khoáng đạt 92% và khử protein đạt 63% sau 7 ngày lên men trong môi trường bổ sung 10% glucose ở 300C [49]

Đối với nghiên cứu trong nước kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ vi khuẩn Bacillus planaturum là 15%, tỷ lệ rỉ đường bổ sung vào 15%, thời gian lên men 7 ngày

ở nhiệt độ phòng thì hàm lượng khoáng và protein bị khử tương ứng là 42,5 ± 1,2% và 60,9 ± 3,0% [17]

1.2.3.3 Quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng phương pháp kết hợp hóa học và sinh học

Đây là phương pháp đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất chitin – chitosan Theo Honlanda và Netto (2006) nghiên cứu sử dụng enzym alcalase

và enzym Pancreatin để thu hồi thành phần chính của đầu vỏ tôm Xiphopenaeus

kroyeri – Brazil Đầu vỏ tôm được thủy phân bằng alcalase 3% ở pH = 8,5; nhiệt độ

600C; tỷ lệ nước/nguyên liệu 1:1 hoặc Pancreatin 1% ở pH = 8,5; nhiệt độ 400C sau đó bất hoạt enzym ở 900C trong 5 phút và ly tâm 16000 vòng ở 40C trong 15 phút Dịch được sấy lạnh thu dịch đạm, bã được tiến hành thu hồi lipid và chitin Kết quả cho thấy enzym alcalase có hiệu quả khử protein tốt, tuy nhiên khử protein bằng alcalase cần khử tiếp protein bằng NaOH [40]

Tại Việt Nam các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan kết hợp phương pháp hóa học và sinh học Trần Thị Luyến (2003) sử dụng enzym papain trong quy trình sản xuất chitin – chitosan Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%;

ở nhiệt độ phòng; trong 5h sau đó được khử protein bằng enzym papain 13% ở 70 ÷

800C trong 4h với pH = 5 Quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng enzym papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác Đặc biệt là DD, độ tan và hiệu suất quy trình ưu thế hơn hẳn Nhưng để nâng cao chất lượng của chitosan có thể sử dụng enzym papain thay thế cho NaOH để khử protein trong vỏ tôm Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục tiêu thu hồi và tận dụng, điều đó chắc chắn mang lại hiệu quả cao Tuy nhiên, cần nghiên cứu quy trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này Cần tiếp tục nghiên cứu sản xuất và chiết rút enzym deacetylase để thay thế hoàn toàn cho NaOh đặc trong công đoạn deacetyl [14]

Quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp kết hợp hóa học và sinh học sử dụng enzym alcalase khử protein từ NLCL của tôm thẻ chân trắng thu tại các công ty

chế biến thuộc Khánh Hòa Kết quả cho thấy xử lý bằng enzym alcalase thương mại với tỷ lệ enzym/nguyên liệu 0,2%; pH = 8 và nhiệt độ 550C trong 8h có thể thu hồi 86% caroten Sau khi khử bằng enzym, đầu vỏ tôm tiếp tục được xử lý bằng NaOH 2% trong 12h và khử khoáng với HCl 4% trong 12h tỷ lệ 1/5 (w/v) ở nhiệt độ phòng sẽ thu được chitin có hàm lượng protein còn lại 0,99 ± 0,1%; khoáng 0,98 ± 0,2% Chất lượng chitosan thành phẩm tương đối tốt, giảm đáng kể sự ô nhiễm của nước thải [26]

Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy việc kết hợp sử dụng enzym protease trong quá trình sản xuất chitin giúp giảm lượng hóa chất sử dụng, cải thiện chất lượng chitin, thu hồi protein, astaxanthin, hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử lý môi trường Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề

ô nhiễm môi trường do các cơ sở chế biến chitin gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin từ NLCL thủy sản Đây là hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn Tuy nhiên thời gian sản xuất còn tương đối dài làm giảm năng suất sản xuất trong công nghiệp dẫn đến làm giảm giá trị kinh tế

1.3 TỔNG QUAN VỀ LÊN MEN LACTIC [1][9][23]

Lên men lactic là một trong những công nghệ phát triển từ lâu đời và được con người ứng dụng sớm nhất trong bảo quản và chế biến thực phẩm (sữa lên men, thịt lên men, rau lên men, các sản phẩm đồ uống) cũng như trong nhiều lĩnh vực khác như y dược, hóa chất và chăn nuôi Quá trình tạo ra acid, chủ yếu là acid lactic là tác nhân chủ yếu trong việc sử dụng lên men lactic Các chủng lactic có mặt trong sản phẩm sẽ làm thay đổi tính chất cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Các sản phẩm sinh ra sẽ ức chế hoạt động của đa số vi sinh vật gây thối khác, do đó làm tăng tính an toàn và kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm Các loài vi khuẩn lactic bao gồm:

Lactococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium, Carnobacterium, Sporolactobacillus

Lên men lactic được thực hiện trong điều kiện có mặt của hệ vi khuẩn lactic và nguồn cơ chất là cacbohydrate như: Sacharose, glucose, fructose, tinh bột ngô, tinh bột sắn… kết quả là trong điều kiện thích hợp cho sự hoạt động của vi khuẩn lactic sẽ tạo thành acid lactic và một số enzym protease Acid lactic sẽ làm hạ pH và ức chết hoạt động của vi khuẩn gây thối rữa Thành phần canxicacbonat trong vỏ tôm sẽ tác dụng

với acid lactic để tạo thành lactatcanxi ở dạng hòa tan Phản ứng này gần tương tự quá trình khử khoáng bởi HCl trong phương pháp hóa học Đồng thời hệ enzym protease

sẽ phân hủy một phần protein góp phần làm tăng quá trình khử protein [54]

Trong quá trình lên men lactic ở giai đoạn đầu vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác đều hoạt động, số lượng vi khuẩn lactic chiếm đa số, đồng thời với số lượng vượt trội

vi khuẩn lactic sẽ hấp thu cơ chất để hạ pH của môi trường Vì vậy, trong giai đoạn này cần tạo điều kiện tốt cho vi khuẩn lactic phát triển Vi khuẩn lactic hô hấp yếm khí tuyệt đối nên cần tạo môi trường không có oxy Để làm tăng diện tích tiếp xúc và hạn chế oxy người ta nghiền nhỏ nguyên liệu

Vi khuẩn lactic bị dừng hoạt động ở pH môi trường < 3,0 khi đó hệ thống sẽ xảy

ra hiện tượng nuôi ngược âm Điều này có nghĩa là chất được sinh ra (acid lactic) lại

ức chế hoạt động của quá trình lên men Trong thực tế, người ta có thể khắc phục hiện tượng này bằng cách tăng pH môi trường để tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic tiếp tục hoạt động sinh tổng hợp enzym và các chất kháng sinh Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic có thể kể đến là: nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ, vitamin, các hợp chất vô cơ, oxy, nhiệt độ, pH môi trường

1.4 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS [1][6][9]

Hầu hết các vi khuẩn thuộc chi Bacillus là vi khuẩn thu năng lượng từ sự oxy

hóa các hợp chất hữu cơ, mặc dù một số vi khuẩn ưa nhiệt, tự dưỡng không bắt buộc,

nhất là B.schegelii, có thể phát triển, sử dụng carbon dioxide hoặc carbon monoxide như nguồn carbon và năng lượng duy nhất Về mặt dinh dưỡng, B subtilis thuộc loại nguyên dưỡng, trong khi các loài như B.cereus và B.sphaerius đòi hỏi về chất hữu cơ

tối thiểu như amino acid hay vitamin dư thừa Khi có mặt của không khí, các vi khuẩn

Bacillus đều có thể phát triển và sinh bào tử Phần lớn trong chúng có catalase B subtilis được xem là một vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn nhưng chúng có thể phát triển

yếu trong điều kiện không có oxygen với sự sản sinh acetoin, acetate… Vi khuẩn này

có thể phát sinh NAD+ từ sự biến đổi acetoin thành butandiol do đó nó có thể phát triển

kị khí mạnh hơn và cạnh tranh với B cereus và B lichiniformis Nhiều vi khuẩn Bacillus

tiết các enzym ngoại bào Các enzym này là các enzym chịu trách nhiệm về sự thoái biến các chất cao phân tử trong môi trường Các chất có trọng lượng phân tử thấp do đó có thể

được vận chuyển vào trong tế bào như những nguồn carbon và năng lượng

B subtilis là trực khuẩn gram dương, hô hấp hiếu khí B subtilis có hình que,

đường kính 0,7 ÷ 0,8µm, chiều dài 2,0 ÷ 3,0 µm và có nha bào và chiều ngang của nha bào nhỏ hơn kích thước chiều ngang của tế bào vì thế khi hình thành nha bào thì nha bào thường ở giữa tế bào và không làm cho hình dạng và kích thước tế bào thay đổi, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 35 ÷ 37oC

B subtilis có tính di động, khả năng này thực hiện được nhờ tiêm mao có vành

lông rung mọc quanh cơ thể khi tế bào ở giai đoạn còn non, lúc tế bào trưởng thành và

già đi thì tiêm mao bị tiêu biến nên không còn khả năng di động

Đa số tế bào sinh dưỡng của B subtilis đều tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy Bào

tử có hình bầu dục, kích thước nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng bình thường vài lần nên

trong tế bào B subtilis có thể có từ 1 ÷ 3 bào tử, kích thước của bào tử thường là 0,9 x

0,9 µm Nội bào tử nằm lệch tâm hoặc gần tâm, không làm biến dạng tế bào mẹ Việc hình thành bào tử là đặc điểm thích nghi rất đặc biệt và đặc trưng của vi khuẩn sinh bào tử, giúp vi khuẩn vượt qua được những điều kiện bất lợi của ngoại cảnh Bào tử

của B subtilis chịu được nhiệt độ cao và có thể tồn tại lâu hơn trong điều kiện khắc

nghiệt: ở 110oC tồn tại trong 180 phút và sống lâu hơn trong môi trường có chất diệt khuẩn như: phenol, H2O2…

Sự biến đổi của bào tử thành tế bào sinh dưỡng có thể chia thành 2 giai đoạn: + Sự nảy mầm: là một phản ứng không thể đảo ngược được, trong đó quá trình trao đổi chất được phục hồi Có nhiều phản ứng sinh hóa xảy ra và sẽ phá vỡ trạng thái không hoạt động, làm mất đi những tính năng tiêu biểu của bào tử như khả năng kháng bức xạ, kháng nhiệt và kháng hóa chất

+ Sự phát triển nhanh: trong đó việc tổng hợp protein, ARN, ADN dẫn đến quá trình chuyển hóa bình thường và cuối cùng thì phân chia tế bào

B subtilis dễ mọc ở các môi trường nuôi cấy thông thường Phát triển tốt trong

môi trường dinh dưỡng có pH = 6,8 ÷ 7,4; nhiệt độ thích hợp là 37oC Sau 18 ÷ 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn mọc thành váng trên bề mặt Nếu lắc nhẹ váng vỡ ra và chìm xuống đáy, làm môi trường vẩn đục nhẹ nhưng không đục đều Trên mặt thạch, khuẩn lạc dạng ráp (Rough), không màu hay có màu vàng nhạt đến xám, xù xì, bò lan, bờ riềm

không tròn, bề mặt khuẩn lạc bóng và có chóp lồi ở giữa

B subtilis có khả năng sinh ra nhiều enzym quan trọng như α – amylase,

protease, lipase và ribonuclease cùng các enzym khác trong chuyển hóa vật chất ở mô

sống Theo Work và cộng sự (1959) thì B subtilis là một loại vi khuẩn có hệ thống enzym tương đối hoàn chỉnh, B subtilis có cellulase làm biến đổi chất xơ thành đường

dễ tiêu, lecithinase thủy phân chất béo, enzym phân giải gelatin và tiêu fibrin Tuy

nhiên, B subtilis hoạt động mạnh nhờ hai loại enzym thuộc hệ thống men tiêu hóa là

protease và amylase

Protease là một nhóm enzym gồm hai loại peptidase và proteinase, chúng thủy phân các liên kết peptid (CONH) trong phân tử protein hay polypeptid, pepton Sau đó các peptid phân tử nhỏ này thủy phân thành các acid amin tự do dưới tác dụng của peptidase Các peptidase có tính đặc hiệu hẹp hơn proteinase, chúng chỉ tác dụng lên các

peptid ở những vị trí nhất định Proteinase của B subtilis là một loại enzym có tính

kiềm, pH tối thích từ 6,5 ÷ 7,5

So với protease động vật và thực vật, protease của vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzym nên protease từ vi sinh vật thủy phân protein triệt để hơn Chính vì thế

khi sử dụng protease từ vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn B subtilis để khử protein đầu

tôm sẽ có hiệu quả cao

1.5 TỔNG QUAN VỀ ENZYM [1][9]

1.5.1 Giới thiệu về enzym

Enzym là chất xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc

độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác Enzym có hai đặc trưng: enzym là protein có hoạt tính xúc tác, enzym có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn

Từ trước thế kỷ XVII, khi loài người hoàn toàn chưa biết gì về enzym, người ta

đã biết sử dụng rộng rãi các quy trình enzym trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia, rượu… Việc ứng dụng enzym trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzym thông qua hoạt động sống của vi sinh vật

Từ thế kỷ XVII đến thế kỷ XVIII, người ta đã đề ra khái niệm của sự lên men, các nhà khoa học đã quan sát một vài hiện tượng lên men và bắt đầu có những thí nghiệm thô sơ và đơn giản của quá trình lên men

Đầu thế kỷ XIX người ta bắt đầu tách được các chất gây nên hiện tượng lên men, cuối thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã biết dùng phương pháp hấp phụ lựa chọn để tinh chế enzym, xác định được tính đặc hiệu, ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzym

Trong những năm gần đây, nhờ dùng phương pháp phân tích Rơnghen người ta

đã nghiên cứu được cấu hình không gian của phân tử enzym Ngoài việc nghiên cứu cấu trúc, những công trình quan trọng trong thời gian này là phát hiện được enzym tham gia quá trình sinh tổng hợp protein và các acid nucleic trong cơ thể sống, đặc biệt

là đã tổng hợp được enzym Điều này có ý nghĩa kinh tế lớn hơn đối với các enzym khó tách từ nguyên liệu tự nhiên

1.5.2 Nguồn thu nhận enzym

Enzym là những chất không thể điều chế được bằng phương pháp tổng hợp hóa học, mà người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật, thực vật hoặc vi sinh vật

Trong hàng trăm enzym được sử dụng trong công nghiệp hơn một nửa được sản xuất từ nấm mốc và nấm men, trên một phần ba từ vi khuẩn, còn lại từ 8% nguồn động vật và 4% nguồn thực vật

 Enzym động vật

Một số mô động vật chứa nhiều enzym: dạ dày (pepsin, gastrinsin, cellulase, renin), tụy tạng (amylase, mantase, lipase, cholesterol esterase, tripsin, kimotripsin…), ruột (saccarase, nuclease, lactase, aminopeptidase…), gan (enzym tham gia tổng hợp ure), tuyến nước bọt (amylase, mantase, kalicrein…), huyết thanh (amylase, phosphatase, transaminase…)…Mặc dù mọi cơ quan động vật đều chứa enzym, song thông thường người ta chỉ thu chế phẩm pepsin từ dạ dày lợn, renin từ dạ dày bê, pancreatin từ tụy tạng lợn

 Enzym thực vật

Từ thực vật thượng đẳng có thể thu được một số enzym thủy phân:

 Papain từ nhựa đu đủ

 Bromelain từ thân, lá, chồi, vỏ dứa

 Plazmin, ficin từ sung, si, vả

 α, β – amylase có trong malt đại mạch, thóc

 Urease có trong giá đậu tương, lipase có trong mầm thầu dầu

 Polyphenoloxydase, peroxydase, protease, pectinase, invertase, amylase có trong lá chè Dưới tác dụng của các enzym này, xảy ra sự biến đổi các cơ chất tương ứng trong lá chè ở quá trình chế biến và góp phần tạo nên những chất mới tham gia vào sự hình thành chất lượng của chè (màu sắc, hương thơm)

 Enzym vi sinh vật

Đây là nguồn thu enzym rất phong phú Từ vô số vi sinh vật, người ta có thể thu được nhiều loại enzym khác nhau, trong đó có những enzym mà cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được

Hệ enzym vi sinh vật có khả năng thay đổi bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy và dùng các tác nhân điều chỉnh, từ một loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh một hoặc một số loại enzym nào đó theo ý muốn

Vi sinh vật có khả năng sinh sản, phát triển và sinh tổng hợp enzym với tốc độ cực kỳ lớn, do đó cho phép thu được một lượng lớn enzym trong thời gian ngắn một cách dễ dàng

Enzym vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa enzym từ các nguồn khác Người ta tính rằng, trong vòng 24h vi sinh vật có thể chuyển hóa một lượng lớn thức

ăn gấp 30 ÷ 40 lần so với trọng lượng cơ thể chúng, trong khi đó hệ enzym của con lợn trên 50kg chỉ có thể chuyển hóa vài kg thức ăn trong một ngày

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym

Enzym mang bản chất protein, ảnh hưởng bởi các yếu tố nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzym, chất kìm hãm, chất hoạt hóa và nồng độ cơ chất, ánh sáng… Hoạt lực của enzym cao nhất khi tất cả các yếu tố trên phù hợp với hoạt động của nó

và ngược lại Thay đổi một trong số các yếu tố ảnh hưởng sẽ làm giảm khả năng xúc tác hoặc bất hoạt enzym đó

 Nhiệt độ:

Ezyme hoạt động trong một vùng nhiệt độ gọi là nhiệt độ hoạt động của enzym Giá trị nhiệt độ thấp nhất hoặc cao nhất mà tại đó enzym mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn của enzym Giá trị nhiệt độ mà enzym thể hiện cao nhất gọi là nhiệt độ tối thích Nhiệt độ tối thích của enzym phụ thuộc vào pH môi trường, nồng độ cơ chất

Thông thường, đối với đa số enzym thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷

500C, nhiệt độ lớn hơn 700C đa số enzym bị mất hoạt tính [10]

 pH

Giá trị pH có vai trò tạo trạng thái ion hóa cho enzym và cơ chất Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzym, dẫn đế khả năng xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Giá trị pH tối thích là giá trị tại đó cả enzym và cơ chất đạt trạng thái ion phù hợp nhất Chúng dễ dàng tương tác với nhau nên hiệu quả xúc tác của enzym tăng pH môi trường cũng liên quan đến độ bền của enzym Hầu hết enzym hoạt động tốt ở môi trường pH xấp xỉ 7, môi trường quá acid hay quá kiềm enzym đều kém bền Trong đầu vỏ tôm có chứa sẵn các enzym protease vì thế chúng

ta phải chọn enzym nào đóng vai trò là enzym chính xúc tác cho quá trình thủy phân

để tạo môi trường có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hưởng của các enzym khác

 Nồng độ enzym

Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym Nồng độ enzym thấp tốc độ và hiệu quả thủy phân không cao Nồng độ enzym quá lớn vận tốc phản ứng tăng chậm

 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung

Nước có khả năng điều chỉnh phản ứng thủy phân, nước là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương và là môi trường khuếch tán enzym và

cơ chất tạo điều kiện cho phản ứng xảy ra

 Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc

Diện tích tiếp xúc càng lớn thì quá trình thủy phân xảy ra càng nhanh Vì vậy đối với nguyên liệu có kích thước lớn thường được làm nhỏ để hiệu quả thủy phân càng lớn

 Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Chất kìm hãm là chất làm giảm khả năng xúc tác và vô hoạt enzym Chúng là các chất hữu cơ phân tử thấp, ion kim loại, phi kim và có thể là chất kìm hãm thuận nghịch hay bất thuận nghịch Chất kìm hãm thuận nghịch có thể là cạnh tranh, không cạnh tranh hay hỗn tạp

 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

Chất hoạt hóa là chất làm tăng hoạt động của enzym, enzym từ không hoạt động sang hoạt động hoặc từ hoạt động ít chuyển sang hoạt động nhiều Chất hoạt hóa có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim loại hoặc là các chất hữu cơ khác Tuy nhiên, các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng khi được sử dụng với tỷ lệ nhất định, khi dùng quá tỷ lệ cho phép, hoạt tính của enzym sẽ giảm

 Ảnh hưởng của độ tươi nguyên liệu

Độ tươi của nguyên liệu đầu vỏ tôm có vai trò quan trọng quyết định chất lượng dịch đạm Độ tươi của nguyên liệu đầu vỏ tôm giảm làm giảm chất lượng chitin – chitosan do có sự thủy phân protein trong đầu vỏ tôm tạo thành các sản phẩm cấp thấp như indol, scaptol, H2S, NH3… gây ra mùi khó chịu cho sản phẩm

1.5.4 Ứng dụng của enzym

 Trong hóa phân tích

Dùng enzym có tác dụng phân giải riêng chất ấy, sau đó dùng một trong các phương pháp phân tích thông thường để định lượng các chất phần tương ứng Từ đó suy ra lượng chất cần phân tích

Nếu chất cần phân tích có tác dụng kìm hãm, hoặc kích thích đặc hiệu một enzym nào đấy, ta có thể định lượng bằng cách xác định mức độ ảnh hưởng của chúng đến hoạt độ enzym đối chiếu với bảng, hoặc đồ thị chuẩn để suy ra lượng chất cần phân tích

 Trong y học

Được sử dụng để chữa bệnh, sản xuất các sinh tố và các chất kháng sinh

Có thể dùng enzym để tăng thêm lượng enzym cho cơ thể, chữa các bệnh thiếu enzym bẩm sinh, chữa bệnh về tiêu hóa kém, loại bỏ các phần mô bị hỏng, bị thối ở các ổ viêm, các vết thương hoặc hòa tan các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu Ngoài ra có thể dùng enzym để phân giải thuốc khi cơ thể bị dị ứng với các thuốc này Chữa các bệnh do siêu vi trùng gây nên bằng các loại enzym phân giải acid nucleic Dùng kẹo cao su có chứa hai loại enzym (lactat dehydrogenase và invectase) để chống bệnh hà răng

Dùng enzym để chuẩn đoán nhanh một số bệnh như dùng glucooxydase và peroxydase để kiểm tra bệnh tiểu đường

 Trong công nghiệp

Trong công nghiệp xà phòng enzym dùng để làm chất tẩy rửa dầu mỡ công nghiệp

Sử dụng enzym amylase để khử hồ trên vải trong công nghiệp dệt

Sử dụng protease của Aspergillus oryzae 33 để khử lông trâu, bò trong công

nghiệp thuộc da cho hiệu suất cao hơn phương pháp vôi sulfua

Ứng dụng cellulase thủy phân bào mòn màng cellulase để trích ly các chất keo trong rong biển

Trong công nghiệp giấy, sử dụng enzym để sản xuất giấy, bột giấy

 Trong thực phẩm

Sử dụng α – amylase trong chế phẩm tạo men bia, men bánh mì

Sử dụng protease để làm mềm thịt, thủy phân cá để sản xuất nước mắm, sản xuất bột cá, tinh chế guanin

Pectinase để tăng hiệu suất ép nước quả, làm trong dịch quả, chống hiện tượng kết tủa trắng khi bảo quản

Cellulase làm mềm cellulose để tăng hiệu suất tiêu hóa cho trâu, bò, cá trắm… Glucooxydase làm túi thu oxy trong bảo quản phomat, bột trứng, sữa khô