Đây là phương pháp đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.
Phương pháp này sử dụng enzym protease khử protein, sử dụng vi khuẩn lên men khử
khoáng. Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như: giảm đáng kể lượng hóa chất sử
dụng, mạch chitin có độ dài tối đa và trọng lượng phân tử cao, hạn chế sự ảnh hưởng
môi trường đặc biệt phương pháp này cho phép thu hồi các thành phần có giá trị khác
như protein, astaxanthin. Ngoài ra còn có thể kết hợp khử khoáng và khử protein trong
cùng một bước do nhiều vi sinh vật sinh enzym có khả năng sinh acid.
Nghiên cứu sản xuất chitin bằng phương pháp lên men vi sinh. Kết quả cho thấy,
đầu vỏ tôm được lên men với 10% L. plantarum cấy vào, bổ sung 5% glucose, pH điều
chỉnh bằng acid acetic thì hiệu suất khử protein là 75%, khử khoáng là 86%. Nếu thay thế
acid acetic bằng acid citric thì hiệu suất khử protein là 88% và khử khoáng là 90% [54]. W.J. Jung và cộng sự (2007) đã sản xuất chitin từ phế liệu vỏ cua đỏ bằng quá
trình lên men bởi vi khuẩn L. paracasei subsp tolerans KCTC-3074 và Serratia marcescens FS-3. Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 7 ngày pH khi sử dụng L. 3074,
FS-3, L. 3074 + FS-3 (1:1) giảm từ 6,9 xuống 3,3; 5,88; 3,48. Chất tro còn lại sau khi
lên men sử dụng L. 3074, L. 3074 + FS-3 (1:1) giảm mạnh tương ứng từ 41,2% xuống
3,19%; 1,15%. Khi sử dụng L. 3074 + FS-3 (1:1) thì mức độ khử khoáng đạt giá trị
cao nhất lên đến 97,2% nhưng khử protein chỉ đạt được 52,6% còn nếu sử dụng FS-3 thì lượng protein từ 22,4% giảm xuống còn 3,62% [38].
Oh và cộng sự (2007) đã nghiên cứu ứng dụng chủng vi sinh vật Pseudomonas aeruginosa F722 trong quá trình khử khoáng và protein từ vỏ cua để sản xuất chitin.
Hiệu quả của quá trình khử khoáng đạt 92% và khử protein đạt 63% sau 7 ngày lên
men trong môi trường bổ sung 10% glucose ở 300C [49].
Đối với nghiên cứu trong nước kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ vi khuẩn
Bacillus planaturum là 15%, tỷ lệ rỉ đường bổ sung vào 15%, thời gian lên men 7 ngày
ở nhiệt độ phòng thì hàm lượng khoáng và protein bị khử tương ứng là 42,5 ± 1,2% và
60,9 ± 3,0% [17].