Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu đầu tôm
Ép Khử protein bằng enzyme Neutrase Neutrase Điều kiện: - Nhiệt độ: 35oC → 65 oC - Thời gian: 3h → 8h - Tỷ lệ enzyme/đầu tôm (v/w) = 0% → 0,5% - pH = 6 → 9 - Tỷ lệ nước/đầu tôm = 2/1 Dịch thủy phân Khử protein bằng NaOH Khử khoáng bằng HCl Rửa Chitin Chitosan Rửa
Thời gian: 6 giờ Nồng độ HCl: 4% Tỷ lệ (w/v): 1/5 Nhiệt độ thường
Deacetyl
Thời gian: 8 → 14 giờ Nồng độ NaOH: 1 → 3% Tỷ lệ (w/v): 1/5 Nhiệt độ : 50oC Bã NaOH 70%, 8 giờ, 80oC Bã ép Dịch ép
* Mô tả quy trình
Đầu tiên, nguyên liệu đầu tôm được rửa sạch, để ráo và ép sơ bộ bằng máy ép trục vít. Sau đó, nguyên liệu được khử protein lần I bằng enzyme protease Neutrase trong các điều kiện nhiệt độ, thời gian, pH, tỷ lệ enzyme/đầu tôm khác nhau nhằm xác định điều kiện thủy phân tốt nhất cho enzyme Neutrase. Sau khi xác định được điều kiện thủy phân tốt nhất cho enzyme, tiến hành đánh giá hiệu suất thủy phân protein lần I và tiếp tục xác định chế độ khử protein lần II bằng NaOH loãng ở nhiệt độ 50oC trong các điều kiện (nồng độ NaOH và thời gian) khác nhau nhằm xác định chế độ khử tốt nhất bằng NaOH. Bước tiếp là quá trình khử khoáng bằng HCl 4% trong 6 giờ ở nhiệt độ thường với tỷ lệ HCl/nguyên liệu = 5/1 [16] thu được Chitin, đánh giá chất lượng và deacetyl bằng NaOH 70% trong 8 giờ ở 800C [16] thu được Chitosan.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân tốt nhất cho enzyme Neutrase Neutrase
2.2.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp
Nguyên liệu đầu tôm
Ép
Khử protein bằng enzyme Neutrase
Điều kiện:
- Nhiệt độ: 55oC - Thời gian: 6 giờ. - Nước/đầu tôm = 2/1 - pH = 8
Tỷ lệ enzyme/đầu tôm (v/w):
0% 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% 0,5 %
Bất hoạt enzyme
Kiểm tra hàm lượng ẩm và protein
Chọn nồng độ enzyme thích hợp
Dịch ép
2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp cho enzyme Neutrase
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp
Nguyên liệu đầu tôm
Ép Khử protein bằng enzyme Neutrase - Điều kiện: Tỷ lệ enzyme/đầu tôm đã xác định
Thời gian: 6 giờ. Nước/đầu tôm = 2/1 pH = 8
Nhiệt độ thủy phân:
35oC 40oC 45oC 50oC 55oC 60oC 65oC
Bất hoạt enzyme
Kiểm tra hàm lượng ẩm và protein
Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Dịch ép
2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp cho enzyme Neutrase
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ thích hợp
Nguyên liệu đầu tôm
Ép Dịch ép Khử protein bằng enzyme Neutrase Điều kiện: -Tỷ lệ enzyme/đầu tôm đã xác định
-Nhiệt độ thủy phân đã xác định
-Nước/đầu tôm =2/1 -pH = 8
Thời gian thủy phân (giờ):
3h 4h 5h 6h 7h 8h
Bất hoạt enzyme
Kiểm tra hàm lượng ẩm và protein
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
2.2.2.4 Bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp cho enzyme Neutrase
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp
Nguyên liệu đầu tôm
Ép Dịch ép Khử protein bằng enzyme Neutrase Điều kiện: -Tỷ lệ enzyme/đầu tôm đã xác định -Nhiệt độ đã xác định -Thời gian đã xác định -Nước/đầu tôm =2/1 pH thủy phân 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 Bất hoạt enzyme
Kiểm tra hàm lượng ẩm và protein
Chọn pH thủy phân thích hợp
2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân tốt nhất cho NaOH 2.2.3.1 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ NaOH thích hợp 2.2.3.1 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ NaOH thích hợp
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ NaOH thích hợp
Nguyên liệu đầu tôm
Ép Khử protein bằng NaOH Khử protein bằng enzyme Neutrase Điều kiện: - Nhiệt độ: 55oC - Thời gian: 6 giờ
- Tỷ lệ enzyme/đầu tôm = 0,4% - Nước/đầu tôm =2/1 - pH = 6,5 Dịch ép Điều kiện: - Nhiệt độ: 50oC - NaOH/nguyên liệu = 5/1 - Thời gian: 12 giờ
Nồng độ NaOH:
1% 2% 3%
Chọn nồng độ NaOH thích hợp
2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp cho NaOH
Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian khử protein lần II
bằng NaOH Nguyên liệu đầu tôm Ép Khử protein bằng NaOH Khử protein bằng enzyme Neutrase Điều kiện: - Nhiệt độ: 55oC - Thời gian: 6 giờ
- Tỷ lệ enzyme/đầu tôm = 0,4% - Nước/đầu tôm = 2/1 - pH = 6,5 Dịch ép Điều kiện: - Nhiệt độ: 50oC - Tỷ lệ NaOH/nguyên liệu = 5/1 - Nồng độ NaOH đã chọn
Thời gian khử (giờ):
8 10 12 14
Chọn thời gian khử thích hợp
2.2.4 Bố trí thí nghiệm khử khoáng bằng HCl
Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khử khoáng bằng HCl 4%
Nguyên liệu đầu tôm Ép Khử protein bằng NaOH Khử protein bằng enzyme Neutrase Điều kiện: - Nhiệt độ: 55oC - Thời gian: 6 giờ
- Tỷ lệ enzyme/đầu tôm = 0,4% - Nước/đầu tôm = 2/1 - pH = 6,5 Dịch ép Điều kiện: - Nhiệt độ: 50oC - Tỷ lệ NaOH/nguyên liệu = 5/1 - Nồng độ NaOH 2%
- Thời gian 10 giờ
Khử khoáng bằng HCl Điều kiện: - Nhiệt độ phòng - Tỷ lệ HCl/nguyên liệu = 5/1 - Nồng độ 4%
- Thời gian 6 giờ Bã ép
2.2.5 Bố trí thí nghiệm deacetyl Chitin [16]
Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm deacetyl Chitin 2.2.6 Bố trí thí nghiệm đối chứng theo phương pháp hóa học
Hình 2.10 Quy trình sản xuất đối chứng theo phương pháp hóa học
Khử protein Đầu tôm Khử khoáng Chitin Chitosan NaOH 4%, 24h, tỷ lệ 1/5 (w/v), nhiệt độ phòng HCl 4%, 24h, tỷ lệ 1/5(w/v), nhiệt độ phòng NaOH 70%, 8h, nhiệt độ 80oC, tỷ lệ 1/5(w/v) Deacetyl Chitin Deacetyl Chitosan NaOH 70% Thời gian 8 giờ Nhiệt độ 80oC
2.3 Phương pháp phân tích
- Xác định hàm lượng protein trong mẫu Chitin và Chitosan bằng phương pháp microbiuret [18].
- Xác định hàm lượng protein trong đầu tôm bằng phương pháp biuret [18]. - Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600oC [18].
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở 105oC tới khối lượng không đổi [18].
- Xác định độ nhớt được thực hiện trên nhớt kế Brookfield theo phương pháp Mukku, 2007 [20].
- Xác định độ đục bằng máy đo HACH.
- Xác định độ hoà tan bằng phương pháp lọc.
2.4 Phương pháp xử lý số liệu
* Hiệu suất khử protein, khoáng (%) được xác định dựa trên công thức của Rao và cộng sự (2000) như sau:
- Hiệu suất khử protein:
(%)DP = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O) Trong đó:
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý.
- Hiệu suất khử khoáng:
(%)DA = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O) Trong đó:
A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý.
* Xử lý số liệu
Số liệu báo cáo là trung bình của 3 lần lặp lại. Kết quả phân tích bằng phần mền Excel, Statistical Analysis Signficant (SAS) xác định độ sai lệnh không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần hóa học phế liệu tôm thẻ chân trắng
Nguyên liệu đầu tôm được xử lý qua công đoạn ép và tiến hành phân tích các chỉ tiêu: độ ẩm, hàm lượng tro tổng số, hàm lượng Chitin, hàm lượng protein và sự biến đổi khối lượng. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Kết quả STT Chỉ tiêu phân tích Nguyên liệu đầu
tôm
Nguyên liệu đầu tôm sau khi ép
1 Độ ẩm (%) 77,4 ± 1,3 61,5 ± 1,4
2 Hàm lượng tro tổng số(%) 24,5 ± 0,7 18,7 ± 0,6 3 Hàm lượng Chitin (%) 18,3 ± 0,9 30,7 ± 1,1 4 Hàm lượng Protein (%) 50,5 ± 1,8 27,4 ± 1,2
5 Khối lượng (g) 1000 596,7 ± 15,8
Kết quả cho thấy, phế liệu tôm thẻ chân trắng chứa 22,6% chất khô, trong đó hàm lượng protein khá cao (khoảng 50,5%), do đó cần có phương pháp loại bỏ bớt thành phần protein trong nguyên liệu trước khi đi vào sản xuất nhằm mục đích tận thu protein chất lượng cao và giảm lượng hóa chất sử dụng, góp phần làm giảm chi phí sản xuất và giảm ô nhiễm môi trường. So sánh thành phần hóa học nguyên liệu đầu tôm sau khi ép với nguyên liệu ban đầu nhận thấy có nhiều thay đổi, thể hiện là với cùng một khối lượng mẫu nhưng hàm lượng tro tổng số giảm (từ 24,5% xuống 18,7%), hàm lượng Chitin tăng đáng kể (từ 18,3% lên 30,7%), hàm lượng protein giảm mạnh (từ 50,5% xuống 27,5%), đồng thời công đoạn ép đã loại được 40,3% khối lượng của nguyên liệu. Điều này cho thấy, công đoạn ép ban đầu có ảnh hưởng rất tích cực tới các công đoạn xử lý tiếp theo, góp phần giảm lượng hóa chất sử dụng, nâng cao hiệu suất thu hồi Chitin – Chitosan trên cùng một đơn vị khối lượng với nguyên liệu ban đầu, từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất, giảm thiểu tối đa những tác động xấu tới môi trường. Vì vậy, quá trình ép được chọn làm công đoạn tiền xử lý nguyên liệu trong quy trình sản xuất nhằm
giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng mà không làm ảnh hưởng tới chất lượng Chitin [14]. So với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Trí và cộng sự (2009) [14], thành phần khoáng của nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng trước và sau khi ép có sự khác biệt lần lượt là 20,8% và 12,9%, hay trong nghiên cứu của Mayer (1986) thì hàm lượng protein, tro, Chitin trong đầu tôm lần lượt là 53,5%, 22,6%, 11,1%. Qua đó nhận thấy có sự khác về kết quả giữa các nghiên cứu, điều này có thể là do hàm lượng Chitin, protein, khoáng và carotenoid trong phế liệu tôm thay đổi phụ thuộc vào điều kiện bảo quản cũng như phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản,…
3.2 Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng enzyme Neutrase3.2.1 Kết quả nghiên cứu xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp 3.2.1 Kết quả nghiên cứu xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp
Để xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp, các thí nghiệm được bố trí ở những tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau (từ 0% tới 0,5%) trong cùng điều kiện thời gian 6 giờ, nhiệt độ 55oC, pH 8, tỷ lệ nước/đầu tôm bằng 2/1. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Hình 3.1 55 60 65 70 75 80 85 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Tỷ lệ enzyme/đầu tôm (%) H iệ u s u ấ t th ủ y p h â n ( % )
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Neutrase tới hiệu suất thủy phân protein đầu tôm
Kết quả ở Hình 3.1 cho thấy, ở mẫu đối chứng (không bổ sung enzyme) hiệu suất thủy phân kém 61,9%, còn khi tỷ lệ enzyme bổ sung tăng dần thì hiệu suất thủy phân protein trong đầu tôm cũng tăng theo, đặc biệt khi tỷ lệ enzyme/đầu tôm tăng từ 0,1% tới 0,4% thì hiệu suất thủy phân tăng rõ rệt từ 62,5% lên tới 78,2%. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ enzyme từ 0,4 tới 0,5%, hiệu suất thủy phân tăng nhưng với tốc độ chậm hơn, chỉ khoảng 2%. Điều này cho thấy, nồng độ enzyme bổ sung tăng thì khả năng thủy phân tăng nhưng chi phí cho enzyme rất nhiều, giảm hiệu quả kinh tế do tăng giá thành sản phẩm. Vì vậy, để cân bằng giữa các yếu tố trong sản xuất, tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp nhất được chọn là 0,4% với hiệu suất thủy phân đạt 78,2%. So sánh với các nghiên cứu khác, như nghiên cứu thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Neutrase có hoạt độ 0,5 AU/g của Viện nghiên cứu Hải sản thì tỷ lệ bổ sung enzyme/nguyên liệu là 1% trong 2 giờ với hiệu suất thủy phân đạt 51,7% [5], hay trong nghiên cứu của TS. Trang Sĩ Trung sử dụng enzyme Flavourzyme để thủy phân protein trong phế liệu đầu vỏ tôm thì tỷ lệ bổ sung enzyme/nguyên liệu được dùng là 0,1% trong 6 giờ với hiệu suất thủy phân đạt 95% [15]. Điều này chứng tỏ, có những khác biệt giữa các nghiên cứu xác định tỷ lệ bổ sung enzyme/nguyên liệu trong quá trình thủy phân protein. Nguyên nhân của sự khác biệt này có thể là do nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu khác nhau, thể hiện như các enzyme khác nhau có hoạt độ enzyme khác nhau nên tỷ lệ enzyme bổ sung vào cũng khác nhau và nếu sử dụng cùng một loại enzyme mà vẫn có sự khác nhau thì một phần là do nguyên liệu khác nhau sẽ có sự khác biệt về cấu tạo cơ chất, dẫn tới hiệu suất thủy phân khác nhau.
3.2.2 Kết quả nghiên cứu xác định nhiệt độ thủy phân tối ưu cho enzyme Neutrase Neutrase
Để xác định nhiệt độ thủy phân tốt nhất cho enzyme Neutrase, các thí nghiệm được bố trí ở các nhiệt độ khác nhau (35, 40, 45, 50, 55, 60, 65oC), trong cùng điều kiện tỷ lệ enzyme/đầu tôm là 0,4%, thời gian 6 giờ, pH 8, tỷ lệ nước/đầu tôm bằng 2/1. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Hình 3.2
65 67 69 71 73 75 77 79 81 35 40 45 50 55 60 65 Nhiệt độ (oC) H iệ u s u ấ t th ủ y p h â n (% )
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Neutrase
Kết quả cho thấy khi nhiệt độ tăng dần từ 35 tới 55oC thì hiệu suất khử protein của enzyme cũng tăng theo từ 67,2 tới 78,2%. Nhưng khi tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân từ 55 tới 65oC thì hiệu suất thủy phân lại giảm đáng kể từ 78,2% xuống 74,3%. Điều này thể hiện, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn tới hiệu suất quá trình thủy phân protein bằng enzyme. Vậy nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Neutrase là 55oC, kết quả nghiên cứu này cũng hoàn toàn phù hợp với khuyến cáo nhà sản xuất đưa ra về nhiệt độ hoạt động tối ứu cho enzyme Neutrase từ 45oC tới 55oC. So sánh với một vài nghiên cứu trước đây có sử dụng enzyme Neutrase như nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme của Viện nghiên cứu Hải sản [5] thì nhiệt độ thủy phân tối ưu là 55oC trong 2 giờ, hiệu suất thủy phân đạt 51,7%. Hay trong nghiên cứu của R.Slizyte và cộng sự thủy phân protein ở 50oC, hiệu suất thủy phân đạt 64,5% [23]. Từ so sánh trên, nhận thấy có sự khác nhau giữa các nghiên cứu, điều này có thể là do nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu khác nhau, tuy cùng sử dụng một enzyme nhưng mỗi loại nguyên liệu đều có thành phần enzyme nội tại khác nhau và phương pháp nghiên cứu khác nhau (có hoặc không sử dụng enzyme nội tại trong nguyên liệu khi bổ
sung enzyme từ bên ngoài vào) nên nhiệt độ thủy phân tối ưu là nhiệt độ tối ưu chung cho cả hệ enzyme (nếu trong nghiên cứu có sử dụng enzyme nội tại của nguyên liệu) nhằm đạt được hiệu suất thủy phân cao nhất.
3.2.3 Kết quả nghiên cứu xác định thời gian thủy phân tối ưu cho enzyme Neutrase Neutrase
Để xác định thời gian thủy phân tối ưu cho enzyme Neutrase, các thí nghiệm được bố trí ở những khoảng thời gian khác nhau (từ 3÷8 giờ), trong cùng điều kiện tỷ lệ enzyme/đầu tôm là 0,4%, nhiệt độ 55oC, pH 8, tỷ lệ bổ sung nước/đầu tôm bằng 2/1. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Hình 3.3