L ỜI MỞ ĐẦU
2.2.Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu
được loại bỏ sạch tạp chất, đảm bảo 100% là đầu tôm và được tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì được cho vào túi polyme (mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -20oC.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Bố trí các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho
nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme alcalase đến quá trình thủy
phân protein và thí nghiệm xác định chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân protein từ
phế liệu đầu tôm bằng enzyme alcalase theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đặc trưng hóa các tính chất sinh học và dinh dưỡng của
dịch thủy phân bằng phương pháp cổ điển.
2.2.1.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
+ Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret theo Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949).
+ Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch thu được bằng test kiểm tra khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH theo quy trình của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai , Toshiaki Ohshima (2010).
+ Xác định hàm lượng protein trên bã theo phương pháp của Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949).
+ Xác định hiệu suất khử protein theo công thức của Rao và cộng sự (2000): DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O)
Trong đó:
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
+ Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo TCVN 3700 - 1990.
Độẩm mẫu được tính theo công thức:
A = 100%
Trong đó, A: Độẩm mẫu (%)
MT: Khối lượng mẫu trước sấy MS: Khối lượng mẫu sau sấy
Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2007 và Designe Expert 8.0.1 phiên bản dùng thử. Tất cả các số liệu được lấy từ kết quả trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm (độ tin cậy 95%).
2.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu đầu tôm được đưa vào thí nghiệm đảm bảo còn tươi, không bị
biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất.
Trước khi thủy phân, nguyên liệu được đánh giá ảnh hưởng của nhiệt đến khả năng thủy phân protein bằng cách xử lý nhiệt ở 90oC trong 15 phút, đồng thời (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt trước thủy phân và việc bổ sung
enzyme đến khả năng thủy phân protein. Nguyên liệu (đầu
tôm)
Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein.
Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein
Đặc trưng hóa tính chất sinh học, dinh
kết hợp đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến khả năng thủy phân protein bằng cách bổ sung enzyme alcalase 0,1%.
Sau đó, đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein.
Sau khi xác định được giới hạn và miền nghiên cứu của các yếu tố ảnh
hưởng, tiến hành tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm sao cho dịch thủy phân thu được có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học là cao nhất.
Sau khi có thông số tối ưu, tiến hành đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh
dưỡng của dịch thủy phân theo thông số tối ưu đó.
2.3.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Nguyên liệu Không XL nhiệt Bổ sung Alcalase 0,1% XL nhiệt (90oC, 15 phút) Thủy phân (60oC, 6h) Đo pH Khác nhau Chỉnh về cùng pH=8 Không khác nhau Bất hoạt enzyme (90oC/10 phút) Ép Dịch thủy phân Xác định hàm lượng
protein hòa tan
Xác định khả năng
chống oxi hóa
Xác định hiệu suất khử protein còn lại
So sánh đánh giá ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu và việc bổ sung enzyme đến khả năng thủy phân protein.
Tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý
enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm theo sơ đồ hình 2.3. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
2.3.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
Thí nghiệm được bố trí theo mô hình Factorial 2k, với 3 yếu tố do đó số thí nghiệm phải thực hiện là N= 23=8 cùng với 3 thí nghiệm bổ sung ở tâm phương án.
Như vậy có tất cả là 8+3=11 thí nghiệm. Các thông số cho thí nghiệm:
- Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu (%): X1 [0,1; 0,5] - Nhiệt độ thủy phân (oC): X2 [50; 70] - Thời gian thủy phân (giờ): X3 [2; 8] Hàm mục tiêu :
- Hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân (mg/100g nguyên liệu)
- Nồng độ DPPH bị khử (µM/100g NL dịch thủy phân) - Hiệu suất khử protein còn lại trên bã (%)
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cho các giá trị ở biên
Số TN Yếu tố TN X1 (%) X2 (oC) X3 (giờ) 1 0,1 50 2 2 0,5 50 2 3 0,1 70 2 4 0,5 70 2 5 0,1 50 8 6 0,5 50 8 7 0,1 70 8 8 0,5 70 8 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm ở tâm phương án
No U1 (%) U2 (oC) U3 (giờ)
1 0,3 60 5
2 0,3 60 5
3 0,3 60 5
2.3.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng
Thí nghiệm tối ưu được bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS), với mô hình Central composit gồm 11 thí nghiệm của Factorial và 9 thí nghiệm bổ sung.
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu của một sốđề tài khoa học, các thông số và giá trị tương ứng được chọn như sau:
a. Yếu tố cố định:
- Tỷ lệ nước/NL: 1/1
- pH tự nhiên (Kết quả so sánh pH là không khác nhau nên để pH tự nhiên).
b. Các yếu tố cần tối ưu:
- Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu (%) : X1 [0,1; 0,5] - Nhiệt độ thủy phân (oC) : X2 [50; 70] - Thời gian thủy phân (giờ) : X3 [2; 8]
c. Hàm mục tiêu (Yi)
Hàm mục tiêu là hàm lượng protein hòa tan, khả năng kiểm soát gốc tự do của dịch thủy phân (nồng độ DPPH bị khử) và hiệu suất khử protein còn lại trên bã.
+ Hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân (mg/100g nguyên liệu) phải đạt tối đa: Y1 max
+ Nồng độ gốc tự do DPPH bị khử(µM/100g nguyên liệu) phải đạt tối đa: Y2 max
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm, mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thưc nghiệm được xác lập ở bảng 2.4.
Bảng 2.3. Mức thí nghiệm của các yếu tố cho thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm
Yếu tố X1
Tỷ lệ enzyme so
với cơ chất (%)
X2
Nhiệt độ thủy phân
(oC)
X3
Thời gian thủy phân
(giờ)
Mức trên 0,5 70 8
Mức dưới 0,1 50 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mức cơ sở Xi 0,3 60 5
Ma trận thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.5. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm theo RMS-CCD Số TN Yếu tố TN X1 X2 X3 1 0.1 50 2 2 0.5 50 2 3 0.1 70 2 4 0.5 70 2 5 0.1 50 8 6 0.5 50 8 7 0.1 70 8 8 0.5 70 8 9 0.3 60 5 10 0.3 60 5 11 0.3 60 5 12 0.3 60 5 13 0.04 60 5 14 0.56 60 5 15 0.3 46.84 5 16 0.3 73.16 5 17 0.3 60 1.05 18 0.3 60 8.95 19 0.3 60 5 20 0.3 60 5
2.3.5. Bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất của dịch thủy phân protein thu được
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein
Mục tiêu của thí nghiệm:
Định tính và định lượng các thành phần dinh dưỡng và hoạt tính sinh học có trong dịch thủy phân protein thu được trên đầu tôm thẻ chân trắng để thu thập dữ
liệu làm cơ sở cho việc mở ra những hướng ứng dụng mới trong việc bổ sung protein thủy phân vào thực phẩm con người, đặc biệt là thực phẩm chức năng.
Xđ khả năng chống oxi hóa Xđ hàm lượng peptid tan trong axit Xđ hàm lượng protein hòa tan Nguyên liệu đầu tôm Xử lý nhiệt (90oC, 15 phút) Thủy phân -Nhiệt độ: [50-70oC] -Thời gian: [2-8h] -Enzyme Alcalase: [0,1-0,5%] -Tỷ lệ nước/NL: 1/1 Ép Dịch thủy phân Xđ hàm lượng thành phần các axit béo Xđ hàm lượng thành phần các axit amin Xđ hàm lượng astaxanthin Bất hoạt enzyme (90oC, 10 phút) Ly tâm Tách dịch thủy phân
Mô tả quy trình:
Dịch thủy phân protein thu hồi theo chế độ thủy phân tối ưu đã xác lập sẽ được đặc trưng tính chất.
Phế liệu đầu tôm được cân 100g cho vào bình tam giác 250ml, sau đó bổ
sung vào bình 100ml nước cất. Sau đó đậy kín bình bằng giấy bạc rồi đem đi xử lý nhiệt ở 90oC trong khoảng 15 phút bằng cách đun cách thủy trong nồi điện. Việc theo dõi nhiệt độ được thực hiện thường xuyên trong quá trình xử lý nhiệt bằng nhiệt kế.
Sau khi xử lý nhiệt, lấy bình ra đem làm nguội xuống đến nhiệt độ dưới 40oC, rồi bổ sung enzyme Alcalase với tỷ lệ [0,1–0,3%] so với khối lượng nguyên liệu,
dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho enzyme tiếp xúc đều với nguyên liệu trước khi
đem đi thủy phân, sau đó đậy kín bình bằng giấy bạc.
Quá trình thủy phân được thực hiện theo chế độ thủy phân tối ưu, tức là ở
nhiệt độ [50–70 oC] và thời gian là [2–8h]. Nhiệt độ hỗn hợp được duy trì ổn định bằng bểổn nhiệt.
Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, lấy bình tam giác ra khỏi bể ổn nhiệt rồi đem bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 100oC trong 10 phút để kết thúc quá trình thủy phân ngay lập tức.
Dùng rây có lỗ với kích thước nhỏ để ép bã thu lấy dịch thủy phân. Phần dịch một phần đem đi xác định thành phần các axit amin, axit béo, sự phân bố phân tử lượng protein… Và phần còn lại đem đi ly tâm bằng máy ly tâm với tốc độ quay 5000 vòng/phút trong vòng 30 phút. Sau khi ly tâm thu được hai phần: dịch thủy phân ở trên và cặn thủy phân ở dưới.
Dịch thủy phân được tách ra và được đem đi xác định hàm lượng protein hòa tan, khả năng chống oxi hóa, hàm lượng peptid trong axit và tổng năng lực khử.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
3.1.1. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được
Hình 3.1. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được
Hình 3.1 cho thấy ở cùng điều kiện không xử lý nhiệt nhưng hàm lượng protein hòa tan ở mẫu có bổ sung enzyme (1830,31 mg/100g NL) cao hơn ở mẫu không bổ sung enzyme (1657,49 mg/100g NL). Sự khác nhau này có ý nghĩa về mặt thống kê, cho thấy rằng ở điều kiện không xử lý nhiệt, việc bổ sung enzyme đã làm tăng hàm lượng protein hòa tan lên. Cũng vậy, ở cùng điều kiện có xử lý nhiệt, mẫu có bổ sung enzyme có hàm lượng protein hòa tan là 2325,73 mg/100g NL cũng cao hơn nhiều so với mẫu không xử lý enzyme là 1817,04 mg/100g NL.
Điều đó cho thấy ngay cả khi có xử lý nhiệt, enzyme vẫn có khả năng làm tăng hàm lượng protein hòa tan lên.
Như vậy, việc bổ sung enzyme đã làm tăng hàm lượng protein hòa tan
lên cả khi không xử lý nhiệt và khi có xử lý nhiệt. Nguyên nhân có thể là do enzyme bổ sung đã xúc tác, thúc đẩy cho quá trình thủy phân protein tạo ra nhiều
hơn các polypeptide, rồi các peptid mạch ngắn. Hoàng Thị Nhạn (2011) khi so sánh hiệu quả của việc sử dụng enzyme Alcalse và Protamex để thủy phân đầu tôm cũng đã chứng minh được rằng mẫu đối chứng (không sử dụng enzyme bổ sung) luôn có (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hàm lượng protein hòa tan thấp hơn các mẫu có bổ sung Alcalase và Protamex.
Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với lý thuyết đã học.
Mặt khác, từ đồ thị cũng dễ dàng nhận thấy rằng dù có bổ sung enzyme hay không thì những mẫu có xử lý nhiệt đều có hàm lượng protein hòa tan (1817,04
mg/100g NL ở mẫu không bổ sung enzyme và 2325,73 mg/100g NL ở mẫu có bổ
sung enzyme) cao hơn so với những mẫu không xử lý nhiệt (1657,49 mg/100g
NL ở mẫu không bổ sung enzyme và 1830,31 mg/100g NL ở mẫu có bổ sung enzyme). Điều đó cho thấy công đoạn xử lý nhiệt đã làm tăng hàm lượng protein hòa tan lên.
Như vậy, công đoạn xử lý nhiệt đã làm tăng hàm lượng protein hòa tan lên cả khi không bổ sung enzyme và khi có bổ sung enzyme. Có thể là do trong quá trình xử lý nhiệt, nhiệt độ đã góp phần thúc đẩy quá trình thủy phân cắt mạch protein, làm cho hàm lượng protein hòa tan cũng tăng lên. Krushna Chandra Dora (2011) trong nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng
phương pháp bề mặt đáp ứng cũng đã xử lý nhiệt nguyên liệu ở 90oC trong 30 phút
trước khi tiến hành thủy phân. Nghiên cứu cho thấy protein thủy phân được có hàm
lượng khá cao (72,3%) [12].
Đặc biệt nhận thấy rằng ở mẫu kết hợp xử lý nhiệt và bổ sung enzyme có
hàm lượng protein hòa tan là cao nhất (2325,73 mg/100g NL). Có lẽ việc xử lý nhiệt trước đó đã làm bất hoạt một số enzyme nội tại trong đầu tôm, tạo ra môi
Tóm lại, rõ ràng hai công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đều ảnh
hưởng đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân, đều làm tăng hàm lượng protein hòa tan, trong hàm lượng protein hòa tan tăng mạnh mẽ hơn khi có sự kết hợp 2 công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme. Vì vậy, công đoạn xử lý nhiệt và enzyme là cần thiết cho quá trình thủy phân protein trên đầu tôm để làm
tăng hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân.
3.1.2. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được
Hình 3.2. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được
Hình 3.2 cho thấy cùng ở điều kiện không bổ sung enzyme, nhưng mẫu không xử lý nhiệt lại có nồng độ DPPH bị khử là 22,93 µM/100g NL, còn mẫu có xử lý nhiệt lại có nồng độ DPPH bị khử thấp hơn (17,73 µM/100g NL), sự giảm xuống này là đáng kể về mặt thống kê. Như vậy, khi không được bổ sung thêm enzyme, công đoạn xử lý nhiệt đã làm giảm nồng độ DPPH bị khử xuống.
Nguyên nhân có thể là do quá trình xử lý nhiệt đã làm cho một số protein bị biến