L ỜI MỞ ĐẦU
1.3.4.Các mô hình thí nghiệm trong RMS
1.3.4.1. Thiết kế Box-Behnken (BBD) [23]
Thiết kế Box-Behnken làm đầy cho một khối đa diện, xấp xỉ một hình cầu.
Nó được áp dụng cho 3 mức yếu tố (chạy 15 thí nghiệm), trong đó có 3 thí nghiệm
Hình 1.5. Thiết kế Box-Behnken cho 3 yếu tố - (a) dưới dạng hình học và (b) dưới dạng thiết kế
1.3.4.2. Thiết kế Central composit (CCD) [24]
Thiết kế Central composit (CCD) là một trường hợp đặc biệt trong nhóm các mô hình quy hoạch thực nghiệm. Nó được cấu thành từ 3 thành phần:
- Nhân: là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một hình khối đều trong
không gian k chiều. Nếu k>5 có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương án yếu tố từng phần 2k-1.
- 2k điểm sao (*) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố. các tọa độ
của các điểm sao là (±α, 0, 0,…0), (0,±α, 0,…0), (0, 0 ,…,0, ±α), α là khoảng cách
thiết để mở rộng không gian nghiên cứu khảo sát tác động của 1 yếu tố đơn để có
thể tìm được các ước lượng của hệ số bii trong phương trình hồi quy bậc 2.
- Nghiệm phương trình ở tâm phương án dùng để tìm phương sai tái hiện. Cánh tay đòn sao α và số thí nghiệm ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu chuẩn tối ưu, thường là phuơng án trực giao hay phương án quay.
Phương trình hồi quy (mô hình hóa) được biểu diễn bằng pt sau:
y= bo + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b23x2x3 + b13x1x3 + b11x12+ b22x22 + b33x32 Trong đó, bo: hệ số tự do b1, b2, b3: hệ số bậc 1 b11, b22, b33: hệ số bậc 2 b12, b13, b23: hế số của từng cặp yếu tố. x1, x2, x3: các biến
y: chỉ tiêu theo dõi Ta có: i N i ij j x y N b 1 1
Nếu dùng phương trình hồi quy đầy đủ hơn có kể đến các hiệu ứng tương tác
hai biến: y= bo + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b23x2x3 + b13x1x3 Thì i N i ij j x y N b 1 1 i i N i i j x x y N b 1 ( 1) 1 1
N SS SSbj PE
Central composit là thiết kế thí nghiệm mà trong đó mỗi yếu tố số đa dạng
hơn 5 cấp độ: cộng alpha (+α), trừ alpha (-α), cộng một (+1), trừ một (-1) và điểm trung tâm (0). Nếu yếu tố phân loại được thêm vào, thiết kế trung tâm tổng hợp sẽ nhân đôi cho mỗi sự kết hợp của các cấp yếu tố phân loại.
1.4. Các nghiên cứu và ứng dụng nguyên liệu còn lại từ nguyên liệu tôm1.4.1. Trên thế giới 1.4.1. Trên thế giới
Jozef Synowiecki và cộng sự (1999) nghiên cứu ứng dụng Alkalase để khử
protein của phế liệu vỏ tôm Crangon crangon nhằm thu hồi Chitin và protein.
Gildberg và Stenberg, 2001 thu được 68,5% protein từ phế liệu tôm Pandalus borealis sau 2 giờ thủy phân với enzyme Alcalase.
Việc chiết xuất astaxanthin từ phế liệu tôm cũng được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Bằng phương pháp hóa học và phương pháp sinh học một nhóm các nhà nghiên cứu ở Iran đã chiết xuất được astaxanthin từ phế liệu đầu tôm, bã sau khi chiết được carotenoid sẽ là nguyên liệu để sản xuất chitin – chitisan.
Honlada và Netto, 2006 nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và pancreatin. Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42% protein, 31,98% tro và 19,92% chitin. Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (E/S) 3%, nhiệt độ 60ºC, pH=8,5. Kết quả cho thấy khi tăng độ thủy phân (%DH) từ 6% tới 12% thì thu được 26% và 28% protein tương ứng. Alcalase có ảnh hưởng nhiều hơn pancreatin, có
thể thu hồi protein từ 4,7 đến 5,7 mg astaxanthin/100g phế liệu khô tại DH 12%.
Năm 2007, bằng các test thử về khả năng chống oxi hóa, một nhóm các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxi hóa có trong Mungoong, một món ăn
truyền thống của người Thái Lan được làm từ dịch chiết từ phế liệu của tôm. Qua nghiên cứu, người ta nhận thấy rằng Mungoong chứa các chất chống oxi hóa. Dịch hòa tan từ sản phẩm này có hoạt tính chống oxi hóa cao bởi các test thử DPPH,
ABTS radical scavenging activities and FRAP. Hoạt tính chống oxi hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch hòa tan từ sản phẩm này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Wenhong Cao và các cộng sự, 2008 đã nghiên cứu thu hồi protein của phế
liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân và có sự điều chỉnh nhiệt độ bằng cách nâng nhiệt độ dần lên từ 40÷70ºC, cứ sau 30 phút thì tăng lên
5ºC, pH tự nhiên. Kết quả cho thấy tại điều kiện nhiệt độ 40ºC, 50ºC, 60ºC thì hàm
lượng protein thu hồi được tương ứng là 43,6%, 73,6%, 84,7%. Và kết quả cũng chỉ
ra là khi nhiệt độ tăng từ 45ºC ÷ 60ºC là nhiêt độ mà enzyme nội tạng hoạt động mạnh nhất thì DH tăng từ 0 ÷ 48% sau 180 phút khi nâng nhiệt dần lên, lượng protein thu hồi cao nhất là 87,4% tại 60ºC.
Năm 2009, nhóm các nhà khoa học người Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm lên men của tôm và giáp xác (Kapi, Koong-Som and Jaloo), đây là các sản phẩm truyền thống của Thái Lan. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sản phẩm lên men
này có hàm lượng protein cao, và hầu hết các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa tự nhiên và có lợi ích cho sức khỏe.
Krushna Chandra Dora, 2011[12] đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng các enzyme protease từ vi sinh vật bằng phương
pháp bề mặt đáp ứng (RMS). Ông đã nghiên cứu sử dụng các enzyme Alcalase, Neutrase và Flavourzyme cho quá trình thủy phân protein trong phế liệu tôm. So sánh hoạt động thủy phân của các enzyme này, ông kết luận rằng Alcalase cho kết quả thủy phân tốt nhất. Dùng phương pháp bề mặt đáp ứng, phương án central composit (CCD) để tối ưu quá trình thủy phân protein từ phế liệu tôm, ông đã đưa
ra được chế độ thủy phân tối ưu là nhiệt độ thủy phân 59,37oC, ở pH 8,25, thời gian thủy phân 84,42 phút, nồng độ enzyme/cơ chất 1.84%, cho độ thủy phân 33,13%. Protein thủy phân thu được có giá trị dinh dưỡng cao, chứa hàm lương protein cao
(72,3%), axit amin (529,93 mg/g) với các axit amin thiết yếu.
Hoạt tính sinh học từ protein tôm đã được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm và qua khảo sát người ta đã thu được một số kết quả khả quan.
1.4.2. Ở Việt Nam
Vũ Ngọc Bội đã sử dụng protease ở đầu tôm sú để thủy phân phế liệu tôm nhằm thu được dịch chiết và chất mùi từ phế liệu tôm.
Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy, 2006 cũng đã nghiên cứu sử dụng
Lactobacillus plantarum lên men đầu tôm sú để thu hồi chitin. Lên men đầu tôm có tác dụng bảo quản và cho phép thu hồi một số sản phẩm có giá trị: chitin, protein, lipid, sắc tố. Trong quá tình này sự khử protein là do hoạt động của hệ enzyme protease từ các vi khuẩn trong phế liệu ở giai đoạn đầu và hoạt tính protease yếu của vi khuẩn lactic. Ngoài ra, axit lactic sinh ra cũng có tác dụng làm mềm protein, hoạt hóa protein và thúc đẩy quá trình thủy phân tạo điều kiện cho một số protease hoạt động. Sau 24 giờ phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu chưa
xử lý là 12,99%.
Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase để tiến hành thủy phân phế liệu tôm và tận thu protein và astaxanthin trong công nghệ sản xuất chitin – chitosan. Tại nhiệt độ 54ºC, 8 giờ, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,22%; pH 8, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1 thì thu được 52,7% protein so với ban đầu.
Trang Sĩ Trung đã sử dụng enzyme Flavouzyme để tiến hành thủy phân phế
liệu tôm. Tại nhiệt độ 50ºC, 6 giờ, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,1%; pH 6,5 thì hiệu suất thu hồi khoảng 92 ÷ 95%.
Những nghiên cứu trên đã cho biết được các thông số tối ưu cho một quá trình thủy phân protein trên đầu tôm. Tuy nhiên, hầu hết phương pháp bố trí thí nghiệm vẫn là phương pháp cổ điển do đóchưa đánh giá được tác động của các yếu tố đến quá trình thủy phân protein. Chính vì thế việc nghiện cứu tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm bằng phương pháp bề mặt đáp ứng hiện đại hơn sẽ đánh giá được ảnh hưởng của từng yếu tố trên và tác động qua lại giữa chúng nhằm mục đích tối ưu hóa, cho ra giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán mà phương pháp
thực nghiệm cổ điển chưa giải quyết. Từ đó quá trình tối ưu sẽ trở nên dễ dàng và
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm
Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên cứu. Đầu tôm được lấy từ quy trình chế biến nguyên liệu tôm Thẻ chân trắng tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17), Nha Trang - Khánh Hòa.
Nhiệt độ bảo quản: -20oC tại phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang.
Thời hạn sử dụng nguyên liệu: 1 tháng.
2.1.2. Enzyme Alcalase
Enzyme Alcalase được mua tại công ty Novozyme, Tp. Hồ Chí Minh. Hoạt tính 2,4 AU-A/g.
2.1.3. Hóa chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tất cả các hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đều thuộc loại phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu2.2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu
được loại bỏ sạch tạp chất, đảm bảo 100% là đầu tôm và được tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì được cho vào túi polyme (mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -20oC.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Bố trí các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho
nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme alcalase đến quá trình thủy
phân protein và thí nghiệm xác định chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân protein từ
phế liệu đầu tôm bằng enzyme alcalase theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đặc trưng hóa các tính chất sinh học và dinh dưỡng của
dịch thủy phân bằng phương pháp cổ điển.
2.2.1.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
+ Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret theo Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949).
+ Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch thu được bằng test kiểm tra khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH theo quy trình của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai , Toshiaki Ohshima (2010).
+ Xác định hàm lượng protein trên bã theo phương pháp của Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949).
+ Xác định hiệu suất khử protein theo công thức của Rao và cộng sự (2000): DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O)
Trong đó:
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
+ Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo TCVN 3700 - 1990.
Độẩm mẫu được tính theo công thức:
A = 100%
Trong đó, A: Độẩm mẫu (%)
MT: Khối lượng mẫu trước sấy MS: Khối lượng mẫu sau sấy
Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2007 và Designe Expert 8.0.1 phiên bản dùng thử. Tất cả các số liệu được lấy từ kết quả trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm (độ tin cậy 95%).
2.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu đầu tôm được đưa vào thí nghiệm đảm bảo còn tươi, không bị (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất.
Trước khi thủy phân, nguyên liệu được đánh giá ảnh hưởng của nhiệt đến khả năng thủy phân protein bằng cách xử lý nhiệt ở 90oC trong 15 phút, đồng thời
Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt trước thủy phân và việc bổ sung
enzyme đến khả năng thủy phân protein. Nguyên liệu (đầu
tôm)
Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein.
Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein
Đặc trưng hóa tính chất sinh học, dinh
kết hợp đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến khả năng thủy phân protein bằng cách bổ sung enzyme alcalase 0,1%.
Sau đó, đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein.
Sau khi xác định được giới hạn và miền nghiên cứu của các yếu tố ảnh
hưởng, tiến hành tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm sao cho dịch thủy phân thu được có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học là cao nhất.
Sau khi có thông số tối ưu, tiến hành đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh
dưỡng của dịch thủy phân theo thông số tối ưu đó.
2.3.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Nguyên liệu Không XL nhiệt Bổ sung Alcalase 0,1% XL nhiệt (90oC, 15 phút) Thủy phân (60oC, 6h) Đo pH Khác nhau Chỉnh về cùng pH=8 Không khác nhau Bất hoạt enzyme (90oC/10 phút) Ép Dịch thủy phân Xác định hàm lượng
protein hòa tan
Xác định khả năng
chống oxi hóa
Xác định hiệu suất khử protein còn lại
So sánh đánh giá ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu và việc bổ sung enzyme đến khả năng thủy phân protein.
Tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý
enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm theo sơ đồ hình 2.3. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
2.3.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
Thí nghiệm được bố trí theo mô hình Factorial 2k, với 3 yếu tố do đó số thí nghiệm phải thực hiện là N= 23=8 cùng với 3 thí nghiệm bổ sung ở tâm phương án.
Như vậy có tất cả là 8+3=11 thí nghiệm. Các thông số cho thí nghiệm:
- Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu (%): X1 [0,1; 0,5] - Nhiệt độ thủy phân (oC): X2 [50; 70] - Thời gian thủy phân (giờ): X3 [2; 8] Hàm mục tiêu :
- Hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân (mg/100g nguyên liệu)
- Nồng độ DPPH bị khử (µM/100g NL dịch thủy phân) - Hiệu suất khử protein còn lại trên bã (%) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cho các giá trị ở biên
Số TN Yếu tố TN X1 (%) X2 (oC) X3 (giờ) 1 0,1 50 2 2 0,5 50 2 3 0,1 70 2 4 0,5 70 2 5 0,1 50 8 6 0,5 50 8 7 0,1 70 8 8 0,5 70 8
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm ở tâm phương án
No U1 (%) U2 (oC) U3 (giờ)
1 0,3 60 5
2 0,3 60 5
3 0,3 60 5
2.3.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng