Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret
Hàm lượng protein hòa tan được xác định dựa vào phương pháp Biuret đã được Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949) sử dụng để xác định protein huyết thanh và Mahmoudreza Ovissipour (2009). Sử dụng để xác định hàm lượng protein thủy phân từ nội tạng cá Beluga sturgeon [15].
Xay nhỏ
Tối ưu quá trình thủy phân Nghiên cứu ảnh hưởng của các
yếu tố thủy phân Phế liệu đầu tôm
Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt trước thủy phân
24
Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+ thành một phức chất màu tím (phản ứng Biuret). Màu sắc của phức chất tỉ lệ với số lượng liên kết peptide (CO-NH-) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin.
Công thức của phức Biuret như sau:
Hình 2.2 Công thức của phức Biuret
Hình 2.3 Sự bắt màu của phản ứng Biuret
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị thuốc thử Biuret: hòa tan 2,34375g CuSO4.5H2O và 8,0571g
C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml dung dịch NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy đều và định mức lên 1000ml bằng nước cất.
25
Dung dịch BSA chuẩn được pha như sau: hòa tan 1g BSA vào 50ml nước cất rồi khuấy đều đến khi BSA tan hết rồi định mức lên 100 ml nước cất. Cuối cùng thu được dung dịch BSA có hàm lượng 10mg/ml.
Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự 0 – 5. Sau đó cho các dung dịch hóa chất vào với thể tích như sau:
Bảng 2.1 Thể tích các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm
Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 570nm (sử dụng ống 0 làm mẫu blank). - Kiểm tra hàm lượng protein của dịch sau khi thủy phân
Cho 1ml dịch vào ống nghiệm, cho thêm 4ml thuốc thử Biuret, vortex và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, mang các mẫu so màu trên máy so màu ở bước sóng 570nm. Đọc giá trị mật độ quang, dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng protein trong mẫu.
Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch thu được bằng test kiểm soát gốc tự do DDPH
Xác định khả năng chống oxi hóa thông qua khả năng kiểm soát gốc tự do DDPH. Khả năng kiểm soát gốc tự do DDPH được xác định dựa vào phương pháp đã được Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai, Toshiaki Ohshima (2010) sử dụng để kiểm tra khả năng chống oxi hóa của dịch chiết từ nấm [13].
Nguyên lý: DDPH là gốc tự do, dễ bị oxi hóa, có màu tím đậm. Khi có mặt chất chống oxi hóa, gốc tự do DDPH sẽ nhận điện tử chuyển thành phân tử DDPH
Ống nghiệm Dung dịch hóa chất 0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lượng BSA 0 2 4 6 8 10
26
và mất màu tím. Như vậy, chất có hoạt tính chống oxi hóa càng cao sẽ làm mất màu dung dịch gốc tự do DDPH càng mạnh.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch DDPH - Dựng đường chuẩn DDPH:
- Pha 50ml dung dịch DDPH 0,1mM bằng cách: cân 0,00197g DDPH vào 50ml Ethanol
- Chuẩn bị 5 ống nghiệm sạch, đánh số từ 0 – 5. Tiếp theo cho dung dịch hóa chất vào theo bảng sau:
Bảng 2.2 Thể tích của các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm
- Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 517nm (sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
- Kiểm tra khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân bằng cách cho vào ống nghiệm 0,2ml dịch, 1,8 ml nước cất, 1ml ethanol 96% và 1ml dung dịch DDPH. - Đối với ống đối chứng thay mẫu cần đo bằng nước cất.
Với mỗi mẫu đo tiến hành làm mẫu zero gồm 0,2ml dịch cần đo, 1,8ml nước và 2ml ethanol 96%.
- Các mẫu được để trong bóng tối 30 phút sau đó đo ở bước sóng 517nm trên máy UV-VIS.
Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng DDPH đã bị khử.
Ống nghiệm DDPH (ml) Nước cất (ml) Ethanol (ml) Hàm lượng (mM) 1 1 2 1 0,025 2 0,8 2,2 1 0,02 3 0,6 2,4 1 0,015 4 0,4 2,6 1 0,01 5 0,2 2,8 1 0,005 0 0 4 0 0
27