Nhân chủng virus cúm AH5N1 tạo lô chủng làm việc dùng trong sản xuất vắc xin cúm

Trước tình hình dịch cúm A/H5N1 có nguy cơ lan rộng ở gia cầm và lây lan sang người, Chính phủ, Bộ Y tế, UBND các tỉnh đã có chỉ đạo các địa phương tiếp tục theo dõi chặt chẽ tình hình d

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này,

Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, phòng Đào tạo Đại học và Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường lời cảm ơn, lòng tự hào vì đã được học tập tại trường trong những năm qua

Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Lan Phương – Trưởng phòng Kiểm Định – Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế và TS Vũ Ngọc Bội – Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, động viên em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua

Xin cảm ơn CN Trần Ngọc Nhơn, CN Nguyễn Thị Thúy Hằng, CN Đinh Thị Huấn cùng toàn thể các cán bộ viên chức phòng Kiểm Định - Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua

Cuối cùng, em xin cảm ơn cha mẹ, bạn bè đồng nghiệp và toàn thể quí thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã dạy dỗ và tạo điều kiện về vật chất

và tinh thần cho em trong suốt thời gian vừa qua

Nha trang, tháng 6, năm 2012

Nguyễn Thị Thu Huyền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÚM GIA CẦM 3

1.2 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 4

1.2.1 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay 4

1.2.2 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam 6

1.3 TÁC NHÂN GÂY BỆNH 8

1.3.1 Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1 8

1.3.2 Độc lực và tính thích ứng vật chủ 10

1.3.3 Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1 11

1.3.4 Đặc điểm kháng nguyên – miễn dịch 15

1.4 SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH CÚM A/H5N1 .19

1.4.1 Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người ở Việt Nam 19

1.4.2 Chủng NIBRG-14 trong sản xuất vắc xin cúm 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24

2.2 VẬT LIỆU 24

2.3 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ 24

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.4.1 Phương pháp tạo chủng làm việc từ chủng gốc NIBRG-14 (MSL) 25

2.4.2 Phương pháp kiểm tra chất lượng 29

2.4.2.1 Xác định liều gây nhiễm EID50 29

2.4.2.2 Xác định hiệu giá HA (Haemaagglutinin: phản ứng ngưng kết

hồng cầu) 30

2.4.2.3 Kiểm tra vô trùng 32

2.4.2.4 Phát hiện Mycoplasma 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

3.1 NHẬN DẠNG VÀ XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ CHỦNG CỦA CHỦNG VIRUS NIBRG-14 35

3.1.1 Xác định các đặc điểm nhận dạng: 35

3.1.1.1 Tính chất gây ngưng kết hồng cầu 35

3.1.1.2 Giải trình tự gen xác nhận đoạn gen H5 không độc tính và gen N1 của chủng virus NIBRG-14 (MSL) 36

3.1.1.3 Hiệu giá EID50 gây nhiễm trên trứng gà có phôi của chủng NIBRG-14 (MSL) 39

3.1.2.Xác định liều gây nhiễm tối ưu (Optimal Infectious Dose) của chủng MSL trên trứng gà có phôi 40

3.2 SẢN XUẤT VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA LÔ CHỦNG LÀM VIỆC (WSL) ĐƯỢC NHÂN TRUYỀN TỪ CHỦNG NIBRG-14 (MSL) 42

3.2.1 Kết quả sản xuất vắc xin 42

3.3.2 Kết quả đánh giá chất lượng của lô chủng WSL được nhân truyền từ chủng NIBRG-14 nguyên gốc 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

1.KẾT LUẬN 48

2.KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

EID50 : Effective Infection Dose 50 (Liều gây nhiễm 50%)

FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương thế giới)

HA : Haemagglutinin (Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu – Kháng nguyên HA) HPAI : Highly pathogenic avian influenza (chủng virus cúm gia cầm độc lực cao) LM1 : Liquit Medium 1

LM2 : Liquit Medium 2

LPAI : Low pathogenic avian influenza (Chủng virus cúm gia cầm độc lực thấp)

NA : Neuraminidase (Kháng nguyên neuraminidase)

NP : Nucleo Protein

NIBSC

: National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm định Sinh học, Anh)

OIE : Office International Epizoot (Tổ chức Thú y thế giới)

PBS : Phosphate Buffer Saline (Dung dịch đệm)

PR8 : Chủng virus cúm A/H1N1/ có nguồn gốc từ Puerto Rico

RNP : Ribo Nucleo Protein

SA : Sialic Acid

TSA : Tryp Soyabeen Agar (Môi trường thạch)

TSB : Tryp Soyabeen Broth (Môi trường)

WHO : World Health Organization - Tổ chức Y Tế Thế giới (TCYTTG)

WSL : Working Seed Lot (Chủng làm việc)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Cách tính EID50 của liều gây nhiễm 30

Bảng 2.2 Thành phần cho 1 mẫu phản ứng PCR .34

Bảng 3.1 Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus của chủng MSL 40

Bảng 3.2 Kết quả xác định liều gây nhiễm tối ưu chủng MSL trên trứng gà có phôi 41

Bảng 3.3 Các thông số trong qui trình sản xuất lô chủng WSL 42

Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra hiệu giá HA 46

Bảng 3.5: Kết quả liều gây nhiễm EID50 của chủng sản xuất 46

Bảng 3.6 Kiểm tra tính ổn định về hiệu giá HA và hiệu giá chủng EID50 47

của lô P2 và P3 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay .5

Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 6

Hình 1.3 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến nay 7

Hình 1.4 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A 8

Hình 1.5 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ 13

Hình1.6 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A 15

Hình1.7 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “ kháng nguyên” (antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A (B) .18

Hình 1.8 Bằng kĩ thuật di truyền ngược chủng gốc NIBRG-14 được tạo ra từ 6 gen của virus A/PR8/34(H1N1) và 2 gen của virus A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), trong đó gen HA bị đột biến mất đoạn để giảm độc lực, cho phép virus này tái tổ hợp này nhân lên bằng công nghệ phôi trứng gà 22

Hình 2.1 Hình ảnh về quá trình đánh dấu vị trí tiêm 26

Hình 2.2 Hình ảnh về quá trình đục lỗ điểm tiêm 26

Hình 2.3 Hình ảnh về quá trình tiêm chủng vào dịch niệu đệm của trứng 26

Hình 2.4 Hình ảnh về quá trình hàn điểm tiêm bằng parafin 26

Hình 2.5 Hình ảnh về quá trình cắt vỏ trứng tại vùng buồng khí 27

Hình 2.6 Hình ảnh về quá trình dùng pipette Pasteur hút dịch niệu trong từng trứng 27

Hình 2.7 Hình ảnh về quá trình cho dịch niệu vào 1 tube vô khuẩn 27

Hình 2.8 Hình ảnh về quá trình cho dịch niệu vào tube cryo bảo quản đông băng 27

Hình 2.9 Sơ đồ nhân tạo chủng WSL 28

Hình 2.10 Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu 31

Hình 2.11 Sơ đồ chu trình nhiệt: 34

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra HA chủng virus cúm NIBRG-14 35

Hình 3.2 Kết quả thu nhận các đoạn DNA của các gen N1 và gen H5 bằng kỹ thuật PCR từ virus có nguồn gốc khác nhau 37 Hình 3.3 Kết quả so sánh trình tự gen H5 đột biến bằng kỹ thuật di truyền ngược của chủng NIBRG-14 với chủng VN/1194/2004 (H5N1) tự nhiên Gen H5 của chủng NIBRG-14 được đột biến từ gen H5 của chủng /Vietnam/1194/2004(H5N1) của Việt Nam thông qua làm mất đoạn 12 nucleotide tương đương với 4 amino acid RRRK thuộc đoạn gen có độc tính cao

và 3 đột biến điểm đổi A thành C nhằm ngăn ngừa khả năng tái hợp của đoạn gen

có độc lực cao này .38 Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen N1 của chủng di truyền ngược NIBRG-14 làm vắcxin và chủng A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) tự nhiên Trình

tự nucleotide của đoạn gen N1 đã kiểm tra ở hai chủng hoàn toàn giống nhau 39

Hình 3.5 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma trên môi trường canh thang LM1 và

LM2 44

Hình 3.6 Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma bằng PCR 45

LỜI MỞ ĐẦU

Từ trường hợp nhiễm virus cúm A/H5N1 đầu tiên được phát hiện tại Hồng Kông tháng 5 năm 1997 đến nay, dịch cúm A/H5N1 trên người đã lan sang nhiều quốc gia trên thế giới Cho đến nay, vẫn chưa có một bằng chứng nào cho thấy có sự lây truyền virus trực tiếp từ người sang người Tuy nhiên, các chuyên gia khẳng định việc virus cúm A/H5N1 lây nhiễm trực tiếp từ người qua người chỉ là vấn đề thời gian Điều này

đã cảnh báo về nguy cơ của một đại dịch cúm A/H5N1 trên người gần kề và buộc các nhà khoa học trên thế giới phải nhanh chóng tìm ra phương thức phòng bệnh hiệu quả Vắc xin luôn được coi là phương thức hiệu nghiệm nhất trong việc phòng chống, giảm tỷ lệ mắc bệnh và chết do virus cúm gây ra Tuy vắc xin cúm đã được sản xuất từ thập niên 60 nhưng chỉ tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ Với năng lực sản xuất vắc xin của thế giới hiện nay là 300 triệu liều/năm, nếu đại dịch cúm trên người xảy ra thì lượng vắc xin này chỉ có thể đáp ứng cho khoảng 10% dân số thế giới Trước tình hình đó, Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) khuyến cáo tất cả các nước, đặc biệt các quốc gia Châu Á, chủ động nghiên cứu và sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 để

có thể kịp thời cung ứng cho nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng khi xảy ra đại dịch Hiện nay vắc xin cúm gia cầm H5N1 được sản xuất dùng trong công nghệ nuôi cấy virus trên phôi gà 9 – 11 ngày tuổi Việc xác định được nồng độ virus gây nhiễm, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian thu hoạch thích hợp để có thể thu được dịch niệu với hiệu giá virus cao và ổn định là yếu tố quyết định đến thành công và đảm bảo tính kinh tế khi sản xuất vắc xin cúm

Việc sản xuất vắc xin hay các chế phẩm sinh học đều phải tuân thủ các qui trình sản xuất rất nghiêm ngặt theo qui định của TCYTTG, trong đó hệ thống chủng giống

là một trong những yêu cầu bắt buộc đầu tiên Các chủng sản xuất vắc xin cúm nói chung và vắc xin cúm A/H5N1 nói riêng phải là các chủng chuẩn (reference) do TCYTTG cung cấp Từ các ống chủng này, nhà sản xuất phải tự thiết lập ngân hàng chủng giống cho sản xuất theo đúng trình tự và qui định của TCYTTG Hiệu quả của vắc xin phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng giống virus, đặc biệt tính tương đồng của chủng virus vắc xin với chủng virus gây bệnh và hàm lượng protein HA chứa trong

liều vắc xin Người ta đã chứng minh được nếu trình tự các axit amin giữa chủng vắc xin và chủng gây bệnh giống nhau khoảng 87% là có mối tương quan rất rõ đến hiệu quả phòng bệnh

Để đạt mục tiêu nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 có hiệu quả bảo vệ cao và an toàn cho người sử dụng, một trong những mục tiêu đầu tiên là xây dựng hệ thống chủng giống dùng cho sản xuất an toàn và ổn định

Với ý nghĩa trên chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Nhân chủng virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14) tạo lô chủng làm việc dùng trong sản xuất vắc xin cúm”

Mục đích của đề tài:

Tạo lô chủng làm việc (WSL) từ chủng virus cúm NIBRG- 14 (A/H5N1) do TCYTTG cung cấp để sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 tại Viện Vắc xin và Sinh phẩm

Y tế, đạt yêu cầu chất lượng theo qui định

Nội dung nghiên cứu:

- Nhận dạng và xác định hiệu giá của chủng virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14)

- Sản xuất và đánh giá chất lượng của lô chủng làm việc (WSL) được nhân

truyền từ chủng NIBRG-14 (WSL)

Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo hẳn còn có các hạn chế, em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của quí thầy cô và bạn bè đồng nghiệp để báo cáo

thêm hoàn chỉnh

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÚM GIA CẦM

Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A,

thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng lan truyền từ động vật sang người

Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9) có khả năng tái tổ hợp để tạo nên hàng trăm phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh Virus H5N1 thể độc lực cao (HPAI) vẫn đang là mối đe dọa cho chăn nuôi

và sức khỏe cộng đồng

Từ cuối năm 2003 đến tháng 6/2008, thế giới đã có 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó có 243 trường hợp đã tử vong, chiếm 63,11% Việt Nam và Indonesia là hai quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất [19], [24], [29] Không giống như dịch cúm A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2002, chúng ta có thể khống chế dịch bằng cách tiêu diệt và loại trừ các loài gia cầm bị nhiễm bệnh trong vùng dịch để cắt đứt đường lây truyền Virus cúm A/H5N1 trong giai đoạn từ 2003 đến nay là thể

có độc lực cao, với sự xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan truyền từ Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới Tính gây bệnh của virus A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến Trong thời gian này, đặc biệt là trong 5 năm gần đây trên thế giới có hàng ngàn công trình nghiên cứu về cúm A và cúm A/H5N1 thậm chí là nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất vắc xin gây miễn dịch cho gia cầm và để chuẩn bị cho đại dịch có thể xảy ra ở người

Về phương diện dịch tễ, tiến hóa, tạo biến chủng, biến đổi kháng nguyên - miễn dịch, tính mẫn cảm và đề kháng với dược liệu, khác với nhiều virus khác ở gia cầm, virus cúm A/H5N1 có xu hướng đột biến nhanh để tạo nên nhiều biến chủng phân chia thành nhiều phân dòng khác nhau và có tính thích ứng phổ rộng đối với vật chủ

Bệnh cúm được Hippocrates mô tả lần đầu tiên vào năm 412 trước công nguyên tại Hy Lạp là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính Bệnh xảy ra theo chu kỳ và

thường gây dịch với quy mô khác nhau Ở vùng ôn đới, các đợt phát dịch thường xảy

ra vào mùa đông hằng năm Ngược lại, ở các vùng nhiệt đới, bệnh cúm xảy ra quanh năm, bùng phát bất ngờ và lan rộng thành các vụ dịch

Trận dịch cúm đầu tiên trong lịch sử là dịch năm 1580, bắt đầu từ châu Á lan sang châu Phi và đến châu Âu Tại Roma hơn 8000 người và nhiều thành phố của Tây Ban Nha tử vong

Trong thế kỉ 17-18 nhiều trận dịch rải rác khắp nơi, đặc biệt là khoảng năm

1830-1833, dịch cúm lan tràn, gây bệnh nặng đến một phần tư số người bị lây Sang thế kỉ

19, dịch cúm vẫn tiếp tục hoành hành trên thế giới Năm 1837, một nạn dịch lớn đã lan

từ Berlin (Đức) sang Barcelona (Tây Ban Nha)

Trận cúm mang tên cúm Tây Ban Nha- do dòng virus H1N1 gây ra trong hai năm 1918-1919 làm chết khoảng 40-50 triệu người Trận đại dịch cúm này được nghiên cứu y học xem ngang hàng với trận dịch hạch làm chết hai phần ba người dân châu Âu giữa thế kỉ 14

Năm 1969 (loại A/H3N2) dịch cúm xảy ra ở Hồng Kông đã cướp đi gần

34000 người

1.2 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay

Cúm A/H5N1 là một phân nhóm có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm gia cầm Chủng này lần đầu tiên được phát hiện và ghi nhận tại Hồng Kông vào năm 1997 khi nó gây bệnh trên người và gia cầm Tên gọi phân nhóm H5N1 liên quan đến loại protein kháng nguyên trên vỏ virus: protein hemagglutinin nhóm 5 (H5) và neuraminidase nhóm 1 (N1)

Kể từ cuối năm 2003 sự lan truyền cúm A/ H5N1 do các loài chim di cư ở Châu

Á, Châu Âu, Trung Đông và Châu Phi trở thành mối quan tâm lớn của TCYTTG cũng như nhiều quốc gia trên toàn thế giới Từ năm 2003 đến ngày 06/3/2012 theo thông báo của TCYTTG đã có tổng cộng 594 người mắc bệnh dương tính với cúm A/ H5N1, trong đó 349 người tử vong (chiếm tỷ lệ chung 58,75%) [19],[24],[29]

Các quốc gia có số mắc và số tử vong cao là các nước Ai cập (163/57); Indonesia (186/134) và Việt Nam (122/61)

Có 15 quốc gia ghi nhận cúm A H5N1 ở người từ 2003 đến nay như sau:

Hình 1.1 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay [11], [34].

Hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên người qua điều tra dịch tễ học cho thấy có liên quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như: giết mổ, vận chuyển, mua bán, cầm và sờ vào gia cầm nhiễm bệnh TCYTTG đã chia dịch cúm thành 6 giai đoạn, từ mức độ chỉ là nguy cơ nhỏ cho đến khi đại dịch bùng phát và lan tràn TCYTTG đánh giá hiện nay đang nằm ở giai đoạn 3 của dịch, điều đó thừa nhận sự gây nhiễm trên người của virus H5N1 nhưng chưa có bằng chứng về sự lây truyền virus từ người sang người [19], [24], [29]

Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 [34]

1.2.2 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ca bệnh đầu tiên vào năm 2003, cho đến đầu tháng 3/2012 ghi nhận có tổng cộng 122 ca, đến ngày 7/3/2012 ghi nhận thêm 01 ca nhiễm cúm A (H5)

là một bệnh nhân nam 31 tuổi, ở xã Ea Tyh, huyện Ea Kar, đây là ca bệnh thứ 4 xuất hiện tại Việt Nam trong năm 2012 và là ca bệnh đầu tiên tại Đắk Lắk từ trước đến nay đang được theo dõi và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh (ca đầu tiên tại Kiên Giang, ca thứ 2 tại Sóc Trăng, ca thứ 3 tại Bình Dương) [19],[24][29]

Hình 1.3 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến nay [34], [35]

Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm Mặc dù số mắc ít nhưng tỷ lệ

tử vong chung rất cao (58,75%) và chi phí điều trị rất tốn kém, do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để khỏi mắc bệnh

Trước tình hình dịch cúm A/H5N1 có nguy cơ lan rộng ở gia cầm và lây lan sang người, Chính phủ, Bộ Y tế, UBND các tỉnh đã có chỉ đạo các địa phương tiếp tục theo dõi chặt chẽ tình hình dịch bệnh truyền nhiễm trong nước và thế giới, tăng cường giám sát chặt chẽ các trường hợp mắc cúm tại các địa phương thông qua hệ thống giám sát trọng điểm cúm quốc gia, tại các bệnh viện và tại cộng đồng, phát hiện sớm các trường hợp mắc, sự biến chủng của virus, tổ chức điều tra dịch tễ để xác định nguồn lây và xử

lý kịp thời ổ dịch Và vắc xin được xem là phương pháp phòng bệnh hiệu quả nhất trong phòng chống các bệnh do virus cúm A/H5N1 gây ra

1.3 TÁC NHÂN GÂY BỆNH

1.3.1 Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1

Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà) có tên khoa học là

Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung

(Basic Taxomomy) [22] Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da [19], [24], [29]

 Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [11]

 Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là

RNA sợi đơn âm - negative single strand [11] (Hình 1.4)

Hình 1.4 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp

ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A Ghi chú:

- A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử

- B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên

HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của virus)

- C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

(Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ được đặc hiệu hóa

gắn các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân

bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA

(matrix) và các dấu ấn khác của virus [14] Có sự phân bố không đồng đều giữa các

phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [7], [8] Vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2, phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 [21] (Hình 1.4)

Về danh pháp, nhóm virus cúm A được phân chia thành nhiều phân type

(subtype), các phân type này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính kháng

nguyên bề mặt (NA và HA), cho đáp ứng miễn dịch khác nhau giữa các chủng virus ở

cơ thể bị nhiễm [7], [8] Có 16 phân type HA và 9 phân type NA đã được phát hiện, sự

tổ hợp giữa các phân type này, về lí thuyết, có thể tạo ra hơn 254 biến chủng khác nhau, trừ chủng ban đầu [29] Hiện nay, dữ liệu gen và hệ gen của virus cúm A có thể được tìm thấy trong Ngân hàng gen [18], tại Mạng lưới chuyên gia cúm gia cầm của

Tố chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức Thú y thế giới (OIE) [22], [23]; và tại trang web của Trung tâm dữ liệu các gen virus (Influenza Sequence Database, ISD: http://www.flu.lanl.gov/) TCYTTG đã quy định thống nhất danh pháp theo thứ tự kí hiệu: Tên serotype - Loài động vật bị nhiễm - Vùng địa lí phân lập - Số hiệu đăng kí chủng virus - Thời gian phân lập - Loại hình phân type [HA(H) và NA(N)]; ví dụ: A/Chicken/Vietnam/ HG4/2005(H5N1) Đối với các virus được phân lập trên người bệnh, thì không cần ghi loài mắc trong danh pháp, ví dụ: A/Vietnam/1194/2004(H5N1)

[31]

1.3.2 Độc lực và tính thích ứng vật chủ

 Độc lực gây bệnh của virus cúm A

Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI), và loại độc lực thấp (LPAI), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [21]

- HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờsau nhiễm Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29]

- LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào,

và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [29]

 Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên [21] Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở người, tạo

nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn;

gà - lợn - người (Hình 1.6) Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm [34] Đặc điểm thích ứng vật chủ này

là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc

biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo

ra một chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới

của chúng đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây

nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [18], [19] Trong lịch sử các đại dịch cúm ở người, lợn thường là vật chủ trung gian chuyển tiếp giúp cho virus cúm A biến đổi để dễ dàng lây nhiễm sang người gây nên bệnh dịch [21], [35] Ví dụ: cúm A/H3N2 là kết quả tái tổ hợp tự nhiên của virus cúm A/H2N2 của người và virus chứa gen H3 trong tự nhiên thông qua đồng nhiễm trên lợn, gây nên đại dịch cúm châu Á năm 1968 [19], [24], [29]

 Sức đề kháng

Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân bất hoạt vật lí hay hóa học Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh [17] Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và hydroxylamine Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (−70oC) Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 25 - 30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7

- 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37oC), trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC [22], [29]

1.3.3 Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1

 Đường xâm nhập của virus vào tế bào chủ

Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [22], [24], có những nét đặc trưng như sau:

- Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.5)

- Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây

là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 h) Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương

mô của cơ thể vật chủ [29], [35]

- Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription) Phức hợp protein– RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [15]

- Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase Các sợi này không được Adenine hóa (gắn

thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP)

tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.5)

- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên

mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của

virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA

thành RNP của virus Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ

thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [22], [23]

Hình 1.5 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở

tế bào chủ [11]

 Phương thức lây truyền

Các chủng của virus cúm gia cầm có thể lây nhiễm cho nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi, hổ và người Virus cúm có thể lan truyền nhanh từ trại chăn nuôi này sang trại chăn nuôi khác bằng các cơ chế cơ học qua các phương tiện vận chuyển, quần áo, giày dép Virus có nhiều trong chất bài tiết như dịch mũi họng, phân gia cầm bệnh, bụi và đất Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bệnh hoặc đồ dùng, vật dụng bị nhiễm bởi phân gia cầm là đường lây truyền chính Virus có thể lây truyền qua không khí (qua các giọt nhỏ dịch tiết đường hô hấp của gia cầm bệnh hoặc hít phải không khí có chứa bụi từ phân gia cầm) hay qua ăn uống (nước, thực phẩm nhiễm virus ) và tiếp xúc với dụng cụ và đồ vật nhiễm virus Người có thể

bị lây bệnh do tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh qua chăn nuôi, vận chuyển, giết

mổ, chế biến, ăn gia cầm và sản phẩm của gia cầm bệnh chưa được nấu chín hoặc chế biến không hợp vệ sinh

 Khả năng gây bệnh của virus cúm A

Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan

khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng [29], [24], [35] Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực

và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc (H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người, có

lẽ do tính thích ứng thụ thể sialic của chúng [28], [35] Hầu hết các chủng virus cúm

A nhân lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột Hamster, chồn đất [19], [20], [35]

Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch chống lại virus để bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể không có tác dụng bảo

vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus cúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ở tự nhiên, và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm A [29] Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng nguyên khác với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới Đây là nguyên nhân làm cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần trong năm, và các đợt dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có thể gây nên đại dịch cúm mới [35] Khả năng gây bệnh của biến chủng virus cúm mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể có được đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với biến chủng đó và chúng trở nên thích nghi lây nhiễm ở loài vật chủ mới [35], ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2

là nguyên nhân của các đại dịch cúm trên người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người [21] Tuy nhiên, các chủng này vẫn thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng năm ở người, do khả năng biến đổi kháng nguyên của chúng [18] Đây cũng chính là nguồn virus trao đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia cầm, để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên người [29], [35]

Hình 1.6 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A [35] 1.3.4 Đặc điểm kháng nguyên – miễn dịch

 Cấu trúc, chức năng của HA và NA

 Haemagglutinin

Haemagglutinin (HA) là một glycoprotein có cấu trúc trimer, dạng hình cây mọc nhô ra từ màng lipid của virus với tán cây hình cầu nằm ở phía ngoài HA có khả năng gây ngưng kết (agglutinate) hồng cầu

HA là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định độc tính của virus nhờ khả năng nhận biết và gắn vào thụ thể (receptor) của tế bào chủ Khả năng này phụ thuộc vào hai yếu tố:

+ Hai dạng phân tử sialic acid (SA) trên thụ thể (receptor) của tế bào chủ: acetylneuraminic acid và N-glycolylneuraminic acid

N-+ Hai kiểu liên kết với galactose: liên kết anpha-2,6Gal hay liên kết anpha-2,3Gal trên bề mặt của tế bào chủ

HA virus cúm chim có ái lực với liên kết SA anpha-2,3Gal, có nhiều ở các tế bào biểu mô của ruột Ngược lại, HA virus cúm người liên kết với liên kết SA anpha-2,6Gal, các tế bào biểu mô của khí quản người phần lớn chứa liên kết trên Vì vậy virus tấn công cơ quan hô hấp của người, gây bệnh nặng và thường dẫn đến tử vong

Ở heo, các tế bào biểu mô của khí quản mang cả hai loại SA và hai loại liên kết nêu trên Vì vậy, loài heo trở thành vật chủ trung gian có thể bị nhiễm cả hai loại virus cúm chim và cúm người Điều này tạo điều kiện cho quá trình tái tổ hợp tạo một biến chủng virus cúm có độc tính cao và lan truyền trong cộng đồng người

Trong 16 type HA, đến nay chỉ có 3 phân type H1, H2, và H3 liên quan đến các đại dịch đã xảy ra ở người Gần đây các phân type H5, H7 và H9 được xác định là có khả năng gây bệnh trên người

 Neuraminidase

Tương tự như HA, neuraminidase (NA) là một glycoprotein, có một đầu gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt phẳng và một vùng kị nước gắn vào màng virus có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus cúm

NA (hay còn gọi la sialidase) là enzyme có chức năng ngược với HA, nó phân cắt sialic acid bằng cách cắt liên kết glycoside nối nhóm keto của acid sialic với D-galactose hoặc D-galactosamine Phản ứng này cho phép virus tiến qua lớp niêm dịch

để tới các tế bào của đường biểu mô hô hấp trong quá trình nhiễm trùng Ngoài ra, việc loại bỏ acid sialic của phân tử HA từ các virion mới được tổng hợp giúp phóng thích các hạt virion ra khỏi tế bào bị nhiễm và gia tăng khả năng nhiễm trùng

Cho đến nay, trong 9 phân type NA, chỉ có N1 và N2 được xác nhận là liên quan đến các vụ dịch ở người

 Các phương thức biến đổi kháng nguyên

Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [35]

 Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các

phân đoạn gen/hệ gen của virus Do virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc, không có cơ

chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân

tế bào đích Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ

thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm mất đi hoặc thay thế (đột biến

trượt-xóa) [35] một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA

chuỗi đơn mới của virus [22], [35] Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã

hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được

mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến (đột biến điểm) Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao,

cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì

có 1 nucleotide sai khác [29], [35] Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen của nó, và các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch (Hình1.7)

Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng nguyên NA và HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới, hoặc làm thay đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus mới thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới [29], [35]

 Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các gen kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có ở virus cúm, và rất ít ở một số virus RNA

gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của virus cúm A được 2 chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà

trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gen của hai chủng virus đó

trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen, tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA

hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban đầu Kết quả

là đã tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Hình 1.7) [18], [35]

 Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate

(oligosaccharide) vào với amino acid Asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong

chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = Asparagine; X = amino

acid bất kì, trừ Proline; S/T = Serine hoặc Threonine) [14] Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của Asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của

HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của virus [4], [14], [35]

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cúm A,

khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh được cho người, và rất

có thể virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp (vay mượn) gen HA hay NA, hoặc cả hai gen của

các chủng virus cúm A đã thích nghi ở người, để tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống [18], [35]

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “kháng nguyên” (antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên”

(antigenic shift) ở virus cúm A (B)

1.4 SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH CÚM A/H5N1

1.4.1 Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người ở Việt Nam

Trước tình hình dịch bệnh và những thông tin đầu tiên về đại dịch có thể xảy

ra bất cứ lúc nào, ngay từ năm 2005 đến nay các nhà sản xuất vắc xin tại Việt nam dưới sự tài trợ của nhiều tổ chức quốc tế đang nỗ lực phấn đấu phát triển công nghệ sản xuất vắc xin cúm nói chung và vắc xin cúm đại dịch nói riêng Có thể điểm qua như sau:

 Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số I thuộc bộ Y tế (Vabiotech) từ giữa năm

2004 phát triển kỹ thuật sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người trên tế bào thận khỉ tiên phát Chủng sản xuất ban đầu sử dụng là một chủng tái tổ hợp từ chủng virus A/Vietnam/1203/2004 với 1 chủng tái hợp từ chủng virus phòng thí nghiệm do trường đại học Tokyo, Nhật Bản cung cấp Hiện nay, loại vắc xin này đã qua giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha III trên người tình nguyện Tuy nhiên, vì là công nghệ mới, vắc xin được sản xuất trong phòng thí nghiệm nên vắc xin cũng chỉ dừng ở mức độ đề tài nghiên cứu

 Viện Vắc xin và sinh phẩm Y tế (IVAC): Từ năm 2006 đến 2009, thực hiện đề

tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 trên trứng gà có

phôi”, Viện đã sử dụng chủng NIBRG-14 nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành

công ở qui mô phòng thí nghiệm các lô vắc xin cúm A/H5N1 Chủng NIBRG-14 được tạo bằng kỹ thuật di truyền đảo ngược từ chủng virus A/H5N1 hoang dại độc lực cao A/Vietnam 1194/2004 và chủng virus cúm phòng thí nghiệm PR8 Chủng do Viện NIBSC –Vương quốc Anh cung cấp và được sự công nhận của TCYTTG Kết quả nghiên cứu cho thấy vắc xin cho đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm đạt yêu cầu theo khuyến cáo của TCYTTG Trên cơ sở thành công của đề tài, năm 2007, Viện đã được TCYTTG chọn là một trong các cơ sở nằm trong chiến lược dự trữ vắc xin cúm đại dịch cho toàn cầu và được tài trợ xây dựng một nhà máy đạt chuẩn GMP-WHO để sản xuất vắc xin cúm với công suất 1 -3 triệu liều vắc xin/năm Tiếp theo, năm 2011, Tổ chức PATH (Mỹ) đã tiếp tục tài trợ nguồn kinh phí để vận hành nhà máy Sản phẩm vắc xin cúm A/H1N1 sản xuất trên dây chuyền công nghệ của

nhà máy hiện nay đang được thử nghiệm lâm sàng trên người Tiếp tục chiến lược sản xuất vắc xin cho đại dịch, từ tháng 10/2011 đến nay nhà máy bắt đầu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 bằng chủng NIBRG-14, hướng tới thử nghiệm lâm sàng dự kiến thực hiện vào năm 2013 cho loại vắc xin này Nếu thử nghiệm lâm sàng thành công, Vắc xin sẽ được đăng ký cấp phép sản xuất ở qui mô công nghiệp với công suất 1-3 triệu liều/năm, đủ đáp ứng cho nhu cầu phòng chống dịch cho các đối tượng

có nguy cơ cao

 Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu phát triển dạng vắc xin nuôi cấy trên tế bào VERO, sử dụng chủng NIBRG-14 Tuy nhiên dạng vắc xin này cũng

mới chỉ dừng ở mức độ đề tài nghiên cứu

1.4.2 Chủng NIBRG-14 trong sản xuất vắc xin cúm

 Cách tạo ra chủng NIBRG-14

Nguyên lý của kỹ thuật di truyền ngược như sau:

Reverse genetics (kỹ thuật di truyền ngược) là một thuật ngữ được sử dụng trong ngành virus học phân tử để chỉ việc tạo ra virus từ cDNA tách dòng Hệ thống di truyền ngược đầu tiên được áp dụng cho virus RNA sợi dương từ năm

1978 Khác với virus RNA sợi dương, bản 20 các gen của virus RNA sợi âm không

có khả năng tự lây nhiễm Do đó việc phiên mã và tái bản virus sợi âm đòi hỏi sự đồng biểu hiện của phức hệ polymerase virus và sự tạo thành phức hệ giữa RNA và nucleoprotein

Năm 1994, Conzelmann và cộng sự, với virus dại tái tổ hợp, lần đầu tiên đã chứng minh được khả năng tạo ra virus RNA sợi âm hoàn toàn từ cDNA tách dòng Yếu tố quyết định thành công này là sự tổng hợp (+) antigenome từ cDNA để không bắt cặp với (+) mRNA mã hóa cho protein L, N, P, vì thế không cản trở quá trình tái bản virus Hơn nữa genome của virus chứa chuỗi uridine và cấu trúc kẹp tóc tương tự như T7 terminator, nên nếu dùng genome này làm khuôn thì sẽ dẫn đến sự phiên mã không hoàn chỉnh Phương pháp này được áp dụng cho Rhabdovirus, Paramyxovirus và Ebola virus (thuộc họ Filoviridae) Những kinh nghiệm rút ra được bao gồm: biểu hiện T7 RNA polymerase trong những dòng tế

bào ổn định, thiết kế những plasmid biểu hiện protein và những kỹ thuật sốc nhiệt

để nâng cao hiệu suất tái bản virus

Việc tạo ra virus cúm phức tạp hơn nhiều vì quá trình tái bản virus cần đủ 8 phân đoạn và 4 protein (PB1, PB2 PA và NP) Hơn nữa, virus cúm tái bản trong nhân tế bào bị nhiễm, nên các vRNA và protein phải đi vào được trong nhân Hobom và cộng sự đã sử dụng hệ RNA polymerase I để sinh tổng hợp vRNAs (của virus cúm) nội bào Hệ RNA pol I bao gồm 1 cDNA của virus cúm nằm giữa RNA pol I promoter và terminator Cũng nhờ giải pháp này, năm 1999, virus cúm đã được tạo ra từ plasmid mà không cần sự có mặt của virus trợ giúp Hiệu suất của phương pháp này là tạo ra 108 virus (có khả năng lây nhiễm)/ml huyền phù tế bào sau 2 ngày chuyển nhiễm

Hoffmann và Webster đã cải tiến hệ RNA pol I trên nhằm tổng hợp được cả (-) vRNA và (+) mRNA từ cùng một khuôn, nhờ đó giảm được số lượng plasmid cần thiết (12 → 8 plasmid) Plasmid chủng A/WSN/33 (H1N1) được tạo thành công bằng phương pháp này với hiệu suất 1×103 virus/ml huyền phù tế bào sau 24 giờ nuôi cấy Tác dụng gây độc tế bào xuất hiện sau 48 giờ và hiệu suất virus thu được sau 72 giờ là 2×107 virus/ml Chủng A/WSN/33 tái tổ hợp có nguồn gốc từ chủng gây đại dịch cúm ở người (1918) có khả năng tái bản trong não chuột và phát triển trong hệ tế bào nuôi cấy (tế bào MDCK và 293T)

Bằng cách này chủng vắc xin NIBRG-14 ra đời được TCYTTG công nhận và khuyến cáo là chủng sản xuất vắc xin chính thức (hình 1.8)

Sử dụng tế bào Vero, Nicolson và cộng sự đã tạo thành công những chủng virus tái tổ hợp khác nhau có khả năng tái bản cao trong trứng hoặc tế bào MDCK Những chủng này đều có tính kháng nguyên giống chủng gốc (chứa HA và NA) ban đầu, đã được kiểm tra độc tính trên gà và chuột HA được loại đoạn độc bằng cách PCR riêng rẽ từng phân đoạn HA1 và HA2, sau đó gắn hai phân đoạn lại nhờ hai đầu dính tại vị trí SapI, nhân sản phẩm gắn kết (recombinant PCR) để gắn vào vector pPST phục vụ cho biến nạp Bằng phương pháp này, nhóm nghiên cứu đã tạo được chủng NIBRG-14 không độc trong vòng 20 ngày, đạt tiêu chuẩn để sử

dụng làm chủng sản xuất Vắc xin Toàn bộ quá trình được thực hiện trong phòng thí nghiệm có độ an toàn sinh học cao (BSL 4)

Tế bào 293T được biến nạp với những plasmid được đánh dấu (+) Sau 48 hoặc 72 giờ, hiệu giá virus được xác định bằng kỹ thuật vết tan trên tế bào MDCK

3 thí nghiệm được lặp lại và lấy kết quả trung bình Tất cả các giá trị TCID50/ml phản ánh số liệu thu được sau 48 giờ nhiễm nạp

Hình 1.8 Bằng kĩ thuật di truyền ngược chủng gốc NIBRG-14 được tạo ra từ 6 gen của virus A/PR8/34(H1N1) và 2 gen của virus A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), trong

đó gen HA bị đột biến mất đoạn để giảm độc lực, cho phép virus này tái tổ hợp này

nhân lên bằng công nghệ phôi trứng gà [1], [2]

Hệ thống kể trên đã cho phép tạo ra virus tái tổ hợp theo nguyên tắc “6+2” một cách chính xác và không cần bất kỳ một kỹ thuật sàng lọc nào thêm Để tăng thêm hiệu suất tạo thành virus, số lượng plasmid biến nạp vào tế bào đã được nghiên cứu Có thể nói việc sử dụng kĩ thuật di truyền ngược là một hướng đi hợp

lý để tạo chủng virus phục vụ cho sản xuất vắc xin cúm gia cầm với tốc độ nhanh,

áp dụng được trên dòng tế bào đã được công nhận, áp dụng được với mọi chủng virus gây bệnh thuộc các phân type khác nhau được công bố, loại bỏ được đoạn độc

trên gene HA, tránh được sự tạp nhiễm (virus hoang dại từ dòng tế bào không chuẩn hoặc virus chứa các độc tố khác)

Chủng NIBRG-14 đã chứng minh được tính an toàn và tính ổn định di truyền

và chính thức được TCYTTG công nhận là chủng dúng cho sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người

 Tiêu chuần chất lượng của chủng sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 (Tiêu chuẩn

cơ sở)

Căn cứ theo các yêu cầu của TCYTTG qui định về việc dùng chủng virus cúm trong sản xuất vắc xin cúm, Viện Vắc xin đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho chủng dùng sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 như sau:

 Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 gốc giống (MSL)

- Nhận dạng: trình tự của gen HA và NA không khác biệt so với chủng nguyên gốc (theo TRS 927, 2005)

- Vô trùng: không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên môi trường nuôi cấy TSB và Thioglycolate (theo DĐVN IV, 2009)

- Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) phải ≥1/640 (dựa trên TRS 927, 2005)

- Hiệu giá chủng (EID50/ml) phải ≥ 106,5

(theo TRS 927, 2005)

 Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 làm việc (WSL)

- Vô trùng: không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên môi trường nuôi cấy TSB và Thioglycolate (theo DĐVN IV, 2009)

- Mycoplasma: không có sự hiện diện của Mycoplasma gallisepticum,

Mycoplasma synoviae và Mycobacterium avium (theo TRS 927, 2005)

- Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) phải ≥ 1/640 (TRS

927, 2005)

- Hiệu giá chủng (EID50/ml) phải ≥ 106,5

(TRS 927, 2005)

- Môi trường Thioglycolate

- Môi trường TSB (Tryp Soyabeen Broth)

- Môi trường thạch TSA (Tryp Soyabeen Agar)