Xác định liều gây nhiễm EID50

 Nguyên tắc:

Virus cúm có khả năng sống và nhân lên trong dịch niệu của trứng gà có phôi và sự hiện diện của virus cho phản ứng ngưng kết hồng cầu dương tính.

 Cách thực hiện:

- Pha loãng chủng trong dung dịch PBS 0,01M vô trùng, pH: 7 - 7,2 thành 10 độ pha từ 10^-1 đến 10^-10. Mỗi độ pha tiêm 10 trứng của trứng gà có phôi 10 ngày tuổi, mỗi trứng 0,2 ml vào khoang niệu. Sau khi tiêm, trứng được hàn kín bằng parafin lỏng và ấp tiếp trong tủ ấm 33,5⁰C, có độ ẩm 60-70%. Sau 24h và 48h trứng được soi để loại bỏ những quả chết. Sau 72h trứng được chuyển sang tủ lạnh 4⁰C để qua đêm. Thu hoạch dịch niệu từ mỗi quả trứng riêng rẽ và xác định khả năng nhân lên của virus trong mỗi trứng bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.

- Cho 50 µl PBS 0,01M + BSA 0,5% vào tất cả các giếng

- Thêm 50 µl dung dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng

- Thêm 50 µl của dịch niệu nang gặt từ trứng vào các giếng của phiến

- Lắc đều trong 1 phút

- Đậy nắp phiến

- Đặt phiến ở nhiệt độ phòng tại nơi yên tĩnh, tránh rung lắc

- Đọc kết quả sau 30 phút cho đến 4h

 Kết quả EID50 của chủng giống được xác định bằng phương pháp Reed- Muench.

Bảng 2.1. Cách tính EID50 của liều gây nhiễm

Tỷ lệ nhiễm Tích lũy Tổng tích lũy

Độ pha ^{Log độ} pha ^Dương tính ^{Âm tính} Dương tính ^{Âm tính Số %} 10⁴ 4 10 0 22 0 22 100 10⁵ 5 8 2 12 2 14 86 10⁶ 6 4 6 4 8 12 33 10⁷ 7 0 10 0 18 18 0 10⁸ 8 0 10 0 28 28 0

Theo bảng EID50 của 0,1 ml của chủng WSL hay MSL nằm giữa 10^-5 và 10^-6. EID50 được tính như sau:

Log 50% = log độ pha loãng cao nhất ↑ 50% dương tính + khoảng cách * log 10

Khoảng cách = Log 50% = 5+ * log 10 Log 50%= 5+ 0,7 50% = 10^5,7 EID50 (0,1 ml) = 10^5,7 EID50 (ml) = 10^6,7

2.4.2.2. Xác định hiệu giá HA (Haemaagglutinin: phản ứng ngưng kết hồng cầu)

 Nguyên tắc phản ứng:

Kháng nguyên cần xác định hiệu giá được pha loãng bậc 2 thành các độ pha khác nhau trên phiến nhựa 96 giếng, đáy chữ U hoặc V. Sau đó bổ sung dung dịch hồng cầu gà 1%. Nếu trong giếng có kháng nguyên hemagglutinin sẽ ngưng kết hồng cầu và không cho hồng cầu lắng xuống đáy giếng tạo thành hình dù ở đáy giếng. Ngược lại, nếu không bị kháng nguyên gây ngưng kết, hồng cầu sẽ lắng xuống đáy giếng tạo một chấm nhỏ màu đỏ.

 Các bước tiến hành:

- Xác định vị trí của chứng Hồng cầu, chứng kháng nguyên.

- Cho 50 µl của mỗi mẫu thử hoặc chứng dương vào mỗi giếng của 2 giếng đầu tiên liên tiếp theo hàng ngang hay hàng dọc tùy theo ước lượng mẫu có hiệu giá cao hay thấp.

- Pha loãng mẫu thử và chứng dương theo bậc 2. Loại 50 µl của hàng (hay cột) cuối cùng của dãy pha loãng,

- Cho 50 µl dung dịch hồng cầu gà 1% trong PBS 0,01M + 0,5% BSA vào tất cả các giếng.

- Lắc nhẹ phiến trong vòng 1 phút.

- Đậy nắp phiến.

- Đặt phiến ở nhiệt độ phòng tại nơi yên tĩnh, tránh rung lắc.

- Đọc kết quả sau 30 phút cho đến 4 giờ.

Pha loãng

bậc 2 ^{Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Giếng đối chứng}

A=1/10 B= 1/20 C= 1/40 D= 1/80 Chứng hồng cầu E= 1/160 F= 1/320 G= 1/640 H= 1/1280 Chứng kháng nguyên

Hình 2.10. Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu

 Kết quả và cách tính kết quả:

Dựng thành phiến lên theo chiều đứng, giữ trong 5-10 phút đợi cho chứng âm hoặc chứng hồng cầu chảy xuống thành giếng hoàn toàn. Đặt phiến trên gương để đọc

kết quả. Kết quả dương tính khi hồng cầu bị ngưng kết không chảy xuống thành giếng khi dựng phiến theo chiều đứng.

- Hiệu giá ngưng kết hồng cầu là độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên mà vẫn còn gây ngưng kết hồng cầu. Giá trị nghịch đảo của độ pha loãng là hiệu giá ngưng kết của kháng nguyên được tính bằng 1 đơn vị HA.

- Ví dụ: Kháng nguyên dùng trong phản ứng được pha loãng từ 1/10 đến 1/2560, độ pha loãng cho phản ứng (+) là 1/128 thì kháng nguyên đó có 128 đơn vị HA.

* Đọc kết quả:

- Điều kiện để thử nghiệm có giá trị tin cậy:

- Chứng dương: phải gây ngưng kết hồng cầu đúng theo đơn vị kháng nguyên đã biết trước.

- Chứng âm: không có hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu.

- Chứng hồng cầu: không có hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu