Phát hiện Mycoplasma

Mycoplasma là một loài vi khuẩn có phân bố rộng rãi trong các mô và tế bào có

nguồn gốc động vật. Vi khuẩn này có kích thước rất nhỏ (0,2 – 0,3 µm), không vách nên không có khả năng mọc trên các môi trường thông thường. Phát hiện sự tạp nhiễm

Mycoplasma đặc biệt quan trọng trong chủng giống sản xuất (WSL) nên sử dụng 2

phương pháp nuôi cấy gián tiếp trên các môi trường đặc hiệu và phương pháp PCR với bộ kít Univeral Mycoplasma Detection để bổ sung cho nhau, tăng khả năng phát hiện.

 Phương pháp nuôi cấy gián tiếp bằng màng lọc:

- Mẫu thử được lọc qua màng lọc 0,1µm qua hệ thống lọc của Satorius. Sau đó màng lọc được cấy vào 2 chai môi trường LM1 và LM2. Ủ mẫu ở 37⁰C, trong khí trường có C02 5% trong 14 ngày. Sau đó cấy chuyển sang 2 tube môi trường mới LM1 và LM2 tương ứng (200µl/10ml môi trường/ ống x 2 tube/loại môi trường). Tiếp tục ủ mẫu và theo dõi trong 14 ngày ở 37^oC và trong điều kiện khí trường 5% C02.

- Nếu môi trường chuyển màu, nghi ngờ có sự phát triển của Mycoplasma trong

mẫu thử, tiếp tục cấy mẫu nghi ngờ sang thạch PPLO để phát hiện khuẩn lạc của

Mycoplasma và tiếp tục định danh bằng các cộng hợp gắn huỳnh quang nếu cần.

- Đọc kết quả: Theo dõi sự có mặt của Mycoplasma thông qua sự thay đổi màu của môi trường.

Kết quả dương tính khi:

Nếu có ít nhất 1 trong 3 môi trường có các dấu hiệu sau:

- Màu của canh thang LM1 chuyển từ màu đỏ sang màu cam.

- Màu của canh thang LM2 chuyển từ màu vàng cam sang màu đỏ tím.

- Khuẩn lạc có hình trứng ốp lếch trên môi trường thạch.

Kết quả âm tính khi:

- Màu của 2 loại môi trường không thay đổi, giữ nguyên như màu môi trường đối chứng.

- Không có sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường thạch.

 Phương pháp PCR phát hiện Mycoplasma

Sử dụng bộ kit Universal Mycoplasma Detection- ATCC. Bộ kít có thể phát hiện trên 60 loại Mycoplasma dựa trên sản phẩm PCR có kích thước trong

Bảng 2.2. Thành phần cho 1 mẫu phản ứng PCR (25µl) Thành phần ^Mẫu thử Đối chứng dương Đối chứng dương + mẫu thử Đối chứng âm PCR mix + primer mix 22,5µl 22,5 µl 22,5 µl 22,5 µl Mẫu thử 2.5 µl ---- 2,5 µl ---- Đối chứng dương ---- 2,5 µl 1,0 µl ---- H₂0 hoặc TE ---- ---- ---- 2,5 µl Tổng thể tích 25 µl 25 µl 26 µl 25 µl

Bước 1 Khởi động: 94⁰C trong 1,5 phút Các thông số

Bước 2

Nhiệt độ (⁰C) Thời gian (giây) Chu kì

Biến tính 94 30

Bắt mồi 70→60,5 30

Kéo dài 72 45

20

Bước 3 Tiếp tục các chu trình trên

Biến tính 94 30

Bắt mồi 60 30

Kéo dài 72 45

12

Bước 4 ổn định: 72⁰C trong 4 phút giữ ở 4⁰C

Hình 2.11. Sơ đồ chu trình nhiệt:

CHƯƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN