Kết quả đánh giá chất lượng của lô chủng WSL được nhân truyền từ

NIBRG-14 nguyên gốc

Từ ống chủng MSL ban đầu với 4 lần cấy truyền liên tiếp tạo được 4 lô chủng giống P1, P2, P3 và P4. Các lô chủng giống này được kiểm tra các chỉ tiêu về vô trùng,

Mycoplasma, hiệu giá HA và hiệu giá chủng. Các kết quả được chỉ ra dưới đây;

 Kiểm tra vô trùng

Qui trình kiểm tra vô trùng được thực hiện theo qui trình của Dược điển Việt Nam II, 2002 bằng phương pháp cấy trực tiếp vào 2 môi trường chuẩn Thioglycolate và Tryp Soyabean Borth (TSB). Sau 14 ngày ủ ở nhiệt độ 30-32⁰C, kết quả cho thấy tất cả các lô chủng từ P1 đến P4 đều đạt yêu cầu về vô trùng.

 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma

 Kết quả kiểm tra Mycoplasma trên môi trường canh thang LM1 và LM2

Nuôi cấy mẫu thử là các lô chủng P1,P2, P3 và P4 trên 2 môi trường LM1 và LM2 theo qui trình của Viện Vắc xin, cho thấy cả 4 lô chủng đều không có dấu hiệu tạp nhiễm Mycoplasma (hình 3.5)

Hình 3.5. Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma trên môi trường canh thang LM1 và LM2 Nhận xét:

Các mẫu thử đều cho phản ứng âm tính trên môi trường canh thang LM1 và LM2. Màu của 2 loại môi trường không thay đổi, giữ nguyên như màu môi trường đối chứng

 Kết quả kiểm tra Mycoplasma bằng kỹ thuật PCR với bộ kít Univeral Mycoplasma Detection

Trong 4 lô chủng chúng tôi chọn 03 lô P1, P2 và P3 để kiểm tra Mycoplasma

bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR cho thấy ở các tất cả các giếng có chứng dương (giếng 1) hoặc chứng dương + mẫu thử (giếng 5 và 6) đều hiện diện DNA của

Mycoplasma thể hiện ở band có kích thước 464 bp, Trong khi đó các mẫu thử ở giếng

số 2, 3, 4 và giếng chứng âm số 7 đầu không có sự hiện diện của các band này (hình 3.2), chứng tỏ không có sự tạp nhiễm Mycoplasma trong mẫu thử chủng WSL.

Hình 3.6. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma bằng PCR Chú thích:

- Giếng M: Marker

- Giếng 1: chứng dương

- Giếng 5, 6: chứng dương + mẫu thử (chủng P1 và chủng P4)

- Giếng 7: chứng âm

- Giếng 2: mẫu thử (chủng P1),

- Giếng 3: mẫu thử (chủng P2),

- Giếng 4: mẫu thử (chủng P3),

Như vậy bằng 2 phương pháp kiểm tra đã có thể khẳng định chắc chắn tất cả các lô chủng P1, P2, P3 và P4 đều đạt yêu cầu không có sự hiện diện của Mycoplasma

 Kết quả kiểm tra hiệu giá HA

Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra hiệu giá HA HA chủng sau thu hoạch Lô chủng HA chủng khi gây nhiễm Trứng 1 Trứng 2 Trứng 3 Trứng 4 Trứng 5 Trứng 6 Trứng 7 HA trung bình P1 80 80 160 160 40 160 160 160 P2 160 160 80 160 320 320 640 320 320 P3 320 320 160 40 80 160 320 320 320 P4 160 160 40 160 160 160 160 Nhận xét:

Kết quả hiệu giá HA của các lô chủng từ P1 đến P4 đạt trung bình từ: 160 đến 320. Với lô chủng P3 và P4 cho hiệu giá HA trung bình cao nhất đạt 320. Kết quả này đã cao hơn gấp 4 lần so với chủng MSL ban đầu.

 Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng EID50

Kết quả chuẩn độ EID50 của 4 lô chủng P1-P4 được trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5: Kết quả liều gây nhiễm EID50 của chủng sản xuất EID50

Lô chủng Liều virus gây

nhiễm/trứng EID50/trứng (0,1 ml) EID50/ml P1 10^2,68 10^7,38 8,38 P2 10^3,68 10^7,45 8,45 P3 10^3,45 10^7,58 8.58 P4 10^3,58 10^7,63 8,63 Nhận xét:

Theo kinh nghiệm của các nhà sản xuất vắc xin cúm mùa của các công ty Sanofi Pasteur (Pháp), Baxter (Mỹ), các chủng dùng cho sản xuất có hiệu giá EID50 từ 7,9 /ml đến 8,9/ml là các chủng cho hiệu suất sản xuất cao và ổn định [11].Với độ pha 10^- 4

cho liều gây nhiễm tối ưu, các liều virus gây nhiễm được tính toán nằm trong khoảng từ 10^2,68 đến 10^4,63 , kết quả ở bảng 3.4 chỉ ra hiệu giá chủng thu được từ các lô P1 đến P4 đạt từ 8,38 /ml đến 8,63 /ml. EID50 cho biết số lượng hạt virus sống có thể nhân

lên trong trứng, đánh giá mức độ mạnh hay yếu của chủng sản xuất. EID50 càng cao thì số lượng hạt virus sống càng nhiều và chủng càng mạnh. Trong khi đó HA chỉ phản ánh sự hiện diện của kháng nguyên có trên bề mặt của hạt virus, có thể là virus sống hay đã bất hoạt. Mặc dù HA không đại diện cho số lượng hạt virus sống nhưng hiệu giá HA cao đã phản ánh phần nào hiệu giá chủng (EID50) cao tương ứng. Điều này được thể hiện khi so sánh kết quả của bảng 3.3 và 3.4.

Như vậy với kết quả trên tất cả các lô đều có thể được chọn dùng làm chủng WSL trong sản xuất vắc xin.

 Kết quả kiểm tra tính ổn định về hiệu giá HA và hiệu giá chủng của các lô P2 và P3

Tiến hành kiểm tra tính ổn định về hiệu giá HA và Hiệu giá chủng của các lô P2 và P3 được thể hiện ở bảng 3.5

Bảng 3.6. Kiểm tra tính ổn định về hiệu giá HA và hiệu giá chủng EID50 của lô P2 và P3

Lô chủng P2 P2 sau 1 tuần đông băng P3 P3 sau 1 tuần đông băng

HA cao nhất 640 320 320 320

EID50 (ml) 8,38 8,56 8,45 8,40

Nhận xét:

Sau 1 tuần bảo quản đông băng thì chủng NIBRG-14 của lô P3 vẫn giữ được tính ổn định về hiệu giá HA là 320. Ở lô P2 thì kết quả về hiệu giá HA sau 1 tuần giảm từ 640→ 320, tuy nhiên thì hiệu giá này vẫn ở mức cao. Hiệu giá chủng EID50 của 2 lô P2 và P3 không có sự thay đổi quá cao sau 1 tuần đông băng. Như vậy, sau 1 tuần đông băng 2 lô này đều có thể chọn làm chủng WSL trong sản xuất vắc xin.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép rút ra một số kinh nghiệm như sau:

- Đã xác định được qui trình nhân chủng virus cúm NIBRG-14 (H5N1) tạo chủng WSL từ chủng MSL với việc truyền chủng 3-4 đời liên tiếp trên trứng gà có phôi ở liều gây nhiễm tối ưu từ 2,58 đến 3,68 cho 1 trứng.

- Đã tạo được 04 lô chủng WSL đạt yêu cầu chất lượng theo qui định trong đó hiệu giá chủng EID50 đạt từ 8,38 đến 8,63.

- Đã xác định được tính ổn định về hiệu giá chủng EID50 và hiệu giá HA của chủng WSL sau 1 tuần đông băng.

2. KIẾN NGHỊ

Từ các nghiên cứu ở trên, cho phép kiến nghị như sau:

- Tiếp tục đánh giá tính ổn định của chủng WSL và thẩm định chất lượng của chủng thông qua hiệu suất của 03 lô vắc xin sản xuất thử nghiệm.

- Hoàn thiện hồ sơ chủng WSL theo đúng qui định GMP.

- Đưa chủng WSL vào sản xuất chính thức sau khi đã có kết quả thẩm định chất lượng chủng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Lê Trần Bình (2007), Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm năm 2006 - 2007, Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước, Trung tâm Thông tin và Tư liệu Quốc gia và Bộ Khoa học và Công nghệ, Hà Nội. 2. Lê Trần Bình, Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2006), Phân tích mối tương đồng kháng nguyên và miễn dịch của virus cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vaccine cúm A/H5N1, Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(3): 291-296.

3. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

4. Phan Văn Chi, Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Quyền Đình Thi, Phạm Việt Cường, Lê Trần Bình (2008), Phân tích đặc tính glycosyl hóa gen kháng nguyên H5 ở các chủng virus cúm A/H5N1 vaccine và cường độc gây bệnh, Tạp chí Công nghệ Sinh học (đã nhận đăng).

5. Nguyễn Tiến Dũng (2008), Vài nét về virus cúm gia cầm H5N1, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y 14(4): 80-86.

6. Lê Văn Hiệp (2006), Vắcxin học những vấn đề căn bản, Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

7. Lê Thanh Hòa (2006), “Chiến lược nghiên cứu ứng dụng virus vector tái tổ hợp trong sản xuất vaccine thế hệ mới”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(4): 397-416.

8. Lê Thanh Hòa (2006), Y-sinh học phân tử, quyển 1, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 9. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 2(1): 1-18.

10. Lê Thanh Hòa, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008), So sánh và phân tích đặc tính đột biến trượt-xóa gen NA(N1) theo thời gian tiến hóa của virus cúm A/H5N1 ở các chủng của Việt Nam và thế giới, Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(2): 153-159.

11. Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp (2006), Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống cúm A/H5N1 cho người trên phôi gà từ chủng NIBRG-14 tại Viện vaccine và sinh phẩm y tế, Tạp chí Y học dự phòng 5(84): 5-10.

12. Bạch Thi Như Quỳnh (2006), Nghiên cứu tạo giống từ chủng gốc NIBRG - 14 để phục vụ sản xuất vaccine cúm H5N1, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật.

13. Nguyễn Thị Kim Tiến (2005), Dịch tễ học, virus học bệnh cúm A(H5N1) trên người tại khu vực phía Nam, Tạp chí Y học thực hành 517(8): 46-49.

TIẾNG ANH

14. Baigent SJ, McCauley JW (2001), Glycosylation of haemagglutinin and stalk- length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture. Virus Res 79(1-2): 177-185.

15. Basler CF (2007), Influenza viruses: basic biology and potential drug targets. Infect Disord Drug Targets 7(4): 282-93.

16. Bender C, Hall H, Huang J, Klimov A, Cox N, Hay A, Gregory V, Cameron K, Lim W and Subbarao K (1999), Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 – 1998, Virology 254: 115-123.

17. Fang LQ, de Vlas SJ, Liang S, Looman CW, Gong P, Xu B, Yan L, Yang H, Richardus JH, Cao WC (2008), Environmental factors contributing to the spread of H5N1 avian influenza in mainland China. PLoS o¬nE 3(5): e2268.

18. Hilleman M (2002), Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control. Vaccine 20(25-26): 3068-3087.

19. Horimoto T, Kawaoka Y (2001), Pandemic threat posed by avian influenza A viruses. Clin Microbiol Rev 14(1): 129-149.

20. Horimoto T, Kawaoka Y (2006), Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses. Trends Mol Med 12(11): 506-514.

21. Ito T, Couceiro JN, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci MR, Donatelli I, Kida H, Paulson JC, Webster RG and Kawaoka Y (1998), Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J Virol 72: 7367-7373.

22. Murphy BR, Webster RG (1996), Orthomyxoviruses. In Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds.) Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia: 1397-1445. 23. Nayak D, Hui E, Barman S (2004), Assembly and budding of influenza virus, Virus Res 106(2):147-165.

24. Nicholson KG, Wood JM, Zambon M (2003), Influenza, Lancet 362(93970: 1733-1745. 25. Nicolson C, Major D, Wood JM, Robertson JS (2005) 26. OIE - World organisation for animal health (2005), Avian influenza, Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals, (http://www.oie.int/ Eng/info_ev/en_AI_avianinfluenza.htm)

27. Prel A, Le Gall-Reculé G, Jestin V (2008), Achievement of avian influenza virus- like particles that could be used as a subunit vaccine against low-pathogenic avian influenza strains in ducks. Avian Pathol 37(5): 513-520.

28. Suzuki Y (2005), Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. Biol Pharm Bull 28(3): 399-408. Review

29. Webster RG (1998), Influenza: an emerging disease, Emerg Infect Dis 4: 436-441. 30. Weber TP, Stilianakis NI (2007), Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg Infect Dis 13(8): 1139-1143.

31. ”Who expert committee on biological standardization, world health organization, geneva 2005”

32. WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group (2008), Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1).

CÁC TRANG WEB ĐÃ THAM KHẢO

33 “Avian influenza”, http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/en

34.http://www.soytedaklak.gov.vn/modules.php?name=News&opcase=detailsnew s&mcid=331&mid=1848

35. http://www.kilobooks.com/threads/58487-Tổng-quan-về-virus-cúm-A-H5N1- vấn-đề-dịch-tễ-học-tiến-hóa-hình-thành-genotype-và-tương-đồng-kháng-nguyên- miễn-dịch-vaccine#ixzz1zEu9ixws

PHỤ LỤC

1. CÁCH PHA CÁC DUNG DỊCH

Bảng 1.1. Thành phần dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 0.01M, pH =7.2 STT Thành phần Số lượng Đơn vị 1 NaCl 8.015 G 2 Na₂HPO₄.7H₂0 2.6807 G 3 KH₂PO₄ 0.0408 G 4 Nước cất 1000 Ml

Đo pH, chỉnh pH =7.2. Khử trùng 0.8 atm, 15 phút. Bảo quản 4⁰C

Bảng 1.2. Thành phần dung dịch hồng cầu gà 1% STT Thành phần Số lượng Đơn vị 1 Hồng cầu 1 Ml 2 Dung dịch PBS 0.01M + 0.5% BSA 99 Ml Bảng 1.3. Thành phần dung dịch PBS 0.01M + 0.5% BSA STT Thành phần Số lượng Đơn vị 1 BSA 0.5 G 2 Dung dịch đệm PBS 0.01M, pH =7.2 100 Ml

2. Môi trường LM1(Liquit Medium 1) và LM2 (Liquit Medium 2)

Bảng 2.1. Thành phần môi trường canh thang được chuẩn bị trước khi đưa vào sử dụng trước 1 ngày Công thức pha tính cho 100ml

LM1 LM2 Thành phần 100 ml 100 ml Nước cất 75 ml 75 ml PPLO agar 2.7 g 2.7 g L-Arginin 0.3 g 0.5% đỏ phenol 0.5 ml 0.5 ml

Hấp ướt 121⁰C/ 15 phút

Bảng 2.2. Hoàn thiện các thành phần còn lại

LM1 LM2

Thành phần

100 ml 100 ml

25% Yeast Extract 10 ml 10 ml

Huyết thanh ngựa 15 ml 15 ml

25% Glucose 1.2 ml

Penicillin 100 IU/ 1ml 100 IU/ 1ml

HCl 1N Điều chỉnh pH

NaOH 1N Điều chỉnh pH

pH đạt 7.6-7.8 7.0- 7.2

Bảng 2.3. Thành phần môi trường thạch

Công thức pha tính cho 100 ml

LM1 LM2 Thành phần 100 ml 100 ml Nước cất 75 ml 75 ml PPLO broth 2.7 g 2.7 g Hấp ướt 121⁰C/ 15 phút

Bảng 2.4. Hoàn thiện các thành phần còn lại

LM1 LM2

Thành phần

100 ml 100 ml

25% Yeast Extract 10 ml 10 ml

Huyết thanh ngựa 15 ml 15 ml

25% Glucose 1.2 ml

Penicillin 100 IU/ 1ml 100 IU/ 1ml

3. Tiêu chuẩn chất lượng của chủng sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 Bảng 3.1. Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 gốc giống (MSL)

STT Chỉ tiêu Phương pháp ^{Tiêu chuẩn chấp}

nhận

Tiêu chuẩn áp dụng

1 Vô trùng

Nuôi cấy trực tiếp trên môi trường TSB và Thioglycolate

Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên cả 2 loại môi trường nuôi cấy

DĐVN IV, 2009 2 Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) Phản ứng ngưng kết với hồng cầu gà (CRBC) ≥ 1/640 TCCS dựa trên TRS 927, 2005 3 Hiệu giá chủng (EID50/ml) Chuẩn độ trên trứng gà

có phôi 10 ngày tuổi ^{≥ 10} 6,5

TCCS dựa trên TRS 927, 2005

Bảng 3.2. Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 làm việc (WSL)

TT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp nhận

Tiêu chuẩn áp

dụng

1 Vô trùng

Nuôi cấy trực tiếp trên môi trường TSB

và Thioglycolate

Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên cả 2 loại

môi trường nuôi cấy

DĐVN IV, 2009

2 Nhận dạng

Khuếch đại và giải trình tự 2 gen mã hóa

protein HA và NA

Trình tự của gen HA và NA không khác biệt so với chủng

nguyên gốc

TRS 927, 2005

3

Xác định không có sự hiện diện của

Mycoplasma

PCR hoặc phương pháp nuôi cấy

Không có sự hiện diện của

Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae và

Mycobacterium avium

TRS 927, 2005

4 Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) Phản ứng ngưng kết với hồng cầu gà (CRBC) ≥ 1/640 TCCS dựa trên TRS 927, 2005 5 Hiệu giá chủng (EID50/ml) Chuẩn độ trên trứng gà có phôi 10 ngày tuổi ≥ 10^6,5 TCCS dựa trên TRS 927, 2005