Cách tạo ra chủng NIBRG-14
Nguyên lý của kỹ thuật di truyền ngược như sau:
Reverse genetics (kỹ thuật di truyền ngược) là một thuật ngữ được sử dụng trong ngành virus học phân tử để chỉ việc tạo ra virus từ cDNA tách dòng. Hệ thống di truyền ngược đầu tiên được áp dụng cho virus RNA sợi dương từ năm 1978. Khác với virus RNA sợi dương, bản 20 các gen của virus RNA sợi âm không có khả năng tự lây nhiễm. Do đó việc phiên mã và tái bản virus sợi âm đòi hỏi sự đồng biểu hiện của phức hệ polymerase virus và sự tạo thành phức hệ giữa RNA và nucleoprotein.
Năm 1994, Conzelmann và cộng sự, với virus dại tái tổ hợp, lần đầu tiên đã chứng minh được khả năng tạo ra virus RNA sợi âm hoàn toàn từ cDNA tách dòng. Yếu tố quyết định thành công này là sự tổng hợp (+) antigenome từ cDNA để không bắt cặp với (+) mRNA mã hóa cho protein L, N, P, vì thế không cản trở quá trình tái bản virus. Hơn nữa genome của virus chứa chuỗi uridine và cấu trúc kẹp tóc tương tự như T7 terminator, nên nếu dùng genome này làm khuôn thì sẽ dẫn đến sự phiên mã không hoàn chỉnh. Phương pháp này được áp dụng cho Rhabdovirus, Paramyxovirus và Ebola virus (thuộc họ Filoviridae). Những kinh nghiệm rút ra được bao gồm: biểu hiện T7 RNA polymerase trong những dòng tế
bào ổn định, thiết kế những plasmid biểu hiện protein và những kỹ thuật sốc nhiệt để nâng cao hiệu suất tái bản virus.
Việc tạo ra virus cúm phức tạp hơn nhiều vì quá trình tái bản virus cần đủ 8
phân đoạn và 4 protein (PB1, PB2 PA và NP). Hơn nữa, virus cúm tái bản trong nhân tế bào bị nhiễm, nên các vRNA và protein phải đi vào được trong nhân. Hobom và cộng sự đã sử dụng hệ RNA polymerase I để sinh tổng hợp vRNAs (của virus cúm) nội bào. Hệ RNA pol I bao gồm 1 cDNA của virus cúm nằm giữa RNA pol I promoter và terminator. Cũng nhờ giải pháp này, năm 1999, virus cúm đã được tạo ra từ plasmid mà không cần sự có mặt của virus trợ giúp. Hiệu suất của phương pháp này là tạo ra 108 virus (có khả năng lây nhiễm)/ml huyền phù tế bào sau 2 ngày chuyển nhiễm.
Hoffmann và Webster đã cải tiến hệ RNA pol I trên nhằm tổng hợp được cả (-) vRNA và (+) mRNA từ cùng một khuôn, nhờ đó giảm được số lượng plasmid cần thiết (12 → 8 plasmid). Plasmid chủng A/WSN/33 (H1N1) được tạo thành công bằng phương pháp này với hiệu suất 1×103 virus/ml huyền phù tế bào sau 24 giờ nuôi cấy. Tác dụng gây độc tế bào xuất hiện sau 48 giờ và hiệu suất virus thu được sau 72 giờ là 2×107 virus/ml. Chủng A/WSN/33 tái tổ hợp có nguồn gốc từ chủng gây đại dịch cúm ở người (1918) có khả năng tái bản trong não chuột và phát triển trong hệ tế bào nuôi cấy (tế bào MDCK và 293T).
Bằng cách này chủng vắc xin NIBRG-14 ra đời được TCYTTG công nhận và khuyến cáo là chủng sản xuất vắc xin chính thức (hình 1.8).
Sử dụng tế bào Vero, Nicolson và cộng sự đã tạo thành công những chủng virus tái tổ hợp khác nhau có khả năng tái bản cao trong trứng hoặc tế bào MDCK. Những chủng này đều có tính kháng nguyên giống chủng gốc (chứa HA và NA) ban đầu, đã được kiểm tra độc tính trên gà và chuột. HA được loại đoạn độc bằng cách PCR riêng rẽ từng phân đoạn HA1 và HA2, sau đó gắn hai phân đoạn lại nhờ hai đầu dính tại vị trí SapI, nhân sản phẩm gắn kết (recombinant PCR) để gắn vào vector pPST phục vụ cho biến nạp. Bằng phương pháp này, nhóm nghiên cứu đã tạo được chủng NIBRG-14 không độc trong vòng 20 ngày, đạt tiêu chuẩn để sử
dụng làm chủng sản xuất Vắc xin. Toàn bộ quá trình được thực hiện trong phòng thí nghiệm có độ an toàn sinh học cao (BSL 4).
Tế bào 293T được biến nạp với những plasmid được đánh dấu (+). Sau 48 hoặc 72 giờ, hiệu giá virus được xác định bằng kỹ thuật vết tan trên tế bào MDCK. 3 thí nghiệm được lặp lại và lấy kết quả trung bình. Tất cả các giá trị TCID50/ml phản ánh số liệu thu được sau 48 giờ nhiễm nạp.
Hình 1.8. Bằng kĩ thuật di truyền ngược chủng gốc NIBRG-14 được tạo ra từ 6 gen của virus A/PR8/34(H1N1) và 2 gen của virus A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), trong đó gen HA bị đột biến mất đoạn để giảm độc lực, cho phép virus này tái tổ hợp này
nhân lên bằng công nghệ phôi trứng gà [1], [2].
Hệ thống kể trên đã cho phép tạo ra virus tái tổ hợp theo nguyên tắc “6+2” một cách chính xác và không cần bất kỳ một kỹ thuật sàng lọc nào thêm. Để tăng thêm hiệu suất tạo thành virus, số lượng plasmid biến nạp vào tế bào đã được nghiên cứu. Có thể nói việc sử dụng kĩ thuật di truyền ngược là một hướng đi hợp lý để tạo chủng virus phục vụ cho sản xuất vắc xin cúm gia cầm với tốc độ nhanh, áp dụng được trên dòng tế bào đã được công nhận, áp dụng được với mọi chủng virus gây bệnh thuộc các phân type khác nhau được công bố, loại bỏ được đoạn độc
trên gene HA, tránh được sự tạp nhiễm (virus hoang dại từ dòng tế bào không chuẩn hoặc virus chứa các độc tố khác).
Chủng NIBRG-14 đã chứng minh được tính an toàn và tính ổn định di truyền và chính thức được TCYTTG công nhận là chủng dúng cho sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người.
Tiêu chuần chất lượng của chủng sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 (Tiêu chuẩn cơ sở)
Căn cứ theo các yêu cầu của TCYTTG qui định về việc dùng chủng virus cúm trong sản xuất vắc xin cúm, Viện Vắc xin đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho chủng dùng sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 như sau:
Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 gốc giống (MSL)
- Nhận dạng: trình tự của gen HA và NA không khác biệt so với chủng nguyên gốc (theo TRS 927, 2005).
- Vô trùng: không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên môi trường nuôi cấy TSB và Thioglycolate (theo DĐVN IV, 2009).
- Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) phải ≥1/640 (dựa trên TRS 927, 2005)
- Hiệu giá chủng (EID50/ml) phải ≥ 106,5 (theo TRS 927, 2005)
Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 làm việc (WSL)
- Vô trùng: không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên môi trường nuôi cấy TSB và Thioglycolate (theo DĐVN IV, 2009)
- Mycoplasma: không có sự hiện diện của Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae và Mycobacterium avium (theo TRS 927, 2005).
- Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) phải ≥ 1/640 (TRS 927, 2005).
CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Chủng NIBRG-14: Chủng sản xuất vắc xin tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền đảo ngược từ 2 chủng A/Vietnam/1194/2004 và PR8, do Viện NIBSC (Vương quốc Anh) cung cấp.
2.2. VẬT LIỆU
Nguyên vật liệu: Trứng gà sạch có phôi 9- 11 ngày tuổi ấp tại IVAC
Các dung dịch
- Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline)
- Dung dịch hồng cầu gà 1%
- Dung dịch cồn Iod 5%
- Môi trường Thioglycolate
- Môi trường TSB (Tryp Soyabeen Broth)
- Môi trường thạch TSA (Tryp Soyabeen Agar)
2.3. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ
Thiết bị
- Laminar (tủ cấy an toàn sinh học cấp độ II)
- Tủ ấp trứng 37,5-38,50C (Shennong-Trung Quốc)
- Tủ ủ trứng 34,5-35,50C (EHRET)
- Tủ lạnh 2- 80C (Sharp, Nhật Bản)
- Tủ lạnh sâu: -800C (Sanyo, Nhật Bản)
- Nồi hấp tiệt trùng (Hymaraya - Nhật Bản)
- Máy lắc tube (Đức)
- Đèn soi trứng (Việt Nam)
Dụng cụ
- Bút chì, bơm tiêm, đục lỗ, khay trứng
- Giá nhựa, đèn cồn, paraffin
- Phiến 96 giếng
- Pink, kẹp, kéo
- Tube thủy tinh các loại
Tất cả các thao tác được thực hiện trong Labo an toàn sinh học cấp 2
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp tạo chủng làm việc từ chủng gốc NIBRG-14 (MSL)
Phương pháp gây nhiễm virus trên trứng gà có phôi 9- 11 ngày tuổi
Ấp trứng
- Trứng gà đạt tiêu chuẩn được nhận từ trại chăn nuôi Suối Dầu.
- Khử trùng vỏ ngoài bằng choloramin 0,1% và cồn 70o.
- Ấp trứng trong tủ ấm 37,5oC – 38,50C và độ ẩm 65- 70%.
- Sau 5 ngày soi trứng để loại bỏ những quả chết và không phát triển thành phôi.
- Sau 10 ngày chọn trứng đạt tiêu chuẩn.
Gây nhiễm virus trên trứng có phôi
Pha chủng virus
- Lấy 1 ống chủng gốc (100) pha loãng bậc 10 trong đệm PBS lạnh để được các độ pha 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5 như sau:
10-1: 0,3 ml chủng nguyên gốc + 2,7 ml PBS
10-2: 0,5 ml (10-1) + 4,5 ml PBS
10-3: 0,5 ml (10-2) + 4,5 ml PBS
10-4: 0,5 ml (10-3) + 4,5 ml PBS
10-5: 0,5 ml (10-4) + 4,5ml PBS
Tiêm truyền chủng trên trứng
- Đánh dấu túi hơi và vị trí tiêm (đối diện với phôi) trên trứng
- Sát trùng điểm tiêm bằng cồn Iod 5%
- Lấy 0,2 ml chủng virus đã pha loãng tiêm vào khoang niệu đệm của trứng.
- Hàn kín điểm tiêm bằng parafin nóng chảy
- Ủ trứng ở 33,5oC có độ ẩm 65 -70%.
- Sau 24h và 48h soi trứng để loại bỏ những quả chết.
- Sau 72h trứng được chuyển sang tủ lạnh 4oC và để qua đêm.
Hình 2.1. Hình ảnh về quá trình đánh dấu vị trí tiêm
Hình 2.2. Hình ảnh về quá trình đục lỗ điểm tiêm
Hình 2.3. Hình ảnh về quá trình tiêm chủng vào dịch niệu đệm của trứng
Hình 2.4. Hình ảnh về quá trình hàn điểm tiêm bằng parafin
Thu gặt dịch virus
- Cắt vỏ trứng tại vùng buồng khí
- Dùng pipette Pasteur hút dịch niệu trong từng trứng.
- Cho dịch niệu vào 1 tube vô khuẩn đặt trong đá.
- Cứ thực hiện tuần tự như vậy cho đến hết số lượng trứng đã gây nhiễm (chú ý: mỗi trứng được gặt bằng 1 pipette riêng, và được đặt trong một tube riêng).
- Kiểm tra dịch trứng: thể tích, cảm quan, tính vô khuẩn, tạp nhiễm Mycoplasma, hiệu giá ngưng kết hồng cầu (HA), hiệu giá chủng (EID50)
Hình 2.5. Hình ảnh về quá trình cắt vỏ trứng tại vùng buồng khí
Hình 2.6. Hình ảnh về quá trình dùng pipette Pasteur hút dịch niệu trong từng trứng
Hình 2.7. Hình ảnh về quá trình cho dịch niệu vào 1 tube vô khuẩn
Hình 2.8. Hình ảnh về quá trình cho dịch niệu vào tube cryo bảo quản đông băng
Sơ đồ nhân tạo chủng WSL
Hình 2.9. Sơ đồ nhân tạo chủng WSL
Chủng gốc NIBRG-14 Trứng gà sạch có phôi 9-11 ngày tuổi
Cấy chủng Ủ 33.50C/72h Gặt chủng Pha chế Kiểm tra: - Tính vô trùng - Hiệu giá HA
- Hiệu giá chủng EID50 - Tạp nhiễm Mycoplasma
Phân ống
Chủng sản xuất (bảo quản -800C) (Working Seed Lot)
Kiểm tra chủng WSL bao gồm: - Hiệu giá ngưng kết hồng cầu - Tính vô trùng
2.4.2. Phương pháp kiểm tra chất lượng
2.4.2.1. Xác định liều gây nhiễm EID50
Nguyên tắc:
Virus cúm có khả năng sống và nhân lên trong dịch niệu của trứng gà có phôi và sự hiện diện của virus cho phản ứng ngưng kết hồng cầu dương tính.
Cách thực hiện:
- Pha loãng chủng trong dung dịch PBS 0,01M vô trùng, pH: 7 - 7,2 thành 10 độ pha từ 10-1 đến 10-10. Mỗi độ pha tiêm 10 trứng của trứng gà có phôi 10 ngày tuổi, mỗi trứng 0,2 ml vào khoang niệu. Sau khi tiêm, trứng được hàn kín bằng parafin lỏng và ấp tiếp trong tủ ấm 33,50C, có độ ẩm 60-70%. Sau 24h và 48h trứng được soi để loại bỏ những quả chết. Sau 72h trứng được chuyển sang tủ lạnh 40C để qua đêm. Thu hoạch dịch niệu từ mỗi quả trứng riêng rẽ và xác định khả năng nhân lên của virus trong mỗi trứng bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.
- Cho 50 µl PBS 0,01M + BSA 0,5% vào tất cả các giếng
- Thêm 50 µl dung dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng
- Thêm 50 µl của dịch niệu nang gặt từ trứng vào các giếng của phiến
- Lắc đều trong 1 phút
- Đậy nắp phiến
- Đặt phiến ở nhiệt độ phòng tại nơi yên tĩnh, tránh rung lắc
- Đọc kết quả sau 30 phút cho đến 4h
Kết quả EID50 của chủng giống được xác định bằng phương pháp Reed- Muench.
Bảng 2.1. Cách tính EID50 của liều gây nhiễm
Tỷ lệ nhiễm Tích lũy Tổng tích lũy
Độ pha Log độ pha Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Số % 104 4 10 0 22 0 22 100 105 5 8 2 12 2 14 86 106 6 4 6 4 8 12 33 107 7 0 10 0 18 18 0 108 8 0 10 0 28 28 0
Theo bảng EID50 của 0,1 ml của chủng WSL hay MSL nằm giữa 10-5 và 10-6. EID50 được tính như sau:
Log 50% = log độ pha loãng cao nhất ↑ 50% dương tính + khoảng cách * log 10
Khoảng cách = Log 50% = 5+ * log 10 Log 50%= 5+ 0,7 50% = 105,7 EID50 (0,1 ml) = 105,7 EID50 (ml) = 106,7
2.4.2.2. Xác định hiệu giá HA (Haemaagglutinin: phản ứng ngưng kết hồng cầu)
Nguyên tắc phản ứng:
Kháng nguyên cần xác định hiệu giá được pha loãng bậc 2 thành các độ pha khác nhau trên phiến nhựa 96 giếng, đáy chữ U hoặc V. Sau đó bổ sung dung dịch hồng cầu gà 1%. Nếu trong giếng có kháng nguyên hemagglutinin sẽ ngưng kết hồng cầu và không cho hồng cầu lắng xuống đáy giếng tạo thành hình dù ở đáy giếng. Ngược lại, nếu không bị kháng nguyên gây ngưng kết, hồng cầu sẽ lắng xuống đáy giếng tạo một chấm nhỏ màu đỏ.
Các bước tiến hành:
- Xác định vị trí của chứng Hồng cầu, chứng kháng nguyên.
- Cho 50 µl của mỗi mẫu thử hoặc chứng dương vào mỗi giếng của 2 giếng đầu tiên liên tiếp theo hàng ngang hay hàng dọc tùy theo ước lượng mẫu có hiệu giá cao hay thấp.
- Pha loãng mẫu thử và chứng dương theo bậc 2. Loại 50 µl của hàng (hay cột) cuối cùng của dãy pha loãng,
- Cho 50 µl dung dịch hồng cầu gà 1% trong PBS 0,01M + 0,5% BSA vào tất cả các giếng.
- Lắc nhẹ phiến trong vòng 1 phút.
- Đậy nắp phiến.
- Đặt phiến ở nhiệt độ phòng tại nơi yên tĩnh, tránh rung lắc.
- Đọc kết quả sau 30 phút cho đến 4 giờ.
Pha loãng
bậc 2 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Giếng đối chứng
A=1/10 B= 1/20 C= 1/40 D= 1/80 Chứng hồng cầu E= 1/160 F= 1/320 G= 1/640 H= 1/1280 Chứng kháng nguyên
Hình 2.10. Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu
Kết quả và cách tính kết quả:
Dựng thành phiến lên theo chiều đứng, giữ trong 5-10 phút đợi cho chứng âm hoặc chứng hồng cầu chảy xuống thành giếng hoàn toàn. Đặt phiến trên gương để đọc
kết quả. Kết quả dương tính khi hồng cầu bị ngưng kết không chảy xuống thành giếng khi dựng phiến theo chiều đứng.
- Hiệu giá ngưng kết hồng cầu là độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên mà vẫn còn gây ngưng kết hồng cầu. Giá trị nghịch đảo của độ pha loãng là hiệu giá ngưng kết của kháng nguyên được tính bằng 1 đơn vị HA.
- Ví dụ: Kháng nguyên dùng trong phản ứng được pha loãng từ 1/10 đến 1/2560, độ pha loãng cho phản ứng (+) là 1/128 thì kháng nguyên đó có 128 đơn vị HA.
* Đọc kết quả:
- Điều kiện để thử nghiệm có giá trị tin cậy:
- Chứng dương: phải gây ngưng kết hồng cầu đúng theo đơn vị kháng nguyên đã biết trước.
- Chứng âm: không có hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu.
- Chứng hồng cầu: không có hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu
2.4.2.3. Kiểm tra vô trùng
- Thử bằng phương pháp cấy trực tiếp mẫu thử vào 2 loại môi trường Thioglycolate và Tryp Soyabean Broth (TSB).
- Ủ môi trường Thioglycolate ở 30 – 330C và TSB ở 22 – 250C. Thời gian theo dõi là 14 ngày.